陈治[1]2000年在《血管内皮生长因子及受体在大肠肿瘤血管靶向治疗中的应用研究》文中研究说明研究背景：肿瘤的生长和转移与肿瘤区的血管密切相关，近年来肿瘤血管靶向治疗的研究日趋活跃，VEGF作为作用最强、特异性最高的血管形成因子之一，日益成为研究的热点，以VEGF及VEGFR作为靶点已有许多成功的实验报道，但VEGF和VEGFR作为靶点何者更为有效，目前尚无相关文献报道。 研究目的：探讨VEGF及其受体KDR在实体瘤中的表达差异，观察并比较抗VEGF抗体及抗KDR抗体对人脐静脉内皮细胞及人大肠癌LoVo细胞的生长抑制作用，为确定以VEGF为靶点的抗肿瘤形成策略与以VEGFR为靶点的抗肿瘤形成策略何者更为有效提供依据。 研究方法：利用免疫组化SABC法，以邻片双标记技术对80例人大肠癌组织中的VEGF及KDR的定位与分布进行研究，并通过图像分析系统进行原位定量分析，比较二者的表达量。另将不同浓度的抗VEGF抗体及抗KDR抗体分别加入人脐静脉内皮细胞及LoVo细胞的培养液中，通过MTT法检测培养细胞的活性，计算细胞生长抑制率，进而比较两种抗体对脐静脉内皮细胞及LoVo细胞的作用效果。 研究结果：①VEGF染色阳性物质主要位于肿瘤细胞胞膜及胞浆，KDR染色阳性物质主要位于癌组织及癌组织旁的血管内皮细胞上，VEGF的表达量明显高于KDR的表达量（P＜0.01），大肠癌组织中VEGF和KDR的表达阳性率显著高于正常对照组织（P＜0.01），VEGF和KDR的表达与肿瘤的分化 第一军医大学97硕士生毕业论文 程度及Dukes分期密切相关（P＜0．05卜 与病理分型无关（P＞ 0．05人②抗 VEGF 抗体可明显抑制 LOVo细胞的生长（P t 0刀1）；对脐静脉内皮细胞的生长也有一定抑制作用，但无统计 学意义（P＞o．05）；抗KDR抗体对L。Vo细胞及脐静脉内皮细 胞的生长均有显著性抑制作用（P＜0．of 卜 相同浓度条件下，抗 KDR抗体的抑制作用较抗VEGF抗体更为明显（P＜0刀5）。 研究结论：①VEGF主要表达于大肠癌细胞中，在肿瘤血管 内皮细胞中无表达；KDR主要表达于肿瘤血管内皮细胞，部分 大肠癌细胞中亦有较弱表达，这表明VEGF 主要是通过旁分泌 作用机制诱导肿瘤血管形成，从而促进肿瘤细胞的生长，同时可 能作为一种自分泌生长调节因子直接促进肿瘤细胞的生长。② VEGF和KDR的表达与大肠癌的分化程度和Dukes分期密切相 关，随着肿瘤恶性程度的增加及肿瘤的生长、侵润和转移，VEGF 和KDR的阳性表达率差异显著，提示VEGF和KDR的表达可 反应肿瘤的恶性程度和进展情况，有望作为判断肿瘤预后的指 标。③作为一种可分泌的蛋白，VEGF主要分布于肿瘤细胞中， 而KDR主要位于血管内皮细胞上，这样药物入血后可直接作用 于KDR，而作用于VEGF则需穿透血管；而且，虽然二者在恶 性肿瘤中都有表达，但KDR相比VEGF的表达量明显为低，使 用较小的药量（如抗体）作用于KDR就能达到更好的治疗效果。 故以VEGFR为靶点的抗肿瘤形成治疗策略可能比以VEGF为 靶点的抗肿瘤形成治疗策略为优。
林荣凯[2]2005年在《双自杀基因重组腺病毒靶向治疗大肠癌的体外实验研究》文中提出研究背景 在世界范围内,大肠癌的发病率居恶性肿瘤的第三位。它恶性程度高,进展快,转移早。如何有效治疗大肠癌,抑制转移,是目前肿瘤基因治疗的一个难点。在众多治疗方法中,自杀基因治疗是其中研究较多的领域。自杀基因(suicide gene),又称为前药敏感基因(prodrug sensitive genes),是病毒和细菌等原核生物含有的一类基因,其编码的酶能将原来无毒的或微毒的药物前体转化成具有细胞毒性的代谢物进而杀伤宿主细胞。如TK基因通过编码生成的胸苷激酶特异地将核苷类似药物前体(GCV)磷酸化,进而在细胞内代谢成三磷酸丙氧鸟苷,后者抑制细胞DNA聚合酶的功能或竞争性的渗入细胞DNA,使其合成终止,导致细胞死亡;CD基因则通过编码胞嘧啶脱氨酶将无毒的前体药物5-FC代谢成抗DNA合成的化疗药5-FU从而杀伤细胞。该疗法不但能直接杀伤转基因的肿瘤细胞,还可利用其独特的“旁观者效应”杀伤周围大量未转基因的瘤细胞,具有先转染后治疗、可靶向作用、可诱导免疫等优点,使该治疗方法在肿瘤的基因治疗中具有独特的优势。但同时,目的基因转导率低、反复治疗后肿瘤细胞具有抗药性和类型不同的肿瘤细胞各自敏感的自杀基因治疗系统不同等缺点严重影响了自杀基因治疗的应用效果。如何采取更有效的自杀基因
胡薇[3]2006年在《逆转录病毒载体介导的胸苷激酶靶向治疗肿瘤的研究》文中指出癌症是一种死亡率极高,发病率逐年递增的疾病。由于传统化疗、放疗、手术疗法的效果仍不够理想而且副作用较大,基因治疗作为一种新型的治疗手段正日益受到重视。人的端粒酶催化亚单位(Human telomerase catalytic subunite,hTERT)是端粒酶的核心成分,是迄今发现的一个最为广泛的肿瘤新标志物。在生理条件下,正常人细胞大都没有hTERT活性;而在85%～90%左右的人肿瘤细胞中hTERT活性较高,并且其活性高低与肿瘤的恶性程度相关,这预示着端粒酶可以作为肿瘤基因治疗的理想靶点。 本实验克隆了端粒酶催化亚单位核心启动子(hTERT)和血管内皮生长因子增强子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及治疗基因胸苷激酶(Thymidine Kinase,TK),构建复合转录调控序列[VEGF]hTERT。并利用绿色荧光蛋白表达载体对[VEGF]hTERT复合转录调控序列的转录活性进行了初步的鉴定。结果表明,复合转录调控序列[VEGF]hTERT能启动绿色荧光蛋白在肺癌细胞A549内正确表达,而在人的正常肝细胞内不表达,在低氧诱导情况下,VEGF增强子能够提高hTERT核心启动子的转录活性。分别构建由复合转录调控序列[VEGF]hTERT和hTERT核心启动子调控的胸苷激酶重组逆转录病毒载体,G418筛选携带该载体的包装细胞,并进一步感染人肺癌细胞A549。结果显示,肺癌细胞A549的增殖皆受到抑制,细胞早期凋亡率和细胞周期均发生一定程度的改变,尤其是在低氧的条件下,肿瘤细胞受到抑制的程度更为明显。本实验首次进行在低氧条件下由复合转录调控序列调控治疗基因在肿瘤细胞内表达及抑制肿瘤效果方面的研究。
