张腾霄[1]2008年在《吩噻嗪光敏剂修饰磁性微粒的制备及其在病毒灭活中的应用》文中提出本文研究了表面修饰有环氧乙烷基和羧基的功能化磁粒的制备,将对血液或血液制品中的HIV、HBV及HCV等病毒有很强的光诱导灭活作用的吩噻嗪类染料,如天青A和天青B,通过化学反应共价偶联到硅烷化的磁粒上的几种方法,制备了既可灭活血液或血液制品中的病毒、又可以用磁性分离方式将其彻底去除的血液净化材料。该材料应用于几种血液样品中指示病毒PRV的灭活,建立了用CPE实验结合Reed-Muench法评价其灭活病毒的效率的方法,鉴定了所合成的光敏剂修饰磁性微粒的光诱导的病毒灭活活性。材料合成部分中,首先用化学共沉淀法制备Fe_3O_4磁流体,磁流体经硅烷化修饰分别得到表面羧基化和环氧化的磁性载体。羧基化磁粒用EDC或DCC活化剂介导酰胺缩合反应将AA或AB固定;环氧化磁粒用采用金属叁氟化物催化、离子超声催化和碱催化等3种方法,催化环氧乙烷基和芳香胺的开环加成反应,从而将AA或AB固定。初步比较各种方法,发现碱催化的方法使光敏剂偶联量效果最好,然后进一步对碱催化的合成方法优化以提高偶联量。用优化的合成方法制备该材料,并检测批内和批间差异,考察了偶联量的稳定性。UV-Vis分光光度法测定AA和AB的偶联量分别达到50nmol/mg和37 nmol/mg。研究了光敏剂的吸光度与溶液酸碱度的关系,为用盐酸溶解磁粒分光光度法测定偶联量提供了指导。研究了AA和AB的碱性稳定性,得到两者氧化分解的pH上限值分别为11.5和12.0,为合成体系优化中pH值的确定提供了指导。以DPCI为单线态氧捕捉剂,用氧化-萃取光度法测定单线态氧产率,来分析磁粒的光敏剂的偶联量,鉴定了光敏剂修饰磁粒的光敏活性。选用PRV为指示病毒,从光照时间、光敏剂修饰磁粒用量等影响光化学效应的主要因素入手,优化了光化学灭活病毒的体系,并应用于血浆、血红蛋白溶液及人血液代用品(聚合猪血红蛋白)中指示病毒的光化学灭活。结果显示该磁性材料灭活效果优良,能使被试样品中病毒滴度下降达4个LgTCID_(50)以上。光敏剂修饰磁粒把磁性微粒的优良生物相容性、磁场中的易分离性与吩噻嗪光敏剂灭活病毒的高效性相结合,将很可能是用于血液净化的新型材料。
倪小菊[2]2007年在《亚甲蓝光化学法灭活血浆中丙型肝炎病毒的分子生物学机理》文中研究表明输血是现代医学不可或缺的重要支撑手段，但输血也存在一定的风险，特别是经输血传播HIV、HBV、HCV等病毒感染的风险。输血相关病毒感染因其涉及面广且预后不良，具有较大的社会负面影响。克服病毒性输血风险，保障输血安全已成为医学界乃至全社会关注的焦点。由于血液制品病毒标记物检测在方法学上的局限性以及病毒窗口期的存在，目前还不能万无一失地剔除携带病毒的血液或血液成分制品，因此仅依赖血液筛查的手段不能完全杜绝通过输血传播病毒的风险。以阻断病毒通过输血途径传播为目的的血液成分病毒灭活技术被认为是提高输血安全性的一道重要的屏障。对血液成分病毒灭活方法及其机理的研究是输血医学研究的热点之一。亚甲蓝光化学方法(methylene blue photochemistry，MB-P)目前已成功应用于临床用单袋血浆的病毒灭活，其有效性和安全性已被充分验证，但该方法灭活病毒的分子生物学机理尚不十分明了，与此有关的研究还在继续深入之中。阐明亚甲蓝光化学法病毒灭活的机理将有助方法学的改进，并为其它病原体灭活方法的研究提供理论参照。本研究选择丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)作为MB-P病毒灭活机理研究的实验对象，主要是因为HCV是我国输血后感染的最主要病原体之一，在影响输血安全的诸因素中占有较大的权重，且该病毒的感染活性目前尚无法用体外细胞培养的方法或除黑猩猩之外的动物模型感染方法予以验证，证实MB-P方法对HCV的灭活的效果，具有十分重要现实意义。同时HCV作为脂质包膜RNA病毒，可较贴切地阐明MB-P对此类病毒的灭活的机理，有助于体现相应的理论参考价值。本研究运用PCR和荧光定量PCR技术对MB-P处理后HCV RNA的降解情况进行了研究，并对HCV RNA的降解与HCV RNA结构变化之间的关系进行了初步的探讨。