苏毅[4]2009年在《融合蛋白（CREKA）_3-tTF选择性诱发肿瘤组织血管栓》文中研究表明利用靶向性血栓药物对实体瘤血管的选择性栓塞是一种新颖的抗肿瘤策略。该策略以截短的组织因子(truncated Tissue Factor,tTF)为效应因子,结合肿瘤血管靶向载体实现选择性诱发肿瘤组织血管栓塞,阻断肿瘤营养物质和氧气的供给,引发肿瘤缺血性坏死,达到抗肿瘤作用。这种策略需要靶向至肿瘤血管的载体。CREKA五肽能够特异性结合肿瘤血管中的凝血血浆蛋白,具有良好的肿瘤血管靶向作用,是一个理想的载体。我们通过构建CREKA与tTF融合蛋白来探讨这种融合蛋白是否能够选择性诱发肿瘤组织血管栓塞从而达到抗肿瘤作用。首先运用生物信息学的方法对两者构成的融合蛋白进行分子模拟,从理论上选定最优的融合蛋白构建模式。随后,利用PCR技术构建了含有CREKA和tTF的融合基因,并将其克隆入pET22b(+)中。通过大肠杆菌表达(CREKA)_3-tTF融合蛋白,并经镍亲和层析柱,及梯度透析复性获得纯的融合蛋白。然后,利用凝血时间,FX活化和结合荧光定量测定等实验在体外初步探讨了该融合蛋白的活性。RBITC荧光标记融合蛋白,利用活体成像仪观察荧光标记融合蛋白在S180移植瘤的小鼠模型的分布,组织切片法结合共聚焦荧光显微镜分析融合蛋白的组织定位。用融合蛋白治疗S180移植瘤的小鼠模型,组织切片法分析融合蛋白对肿瘤组织血管的栓塞作用。依据分子模型结果选定CREKA与tTF的组成模式为(CREKA)_3-G_4S-tTF。PCR技术构建融合基因,测序验证获得正确重组载体,并成功表达于E.coilBL21。凝血时间测定和FX活化实验证实融合蛋白具有凝血活性,荧光定量实验证实融合蛋白能够与凝血血浆蛋白结合。活体成像显示融合蛋白主要分布于肿瘤组织中,组织切片的荧光定位证实融合蛋白定位于肿瘤组织血管内。融合蛋白治疗组小鼠的病理组织切片中观察到肿瘤组织部分血管血栓栓塞,而在其他正常组织上未观察到血管血栓。在S180移植瘤的小鼠模型治疗中,该融合蛋白能够地抑制S180肿瘤生长。上述实验结果表明(CREKA)_3-tTF融合蛋白是一种肿瘤血管靶向性的血栓蛋白,能够选择性诱导肿瘤血管血栓,并产生一定的抗肿瘤作用。
柳溪林[5]2018年在《靶向MC1R重组毒素高效表达纯化、抗黑色素瘤活性及相关靶向信号分析》文中指出恶性黑色素瘤(MM)是始发于黑色素细胞的高度恶性肿瘤,特点为快速发生,易发生远处转移,预后差,是欧美浅肤色人种等国家皮肤癌死亡的首要原因。最常见的亚洲人群原发皮肤黑色素瘤主要为肢端黑色素瘤,约占全部黑色素瘤50%左右,上肢主要在手指末端及甲下,下肢主要在足趾和足底等部位。据统计,世界黑色素瘤每年的发病率以3%~8%的比例增多;黑色素瘤在我国发病率虽然在肿瘤中的比重较小,但总体为上升趋势,新发病例每年约有2万例,也是严重影响我国人民的生命健康病种之一,因此,对于晚期或扩散性黑色素瘤的针对性治疗和早期诊断显得尤为关键。目前治疗黑色素瘤的最佳手段仍是以手术为主,但术后仍有复发和转移的风险。在一些黑色素瘤晚期或不宜手术的患者,选择其他适宜的治疗方式十分必要;由于黑色素瘤对放射、化学疗法不敏感,使这些疗法的临床有效治疗率低,不能够有效延长患者的生存率,而且这些治疗方法对患者的免疫系统损伤较重。生物免疫治疗如黑色素瘤疫苗等,多数还处于研发或临床试验阶段,远期治疗效果还需进一步研究。近些年,靶向治疗开辟了肿瘤治疗的新方向,并有望成为黑色素瘤治疗的主导方法。对于黑色素瘤诊断包括查体、活检、影像学检查及实验室检查等,但目前仍无特异的肿瘤标志物,使其精确诊断受到了一定的限制。靶向药物无论在临床试验还是未来临床治疗中都需要靶向诊断方法进行病例筛选,只有确定适用病例后治疗才有意义。靶向诊断方法的建立首先就要获得靶向标志物。本研究以促黑色素细胞激素(α-MSH)作为引导结构与已经优化了密码子的绿脓杆菌外毒素蛋白相结合,成功构建一种高表达、特异性强的靶向MC1R(Melanocortin 1 Receptor)的重组毒素,并进行了基因工程菌株发酵与纯化研究;通过细胞毒性试验及动物模型试验来分析重组毒素的成药性评价,分析不同细胞MC1R的表达量及其与重组毒素有效性之间的关系,为重组毒素在临床上准确治疗及个体化治疗提供指导。通过生物信息学预测并证明了TCEAL7与miRNA-758的表达关系密切,同时通过调节TCEAL7来研究miRNA-758与黑色素瘤潜在联系,也证明了TCEAL7在黑色素瘤发生发展中起着重要作用,miR-758/TCEAL7可能作为黑色素瘤新诊断的标志物和治疗靶点。为了进一步获得更高表达量的重组毒素以便于能够工业化生产,我们将实验室保存的PE40毒素氨基酸序列,截短降低免疫原性,通过基因修饰将PE毒素羧基端的REDLK转变为KDEL多肽序列,增加活性。通过生物软件的分析及PE优化大肠杆菌嗜好密码子,合成PE38KDEL,以柔性linker将其与a-MSH基因连接,获得新构建的a-MSH-PE38_(KDEL)基因克隆。将重组毒素基因转入pET-30a载体,重组质粒pET-30a/a-MSH-PE38_(KDEL)载体成功构建,通过测序验证序列。将重组质粒转化到Rosseta(DE3)感受态受体菌株中,经卡那霉素抗性筛选后,以PCR及DNA测序验证。对鉴定阳性克隆菌株保种后以LB培养基发酵、IPTG诱导,经电泳基因水平分析和蛋白水平鉴定表达产物,层析扫描确定a-MSH-PE38_(KDEL)重组蛋白的表达量占全菌总蛋白的35%以上。利用Western blot对超声破碎后菌体进行分析,证明融合蛋白以有活性的可溶性表达产物、不直接表现活性的包涵体表达产物两种形式存在。对重组蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)的可溶性表达采取粗略纯化与精细纯化相结合的工艺方式进行纯化。首先采用盐析法的硫酸铵沉淀法初步去除大部分杂质,再以疏水层析及离子交换层析对重组蛋白沉淀物进行精细纯化,最后以凝胶过滤层析法脱盐和纯化,并对饱和硫酸铵沉淀和层析条件进行优化。对于重组蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)包涵体采取复性方式纯化,对包涵体进行反复的变性、复性,对复性产物进行亲和层析。从纯化结果看,这两种纯化方式终纯度都较高,均可满足后续实验要求。以细胞杀伤活性分析重组毒素a-MSH-PE38_(KDEL)对MC1R受体结合竞争情况;流式细胞仪分析重组毒素是否能够诱发细胞凋亡;选取人A375细胞、鼠黑色素瘤细胞B16-F10进行体外生物活性实验,因为这些细胞高表达MC1R;并以低表达MC1R的人正常肝细胞LO2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人胆囊癌细胞GBC-SD、人胃癌细胞BGC-823作对照,验证重组毒素的靶向杀伤作用。实验结果证明a-MSH-PE38_(KDEL)确实是通过与MC1R结合后发挥毒性作用的,而其发挥毒性作用的机制之一就是内化进入肿瘤细胞内后诱导细胞凋亡。与目前上市的多数靶向药物对肿瘤细胞信号干扰等相比,本实验中的重组毒素针对的是肿瘤细胞表面受体标志,不易受到其他因素干扰,其效果可能要优于信号干扰药物。a-MSH-PE38_(KDEL)对人正常肝脏细胞L02无杀伤作用,对黑色素瘤细胞A375及B16-F10细胞的杀伤率为93%。进一步分析a-MSH-PE38_(KDEL)重组毒素的体内抗肿瘤活性,采取皮下接种B16-F10细胞悬液建立BALB/c鼠黑色素瘤模型,并用a-MSH-PE38_(KDEL)对荷瘤小鼠进行治疗,分析重组毒素的抑瘤效果、毒副作用以及获得安全性评价等。重组毒素治疗分高、中、低三组,治疗组BALB/c鼠的肿瘤生长缓慢、未发现转移;而其中以高剂量组治疗效果更为明显,肿瘤消失率为58.3%;长期给予高剂量重组毒素治疗后(50天),治疗组7只BALB/c鼠中有4只肿瘤完全消失。组织病理及电镜结果显示a-MSH-PE38_(KDEL)对BALB/c鼠无明显的毒副作用。MC1R在肿瘤细胞与正常细胞和组织中的分布差异表明其有可能作为检测或靶向治疗的靶标,我们初步建立了一种MC1R的检测方法。分别利用蛋白免疫印迹法和荧光定量PCR法对不同细胞表面上的MC1R定量检测,分析样本中MC1R的含量与a-MSH-PE38_(KDEL)有效性之间的关系。检测的12种细胞中,验证了B16-F10细胞中MC1R mRNA的高表达量,发现人结直肠癌细胞HT29和人食管癌细胞eca-109中MC1R mRNA的表达量较黑色素瘤细胞B16-F10要高3-5倍,HCT-116(人结直肠癌细胞)与B16-F10细胞的mRNA表达量接近,并且荧光定量PCR与蛋白免疫印迹法检测结果基本一致。说明a-MSH-PE38_(KDEL)除了MM细胞外可能具有更强的新的潜在肿瘤靶点。在很多肿瘤中能够见到人转录延长因子A(SII)-样7(TCEAL7)的异位表达,其中包括恶性黑色素瘤,但其功能并不明确。本实验通过Western blot和qPCR方法证明了TCEAL7在黑色素瘤组织及细胞系A375和WM-115中表达量较低;通过慢病毒感染上调了TCEAL7在A375和WM-115细胞系中的表达量;转染siRNA-TCEAL7下调TCEAL7的表达,CCK-8检测法来评估TCEAL7对黑色素瘤生长的影响;流式细胞仪来检测TCEAL7在细胞凋亡过程中的作用。结果表明下调TCEAL7表达量可促进细胞增殖、肿瘤发生及抑制黑色素瘤凋亡。4周龄雌性BALB/c裸鼠,分别在裸鼠背侧皮下注射含有1×10~7转染siRNA和慢病毒感染后的A375和WM-115细胞。结果显示上调TCEAL7的表达量会抑制肿瘤的发生,下调时则会促进其生长。根据生物信息学分析结果表明miRNA-758的表达量与TCEAL7关系密切,通过qPCR证明转染mimics-miR-758的黑色素瘤细胞A375和WM-115中miRNA-758过表达,而Western blot却显示TCEAL7为低表达;双荧光素酶报告基因实验结果表明,在黑色素瘤A375和WM-115细胞上调表达miR-758后,TCEAL7的转录活性受到抑制。进一步分析了miR-758的异位表达在恶性黑色素瘤发展中的作用。WM-115和A375细胞转染mimics-miR-758的CCK-8检测结果显示,该基因能够促进细胞增殖能力;而基于mimics-miR-758过表达TCEAL7时,对细胞增殖的作用被削弱了。并且,当WM-115和A375细胞转染mimics-miR-758后,细胞凋亡被抑制;而基于mimics-miR-758过表达TCEAL7时,这种被过表达miR-758诱导的促细胞凋亡作用亦被抑制。上述结果表明,TCEAL7为黑色素瘤的一种抑癌基因,可抑制黑色素瘤的发生发展;miRNA-758为TCEAL7的上游调控因子,可通过下调TCEAL7表达水平,来发挥促癌作用。总之,本试验通过PE40密码子优化,将基因工程菌株目的蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)的表达量从出发株原来的10%提高到现在的35%~40%;确定了实验室规模的a-MSH-PE38_(KDEL)可溶性和包涵体表达产物的纯化工艺,获得纯度超过95%以上的重组毒素产品;通过细胞水平试验明确靶向肿瘤细胞系,同时确定了使用剂量,为动物试验提供基础数据;通过黑色素瘤动物模型治疗试验明确了靶向黑色素瘤的强效杀伤作用,重组毒素能够快速消除鼠体内的黑色素瘤,临床观察、病理组织学切片和电子显微镜超微结构观察未见明显异常,证明其安全性好,是一种非常有前景的黑色素瘤的候选靶向药物;明显优于达卡巴嗪和顺铂化疗药治疗效果,观察到化疗药物治疗组中存在超微结构病理变化;细胞靶向筛选中发现了重组毒素的新肿瘤靶标:人结肠癌细胞系HT29和人食管癌细胞eca-109,而且靶向杀伤作用比黑色素瘤细胞B16-F10还要强几倍;通过黑色素瘤临床样本分析,认为miR-758/TCEAL7可能作为一个新的潜在诊断标志物和治疗靶标。希望本实验的结果能为未来的临床试验及黑色素瘤个性化治疗提供一定的参考。