本实验室的前期研究表明MB-P处理能引起HCV NS_5基因区段的降解。在此基础上，针对全长HCV基因组序列，本题选择了一段相对保守的长度为844bp的5’-NCR(5'-non-coding region)及相邻的核心区(core region，C区)基因片断，以及一段长度为973bp的NS_2基因片断作为研究对象。通过MB-P处理前后不同时间点留样，对这两个区段RNA进行RT-PCR检测及荧光定量PCR检测。结果表明：在MB-P处理早期，血浆中的HCVRNA迅速降解，在处理20分钟内从5.5×10~5copies/ml降低到8.2×10~3copies/ml，而在处理后期降解趋势逐渐缓慢，在处理60分钟后可检测到的核酸量降低到2.8×10~3copies/ml。整个过程中HCV RNA以对数模式降解。实验结果验证了病毒核酸是MB-P灭活的靶目标之一。为了揭示除核酸以外的病毒构件及病毒蛋白成分在MB-P灭活过程中的作用，本研究设计了体外转录HCV RNA的灭活实验。构建了分别插入HCV 5’-NCR和C区基因、NS_2基因片断的2个重组质粒，鉴定后进行体外转录试验。将体外转录的HCV RNA分别用代血浆(羟乙基淀粉20—氯化钠注射液，HES20)和PBS缓冲液稀释至与血浆所含病毒相近的浓度(≥10~5copies)，在无除核酸以外的病毒构件及病毒蛋白成分的条件下进行与前述实验条件相同的MB-P处理。结果发现，体外转录HCV RNA在MB-P处理下依然能发生降解，在处理20分钟内可检测到的核酸量从3.2×10~5copies/ml降低到6.2×10~4copies/ml，处理60分钟后降低至2.0×10~4copies/ml，表明MB-P方法能直接作用于核酸，使核酸发生降解从而达到病毒灭活的目的。同时，血浆中病毒的核酸降解速率明显快于HES20和PBS中的体外转录HCV RNA，提示除核酸以外的某些病毒构件或蛋白可能会影响MB-P对HCV RNA的作用效率，相关的研究尚有待进一步展开。实验研究首次证实MB-P能有效降解HCV-RNA 5’-NCR+C区及NS_2区基因片断，表明：1)亚甲蓝能直接作用于病毒核酸，在光照条件下降解病毒核酸使病毒灭活；2)MB-P处理下，HCV RNA的浓度呈对数形式下降；3)该方法对体外转录HCV-RNA的降解效率相对低于对血浆中HCV-RNA的降解效率。
王淑英[3]2012年在《通用型病毒灭活血浆制备方法研究》文中进行了进一步梳理目的为平战时大批量应用血浆救治患者和伤员赢得时间，研究通用血浆的混合比例及病毒灭活条件，降低血浆中抗血型抗体IgM的效价及灭活经输血传播的相关病毒。方法1.先将A型血浆与B型血浆1:1混合，根据抗体效价变化趋势确定比例方向及最佳比例。用同样的方法确定A型血浆与AB型血浆和B型血浆与AB型血浆的最佳比例。2.用正交设计分析不同血型的血浆比例（根据1中得出的结果）、反应温度（4℃、22℃、37℃）和反应时间（1h、3h、5h）叁种因素对混合后血浆中抗血型抗体效价的影响，确定最佳生产方案。对最佳生产方案进行验证。3.病毒灭活条件的研究选择HBV的模拟病毒PRV为指示病毒，病毒培养及毒力测定用其敏感细胞PK-15，病毒滴度用TCID50表示。选择核黄素结合紫外线照射的光化学法灭活病毒，通过研究紫外线波长、核黄素浓度、核黄素与病毒作用时间对病毒灭活效果的影响，初步确定病毒灭活的方案。4.病毒灭活过程对血浆质量的影响根据病毒灭活效果，选择能够灭活4lgTCID50/0.1ml PRV的照射时间，测定处理前后血浆中VIII因子和AT-III活性及Fg浓度的变化，观察病毒灭活过程对血浆质量的影响。结果1.A型血浆与B型血浆、A型血浆与AB型血浆、B型血浆与AB型血浆的最佳混合比例分别是3：1、1：2、1：3。2.经正交设计得出的最佳生产条件为A:B:AB=6:2.5:1.5，反应时间1h，反应温度22℃，进行叁次验证试验，抗AIgM和抗BIgM的效价均≤1:2。3.核黄素光化学法灭活病毒的紫外线有效波长为365nm+308nm，核黄素浓度为60μmol/L，核黄素与病毒作用时间为10min。照射20min时可灭活约4lgTCID50/0.1ml的PRV。4.紫外线照射20min时，血浆中VIII因子、Fg和AT-III损伤较多，需重复测定或调整病毒灭活方案。结论1.通用型血浆制备时各血型血浆的最佳比例是A:B:AB=6:2.5:1.5，抗血型抗体IgM的效价≤1:2低于国外现有的两种通用型血浆的抗体效价，为国内生产通用血浆提供了实验依据。2.核黄素光化学病毒灭活法在20min内能够有效地灭活脂包膜病毒PRV，病毒灭活动力学显示其灭活速率先快后慢，符合《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》。