邰建东[6]2007年在《大肠癌基因表达分析及应用siRNA-c-myc和siRNA-VEGF进行分子靶向治疗的实验研究》文中提出目的:筛选适合大肠癌早期诊断的异常表达基因;研究利用siRNA-c-Myc和siRNA-VEGF进行分子靶向治疗大肠癌的效果。方法:RT-PCR及Western blot方法对各期大肠癌标本进行基因表达分析,筛选并鉴定适合大肠癌早期诊断的异常表达基因;基因重组技术构建psilencerTM U6-siRNA-c-Myc和psilencerTM U6-siRNA-VEGF表达质粒,应用真核细胞转染技术转染大肠癌细胞株VoLo进行体外研究;RT-PCR和Western blot方法鉴定靶基因沉默的效果;MTT方法、流式细胞技术和TUNEL实验检测细胞增殖能力及凋亡特性的改变;应用Boyden小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变。结果:(1)RT-PCR结果显示:c-Myc、AKT和VEGF在大肠癌早期即出现异常表达,且表达显著增加(P<0.05);Western blot方法证明c-Myc和VEGF蛋白在大肠癌组织中表达增加,且增加程度与Dukes分期正相关。(2)成功构建psilencerTM U6-siRNA-c-Myc和psilencerTM U6-siRNA-VEGF质粒。(3)质粒转染大肠癌细胞株VoLo后,靶基因c-Myc和VEGF分别被沉默。(4)体外实验证明应用siRNA-c-Myc和siRNA-VEGF抑制了大肠癌细胞的增殖活性,诱导细胞出现凋亡,同时肿瘤细胞的侵袭特性降低。结论:联合应用c-Myc、AKT和VEGF三种基因,可作为早期诊断大肠癌的分子标志。构建真核表达质粒,在细胞内表达siRNA-c-Myc和siRNA-VEGF,作为分子靶向治疗大肠癌的新的手段,具有良好的应用前景。本实验通过系统分析临床大肠癌肿瘤标本的基因表达水平,筛选出适合早期诊断大肠癌的分子标志;同时针对筛选出的分子标志(c-Myc和VEGF),应用RNAi技术,对大肠癌细胞进行分子靶向治疗。如此系列的研究在国内、外均未见报道。
汤金乐[7]2016年在《基于CD7纳米抗体的新型免疫毒素对人白血病细胞在体外和体内的活性研究》文中研究表明在过去的几十年里,白血病和淋巴瘤的临床治疗取得了很大的进展。然而在T细胞白血病和淋巴瘤中,仅仅只有一小部分的T急性淋巴细胞白血病(T-ALL)或者外周T细胞淋巴瘤(PTCL)病人获得了长期无肿瘤生存。常规的细胞毒疗法(化疗或者放疗等)对病人具有副反应且疗效有限。众所周知,当白血病或者淋巴瘤患者一旦对化疗产生耐药或者出现复发,临床治疗手段将会变得十分有限,病人的生存期也随之变得很短。因此高效的、能够避免多药耐药性机制,而且对治疗人T细胞恶性肿瘤具有良好特异性和毒性的新疗法是具有十分重要的科学和临床意义。在新的治疗药物开发中,由毒素和肿瘤细胞特异性的抗体片段或者配体等融合构成的重组免疫毒素被认为对化疗耐药性的T细胞疾病是仍然有效的。运用免疫毒素的一个关键要素就是选择肿瘤细胞适合的靶点。许多研究已经表明CD7分子在大多数T细胞淋巴瘤和白血病细胞表面表达,而在一小部分正常T淋巴细胞上缺失。CD7分子作为治疗靶点的另外一个优势就是当它和抗体或者抗体衍生物结合后会迅速内化,这使得针对CD7分子的抗体非常适合作为药物运输工具。由于上述优点,多种CD7特异性的免疫毒素被制备出来并检测它们的抗白血病效应。然而,大多数的研究主要集中在植物毒素,如蓖麻毒素,皂草素及其衍生物,这些毒素由于缺乏足够的安全和疗效而未获得临床批准。另一种免疫毒素,截短形式的铜绿假单胞菌外毒素A(ETA或PE38)融合到CD7的单链抗体片段(scFv),被报道可造成约20%原代白血病细胞死亡,但是却没有进一步评估其体内抗白血病效应,这意味着T细胞白血病细胞可能对PE38不敏感或者报道的CD7单链抗体需要进一步的改进。事实上,由PE38构成的抗CD22免疫毒素在用于毛细胞白血病患者的临床试验中表现出令人印象深刻治疗效应,达到了46%的完全缓解,而且无明显的剂量限制性毒性,这表明PE38至少对一些淋巴细胞是敏感的。因此,新的抗CD7抗体或者可变区片段有可能为我们提高针对T细胞淋巴瘤和白血病免疫毒素功效提供新的选择。纳米抗体被选择成为我们要开发的新型抗CD7抗体的原因如下:纳米抗体是由casterman等人首先发现的一种单域抗体,来自骆驼重链抗体的重链可变区,具有诸多杰出的理化性质,这使它们成为了靶向递送生物活性药物的优秀候选者。研究人员已经证明纳米抗体可以与毒素以及其他功能性分子偶联,然后用这些偶联物去靶向细胞,对癌症和其他疾病进行治疗。目的:筛选cd7特异性的纳米抗体,构建新型的基于cd7纳米抗体和pe38的免疫毒素,在体外检测这些免疫毒素对t-all细胞系、t-all病人和aml病人原代细胞的效应,最后在体内评估它们抗白血病的作用。方法:用cd7阳性的jurkat细胞免疫骆驼,提取免疫后的骆驼外周血淋巴细胞,构建纳米抗体噬菌体文库,用生物淘洗的方法筛选获得抗cd7的纳米抗体。通过流式细胞分析仪检测纳米抗体vhh6、免疫毒素pg001(vhh6-pe38)和pg002(dvhh6-pe38)的特异性和亲和力。在体外通过检测蛋白质合成抑制和凋亡的方法来测定纳米抗体免疫毒素pg001和pg002对人cd7阳性的jurkat、cem和cd7阴性的rpmi8226、h460细胞系的细胞毒作用。通过annexinv和7-aad染色检测pg001和pg002对白血病患者原代细胞的细胞毒效应。pg001和pg002在体内的抗肿瘤潜力采用cem细胞异种移植肿瘤模型进行评估。结果:我们成功鉴定了具有高特异性和亲和力(~15nm)的cd7纳米抗体——vhh6。基于vhh6的单价免疫毒素(pg001)和双价免疫毒素(pg002)对cd7阳性细胞保持有高度的特异性,亲和力分别约为16nm和4nm。这两种毒素高效地以抗原依赖型的方式促进cd7阳性白血病细胞系jurkat和cem发生凋亡,但是对cd7阴性的人多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226和人肺癌细胞系h460增殖的几乎没有影响。特别需要指出的是,免疫毒素pg002对jurkat、cem细胞的半有效浓度分别为30pm和23pm,这提示pg002治疗cd7阳性白血病具有很大的潜力。此外,pg002在单剂量为100ng/ml浓度条件下能有效介导新鲜收集的t-all和aml患者原代细胞凋亡。在异种移植肿瘤模型中,pg001和pg002能够抑制cem细胞的增殖,并可显著延长小鼠的生存期。其中,pg002相比于pg001在肿瘤模型中的治疗效果更为突出。结论:我们构建的单价(pg001)和双价(pg002)cd7纳米抗体免疫毒素以抗原特异性的方式,以及在低浓度条件下即可有效杀伤cd7阳性t-all细胞系和新鲜t-all和aml病人来源的细胞。基于免疫毒素pg001和pg002有效杀死白血病细胞,可显著延长异种移植肿瘤小鼠的生存,PG001和PG002值得进一步开展临床前和临床试验研究,从而进一步评价它们抗白血病的潜能。
陈海金[8]2007年在《慢病毒介导的双自杀基因靶向治疗大肠癌的实验研究》文中认为研究背景我国大肠癌发病率从20年前的十万分之十上升到了今天的十万分之三十,在大城市恶性肿瘤的排名中大肠癌从第六位上升至第二位。大肠癌发病率正以4%的年增长率迅速上升,但治愈率却没有得到根本改变。传统的治疗方法有其自身的局限性,因此寻找新的疗法迫在眉睫。肿瘤自杀基因疗法是近年来肿瘤基因治疗中一个重要的研究策略,尤其是自杀基因的选择与重组,载体系统的优化,基因的靶向性转移表达,以及自杀基因的联合治疗等均有助于提高自杀基因特异性表达,增强杀伤肿瘤细胞的作用。肿瘤自杀基因治疗是将自杀基因导入肿瘤靶细胞并使之表达,基因编码的酶将无毒的药物前体转化为具有细胞毒性的代谢物,从而诱导靶细胞产生自杀作用,杀伤肿瘤细胞,同时还通过旁观者作用杀伤邻近未转染的肿瘤细胞。目前研究最多的且被美国FDA批准应用于临床试验的自杀基因系统主要有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷系统(HSV-TK/GCV)和胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统(CD/5-FC)。此两系统的抗肿瘤效能已在多种肿瘤的体内外实验中得到证实。日本、荷兰、墨西哥等地的学者已开始进行HSV-TK基因治疗前列腺癌的临床试验。目前的临床试验认为,针对人前列腺癌的原位基因治疗安全而有效,具有良好的抗癌生物学活性。鉴于不同类型肿瘤细胞对自杀基因系统的敏感性不同、单一自杀基因系统治疗时部分肿瘤细胞易产生耐药以及CD/5-FC和HSV-TK/GCV系统的作用机理具有很强的互补性,联合应用此两系统不仅可以提高肿瘤细胞杀伤作用,改善治疗效果,而且可以扩大肿瘤治疗谱,减少耐药现象发生。众所周知,肿瘤的自杀基因治疗虽已成为基因治疗中研究热点之一,但目的基因的靶向性及基因转移的低效率是这一疗法广泛开展的主要障碍。实验研究中大多使用逆转录病毒载体和腺病毒载体进行基因转染治疗,与其它几种常用的病毒载体相比较,逆转录病毒载体病毒滴度低,只能感染分裂期细胞,容纳外源基因的DNA片段长度不超过8 kb。而腺病毒载体感染细胞时,病毒DNA游离在细胞核内,并不整合到染色体上,在体内不能实现稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应,因而在应用上这两种病毒载体都受到一定的限制。慢病毒载体最大的特点是可以感染分裂期及非分裂期细胞,容纳外源性目的基因的片段大,可以在体内长期地表达,免疫反应小,安全性较好,可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒,已成为当前基因治疗中载体研究的热点。同时,如能使自杀基因选择性地作用于目的肿瘤细胞而不在正常细胞中表达,将能使该治疗策略更加完善。既往研究利用肿瘤特异性基因调控元件调控自杀基因表达,如以erbB-2、α-人乳白蛋白(hALA)启动子驱动自杀基因进行乳腺癌基因治疗,甲胎蛋白(AFP)基因启动子用于肝癌自杀基因疗法,癌胚抗原(CEA)基因启动子用于肠道肿瘤自杀基因疗法等。上述治疗方案中,每一特异启动子仅能进行针对某一类型肿瘤细胞靶向基因治疗,而绝大多数恶性实体瘤的生物学特性为生长迅速,致使其滋养血管不能及时供应所有肿瘤细胞,该特点使前体药物难以接近所有肿瘤细胞。选择一合适启动子既靶向肿瘤血管内皮细胞,又靶向肿瘤细胞,如此既可杀伤肿瘤细胞,又可靶向破坏肿瘤滋养血管使得其灌流区大量肿瘤细胞缺血性坏死,这样即高效放大了自杀基因的疗效。大量研究证明,KDR在正常人体组织中呈低水平表达,而在绝大多数肿瘤中呈现高表达,且KDR不仅表达于血管内皮细胞,还表达于肿瘤细胞,其表达水平与血管内皮细胞更新速度及肿瘤恶性程度呈正相关。它不仅促进血管内皮细胞分裂、增殖,且诱导肿瘤血管增生,并促使肿瘤细胞生长转移。在肿瘤组织内KDR表达明显高于正常内皮细胞,血管的发生对于肿瘤的生长和转移起着关键的作用。因此,将KDR作为靶点,可为治疗和诊断肿瘤提供了新的理论依据。国内外众多作者报道,KDR在在胃癌、结肠、直肠、卵巢、乳腺癌等多数肿瘤组织中的表达明显增高,并与其生物学行为相关,并伴随肿瘤分级的上升而表达增强。基于上述研究,为弥补单自杀基因的不足、克服以往启动子仅适用于某一肿瘤细胞的缺点、并利用慢病毒载体的优势,本课题设计思路如下:应用慢病毒载体构建KDR启动子驱动的CD/TK融合基因的重组慢病毒,感染血管内皮细胞ECV304及大肠癌细胞LOVO,观察该治疗系统的体外杀伤作用,为重组慢病毒介导KDR启动子驱动的CD/TK融合基因靶向治疗大肠癌的进一步研究提供依据。注:本课题来源于:广东省自然科学基金重点项目(013072)。目的研究慢病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用,并为进一步研究奠定基础。首先利用FUGW慢病毒载体构建携带KDR启动子调控的双自杀基因重组慢病毒,将所构建的重组慢病毒感染LOVO细胞和ECV304细胞,测定感染效率,检测转基因的表达,对转基因细胞施以前药(5-FC和/或GCV),观察转基因细胞对前药的敏感性。最后,以LOVO细胞株建立裸鼠皮下移植瘤动物模型,观察该治疗体系的体内抑瘤效应。方法一、重组慢病毒的构建将FUGW慢病毒载体酶切去掉Ubiqutin启动子,应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,亚克隆入中间载体pcDNA3,构建pcDNA3-KDRP-CD/TK,然后酶切KDRP-CD/TK片断,插入到FGW中,构建KDR启动子调控下的CD/TK融合基因慢病毒重组质粒FGW-KDRP-CD/TK。重组质粒在2937细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,通过荧光显微镜下293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达观察重组病毒的包装与复制,并以PCR方法鉴定重组慢病毒。二、慢病毒介导的FGW-KDRP-CD/TK融合基因系统对LOVO细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用用重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK感染LOVO细胞、ECV304细胞及LS174T细胞(对照),检测目的基因的表达。在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韦(GCV)作用下,测定肿瘤细胞的存活率,观察旁观者效应,并分别通过流式细胞仪、透射电镜观察细胞凋亡与坏死。三、慢病毒介导FGW-KDRP-CD/TK融合基因系统对大肠癌LOVO细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应采用BALB/C雌性裸鼠,4～6周龄,对数生长期的LOVO细胞接种于裸鼠左侧腋窝皮下,建立大肠癌动物模型,当肿瘤直径达0.5cm时,将荷瘤裸鼠随机分为Ⅰ组:注射重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK与前药5-FC与GCV;Ⅱ组:仅注射前药5-FC与GCV;Ⅲ组:仅注射重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK;Ⅳ组:空白对照,不施加任何处理。每5d测量肿瘤生长状况,估算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,25天治疗结束后处死裸鼠,称瘤重,计算肿瘤生长抑制率并观察该治疗体系的体内抑瘤效应,行组织内CD/TK基因表达的检测、肿瘤组织常规病理检查,并观察重要脏器心、肝、脾、肺、肾有无病理变化。结果一、重组慢病毒质粒的鉴定1.重组慢病毒质粒FGW-KDRP-CD/TK的鉴定在重组慢病毒质粒FGW-KDRP-CD/TK的构建过程中,主要采用酶切和测序的方法进行鉴定。将PCR所得的CD片段、TK片段及KDR分别连于T载体(pMD18-T)送上海申友生物技术有限公司测序,结果正确。FGW-KDRP-CD/TK以HindⅢ和BamHI酶切后电泳出现大小约2.4kb(CDglyTK)片段,结果正确。2.重组慢病毒质粒在293T细胞的包装及滴度测定将10μg的转移载体,7.5μg的CMV△R8.2包装质粒,5μg的VSV-G包膜质粒,加入130μL的2mol/L CaCL_2中,磷酸钙法三质粒瞬时共转染293T细胞,24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达,72h后收集上清,0.45μm滤器过滤,25000rpm离心90min,沉淀溶于Hanks溶液,-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液,加入293T细胞中,72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况,计数发荧光细胞数目,根据病毒用量和稀释度计算滴度。二、慢病毒介导的FGW-KDRP-CD/TK融合基因系统对LOVO细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.重组慢病毒体外感染及鉴定细胞LOVO、ECV304、LS174T分别加入200μl的重组慢病毒悬液(100MOI)培养72小时后,在荧光显微境下观察GFP基因的表达,可见80-90%有绿色荧光存在,三种细胞具有相似的感染率。通过RT-PCR检测发现,除LS174T细胞外,LOVO、ECV304细胞检测有目的基因的表达。2.重组慢病毒对各细胞的体外抑制效应将200μl的重组慢病毒悬液(100MOI)感染各细胞株,加入不同浓度的前药培养72h后MTT法检测细胞生长抑制率。结果:感染慢病毒FGW-KDRP-CD/TK的LOVO及ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,转基因细胞的存活率随前药浓度的增加而递减。当前药浓度为GCV=100mg/L,5-FC=160mg/L时,LOVO存活率为(5.40±1.85)%,ECV304存活率为(5.26±1.82)%。而感染慢病毒的LS174T细胞对前药不敏感,LS174T存活率仍有(95.02±2.82)%,与其他各组细胞相比差异有显著性意义(F=6567.806,P＜0.001)。感染FGW-KDRP-CD/TK的LOVO、ECV304及LS174T细胞,单用浓度100mg/L的GCV时,生存率分别为(31.96±1.62)%、(29.10±2.86)%、(96.57±1.89)%,单用浓度为160mg/L的5-FC,生存率分别为(29.60±1.91)%、(25.23±2.05)%、(96.20±1.91)%,二者联合时,各细胞生存率分别为(5.40±1.85)%、(5.26±1.82)%、(95.02±2.82)%,提示联合用药比单一用药对LOVO细胞和ECV304细胞均有较强杀伤效应(F=803.123,P＜0.001;F=375.99,P＜0.001;F=1.555,P=0.226)。3、旁观者效应将感染慢病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应,其随转基因细胞所占比例的增加而明显增强。当转基因细胞的比率为40%时,LOVO和ECV304细胞分别有(32.40±1.29)%、(29.95±1.96)%的存活,而LS174T细胞存活率仍在(97.74±1.74)%,三者比较差异均有显著性意义(F=5180.938,P＜0.001)。4、重组慢病毒对LOVO细胞及ECV304细胞凋亡的影响转基因LOVO细胞给以前药(GCV:1mg/L;5-FC:40mg/L)处理24h后,流式细胞仪检测发现:治疗组LOVO细胞加药24h后凋亡率为27.09±1.45%,明显高于对照组凋亡率2.96±0.34%(P=0.007)。转基因ECV304细胞给以前药(GCV:1mg/L;5-FC:40mg/L)处理24h后,流式细胞仪检测发现:治疗组ECV304细胞加药24h后凋亡率为10.85±1.50%,明显高于对照组凋亡率2.25±0.55%(P=0.035)。5、前药处理前后LOVO细胞的电镜观察透射电镜下见部分细胞出现细胞体收缩、染色质边聚,有的胞核形态不规则,核发生碎裂,胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片,有的可见凋亡小体、(或整个凋亡细胞)被吞噬和降解的现象。部分细胞出现细胞器溶解等坏死征象。三、慢病毒介导的FGW-KDRP-CD/TK自杀基因系统对大肠癌LOVO细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应1.荷瘤裸鼠肿瘤生长情况接种肿瘤细胞后10d左右,出现皮下肿瘤结节。裸鼠成瘤达0.5cm后开始治疗,治疗结束时肿瘤标本的称重结果及抑瘤率:Ⅰ组:(21.34±5.72)mg,95.59%:Ⅱ组:(466.61±67.89)mg,3。58%;Ⅲ组:(451.91±48.29)mg,6.61%;Ⅳ组:空白对照组(483.91±51.60)mg。可见,组间瘤重有显著性差异(F=165.805,P＜0.001),Ⅰ组明显缩小,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长情况无统计学意义。2.肿瘤病理变化及肿瘤组织目的基因表达的检测前药加慢病毒治疗组肿瘤组织切片中可见片状坏死区,而且这些区域可见大量炎性细胞浸润。RT-PCR检测发现重组慢病毒转基因荷瘤动物肿瘤组织内有CD/TK融合基因表达。3.治疗后裸鼠重要脏器的组织学观察为了解该治疗系统对裸鼠有无毒副作用,取治疗组小裸鼠心、肝、脾、肺、肾行常规病理检查未见明显异常。4.裸鼠可视化大肠癌动物模型成功的建立了大肠癌裸鼠皮下移植瘤可视化动物模型,LT-9MACIMSYSPULS整体荧光成像系统下,可满意观察到GFP绿色荧光,其优点:①早期发现肿瘤形成;②动态观察肿瘤生长及转移情况等。结论1.本实验首先以慢病毒为载体,成功地构建含KDR启动子驱动的CD/TK自杀基因系统的重组慢病毒,重组慢病毒的滴度达6×10~(10)pfu/ml;2.重组慢病毒对LOVO细胞、ECV304细胞及LS174T细胞均具有较高的转染率,且对三者转染率相似;3.重组慢病毒能将KDR启动子驱动的CD/TK融合基因转入LOVO细胞及ECV304细胞中并进行有效表达,使该系统对LOVO细胞及ECV304细胞具有满意的靶向杀伤作用,这种杀伤作用具有浓度依赖性,并且联合应用两种前药较单用一种前药更为有效;4.该治疗体系的作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应,表现为处理后靶细胞的凋亡及坏死;5.应用LOVO细胞可成功建立大肠癌移植瘤裸鼠普通动物模型及可视化动物模型,并能方便地检测肿瘤的生长、转移;6.重组慢病毒转基因荷瘤动物肿瘤组织内可表达CD/TK融合基因产物,使该治疗体系具有满意的体内抑瘤效应,表现为肿瘤的生长抑制及肿瘤组织坏死;7.KDR启动子驱动的CD/TK融合基因系统治疗后,荷瘤裸鼠心、脾、肝、肺、肾等器官无明显组织学变化,提示该系统对荷瘤裸鼠无系统毒副作用。
朱文赫[9]2011年在《重组导向毒素DLM表达、抗肿瘤活性及作用机制的初步研究》文中认为导向毒素具有特异性结合、杀伤肿瘤细胞的特性。但是,目前研究的许多导向毒素在实际应用过程中却表现出抗肿瘤疗效差,非特异性毒性强的问题。为开发高特异性低毒的导向毒素,本研究以蛇毒去整合素作为导向毒素的载体,以对细胞具有杀伤作用的蜂毒肽作为导向毒素的弹头,通过维持蛋白质结构功能的连接肽和释放毒素分子的uPA切割序列作为接头,设计出重组导向毒素DLM(蛇毒去整合素-接头-蜂毒肽,Disintegrin-linker-melittin, DLM)。首先采用大肠杆菌原核表达系统对其进行表达,得到了少量的DLM蛋白。为了进一步提高DLM的产量,我们构建了毕赤酵母真核表达载体,并筛选出能够稳定、高效分泌表达DLM蛋白的毕赤酵母工程菌。通过SDS-PAGE、Western Blot、质谱测定相对分子量等手段,证明了DLM通过毕赤酵母表达系统成功分泌表达。利100 L用发酵罐进行DLM中试规模发酵,并摸索其纯化工艺,最终DLM的产量达到198.4 mg/L。通过体外酶解实验,证实了重组蛋白DLM的uPA接头的可切割性。进行了DLM溶血实验及对人胚肾细胞抑制作用实验。结果显示DLM几乎无溶血活性,对人胚肾细胞无明显的抑制作用。利用光镜、荧光显微镜、DNA电泳、流式细胞仪技术,观察了DLM对乳腺癌细胞MCF-7的形态、超微结构、生长、基因组DNA等指标的影响,初步探讨出其作用机制。本研究的创新之处在于：①首次以蛇毒去整合素作为导向载体,针对肿瘤细胞表面特异性受体αvβ3设计高特异性的导向毒素；②首次以uPA切割序列作为导向毒素的接头,通过肿瘤细胞表面uPA对接头的切割作用,释放毒素分子；③通过uPA对接头的切割作用,将弹头分子蜂毒肽释放于肿瘤细胞表面,通过裂解细胞膜发挥其对细胞的杀伤作用。
隋臻[10]2012年在《人Kallistatin和sTRAIL融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性研究》文中进行了进一步梳理肿瘤是当今对人类健康危害最大的疾病之一，肿瘤患者死亡率非常高。传统治疗方法首选的是手术，对于不适合进行手术的患者则采用放疗、化疗或者两者结合的治疗方法，然而传统疗法“敌我不分”，这一弊端在治疗肿瘤的同时给患者带来极大的痛苦。近年来随着生物学相关学科的发展，一些新的肿瘤治疗理念和方法逐渐被提出，例如基因治疗、免疫治疗、靶向治疗、诱导凋亡治疗和抗血管治疗等，这些生物治疗肿瘤的方法在一定程度上解决了传统疗法靶向性差、副作用大的缺点，在临床上可以较好的缓解肿瘤患者的痛苦。本着肿瘤生物治疗多靶点、多途径、多信号通路的理念，在本论文中我们选取了眼下肿瘤治疗领域研究比较热门的两个蛋白质：重组人Kallistatin和sTRAIL。Kallistatin是一种内源性蛋白，由401个氨基酸组成，分子量为58KD。大量研究表明，Kallistatin能够抑制血管的生成、细胞的增殖和迁移，具有广谱抗肿瘤活性。sTRAIL是TRAIL胞外区（114-281个氨基酸残基）形成的可溶型多肽，同样具有完整TRAIL的生物学活性，能特异性地与TRAIL的天然受体结合，并激活信号传导途径，诱导细胞凋亡，sTRAIL具有靶向诱导肿瘤细胞凋亡的作用。国内外尚未有关于Kallistatin和sTRAIL（KT）两者融合蛋白的报道，因此我们通过基因工程的方法构建表达了两者的融合蛋白KT。另外，目前重组蛋白药物已经广泛应用于临床，技术比较成熟。课题组前期实验表明用原核工程菌表达这两种蛋白存在易产生包涵体、蛋白活性低和表达效率差的缺点，而真核表达系统能很好的解决这些问题，因此我们采用毕赤酵母GS115真核表达系统来表达该融合蛋白。首先我们通过设计合适的引物构建了pPIC9-Kallistatin-sTRAIL真核表达载体，然后将其电转化到GS115中，用5L发酵罐进行中试规模发酵，发酵液依次通过Phenyl sepharoseTM6Fast Flow、Sephadex G-25和Heparin Sepharose CL-6B凝胶柱进行纯化。SDS-PAGE电泳显示纯化后的蛋白中杂蛋白很少。采用ELISA法对纯化得到的蛋白定性和定量，浓度可达0.672mg/ml。值得指出的是在构建KT蛋白时，我们引入了RGD肽（含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的短肽）来连接两个蛋白，蛋白序列为：GGGGSG-RGD-SGGGGS，此短肽能被整合素和某些配体的识别位点识别，而肿瘤细胞和新生血管可以选择性的表达某些整合素（如αvβ3或αvβ5），因而能以一定的亲和力和RGD肽结合，这也使KT蛋白从一定程度上具有肿瘤和新生血管靶向性的特点。针对Kallistatin抗血管和抗细胞增殖和迁移的活性，我们分别设计了体外抗小管实验、体外抑制HUVEC、Hela和NCI-H446细胞增殖实验和抑制HUVEC迁移实验。结果显示，20μg/ml的KT蛋白即能较明显的抑制HUVEC生成小管；KT蛋白对HUVEC、Hela和NCI-H446细胞增殖的有效抑制浓度分别是16μg/ml、32μg/ml和16μg/ml，抑制率分别是17.80%、33.14%和22.21%；13.5μg/ml的KT蛋白即能较明显抑制HUVEC的迁移。针对sTRAL诱导肿瘤细胞凋亡的活性，我们用Hela和NCI-H446两种肿瘤细胞来检测KT蛋白的这一活性。结果显示，对经过KT蛋白诱导48h的两种肿瘤细胞进行Hoechst染色，均发现一定的凋亡现象。初步的药效试验显示，我们构建的KT融合蛋白具有Kallistatin和sTRAIL的双重活性，这为将来重组蛋白应用的进一步探索和肿瘤多靶点、靶向性治疗提供了一定的理论依据。
参考文献：
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[2]. 双自杀基因重组腺病毒靶向治疗大肠癌的体外实验研究[D]. 林荣凯. 第一军医大学. 2005
[3]. 逆转录病毒载体介导的胸苷激酶靶向治疗肿瘤的研究[D]. 胡薇. 吉林大学. 2006
[4]. 融合蛋白（CREKA）_3-tTF选择性诱发肿瘤组织血管栓[D]. 苏毅. 厦门大学. 2009
[5]. 靶向MC1R重组毒素高效表达纯化、抗黑色素瘤活性及相关靶向信号分析[D]. 柳溪林. 吉林大学. 2018
[6]. 大肠癌基因表达分析及应用siRNA-c-myc和siRNA-VEGF进行分子靶向治疗的实验研究[D]. 邰建东. 吉林大学. 2007
[7]. 基于CD7纳米抗体的新型免疫毒素对人白血病细胞在体外和体内的活性研究[D]. 汤金乐. 苏州大学. 2016
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[9]. 重组导向毒素DLM表达、抗肿瘤活性及作用机制的初步研究[D]. 朱文赫. 吉林大学. 2011
[10]. 人Kallistatin和sTRAIL融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性研究[D]. 隋臻. 华侨大学. 2012
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