黄宇闻, 程庆文, 莫琴, 谢如锋, 钱开诚[4]2000年在《荧光与亚甲蓝联用对血浆中病毒灭活的研究》文中研究表明以细胞感染试验、凝血法、交叉免疫电泳等技术 ,观察荧光与亚甲蓝联用对血浆中水泡性口炎病毒 (VSV)和辛德比斯病毒 (SV)的灭活效果及血浆蛋白的变化。结果 ,向盛装在聚氯乙烯袋内的血浆中加 1μmol/L亚甲蓝并经荧光 (30 0 0 0Lux)照射 30min ,可将血浆中滴度 >7TCID50 (lg)的VSV和SV灭活。消毒后 ,血浆中的Ⅷ :C、Ⅸ :C、纤维蛋白原的回收率 >75% ,白蛋白、球蛋白的回收率 >85% ,蛋白免疫原性无变化
皇甫超济[5]2017年在《Ⅰ.高纯α2-巨球蛋白的规模化制备及其重要生物学功能研究 Ⅱ.六种近交系小鼠动脉粥样硬化易感性差异分析及动脉粥样硬化易感基因Rcn2的鉴定》文中研究指明α2-巨球蛋白(α2-Macroglobulin,α2-M)是一种大分子糖蛋白,其主要存在于血浆中,属于巨球蛋白超家族的一员。α2-M是由4个相同的单体组成的同源四聚体,每个单体均含有五个功能区域,这决定了其特性及生物学功能。α2-M能够广泛的参与机体的生理及病理活动,其最基本的功能是作为广谱的蛋白酶抑制剂清除内源性及外源性蛋白酶。有研究表明α2-M具有一定抗辐射作用,在治疗放射性肺炎、膀胱炎及其他放射性皮肤黏膜溃疡时效果良好。α2-M还能够与一些重要的细胞因子结合并调节其生物活性。除此之外,α2-M还能够抑制肿瘤及参与凝血平衡并作为诊断或预测某些疾病的生物标记物。对于α2-M一些生物特性及制备工艺研究的深入将有助于推进α2-M在临床治疗的应用。可用于制备α2-M的原料血浆是非常有限的,尤其是在发展中国家。当前血浆主要用于制备免疫球蛋白、白蛋白和凝血因子,直接以血浆为原料制备α2-M则并不现实。Cohn组分IV(Cohn Fraction IV,Cohn F IV)是基于乙醇沉淀的Cohn氏分离过程中一个副产物,但其中富含大量的α2-M。因此以Cohn F IV作为原料纯化制备α2-M能够起到综合利用血浆的目的。基于上述背景,本研究主要分为以下四个方面。(1)α2-M实验室制备工艺的建立α2-M的活性测定在纯化制备过程中是必不可少的质控指标。作为一种蛋白酶抑制剂,α2-M能够与蛋白酶相互作用形成“α2-M-蛋白酶复合物”。与其他蛋白酶抑制剂不同,α2-M并不会破坏蛋白酶的活性位点。因此与α2-M结合的蛋白酶并没有失活,而仅仅是由于空间屏障作用,失去了与大分子底物作用的机会。BAPNA是一种小分子底物,能够穿过空间屏障与蛋白酶的活性位点相互作用。通过检测410 nm吸光值可以从侧面考察与α2-M结合的蛋白酶量。在测活的反应体系中,胰蛋白酶、BAPNA、大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitor,SBTI)的量需要首先被确定。此外还需要建立α2-M标准曲线。通过这种发色底物的原理建立了α2-M活性测定方法。关于从Cohn F IV纯化制备PC、Tf、AAT的研究已经有所报道。尽管α2-M在Cohn F IV中含量很大,但是并没有关于将其从Cohn F IV分离纯化的研究报道。之前关于α2-M纯化制备的研究主要是综合利用凝胶过滤、免疫吸附层析、Cibacron蓝色琼脂糖层析等方法。本研究中通过二维电泳的方法初步考察了Cohn F IV的蛋白组成。尝试了盐析法、Capto TM Core 700层析介质、Aerosil 380、Planova TM 35N滤器在α2-M纯化方面的效果。由于α2-M是一个大分子的锌离子结合蛋白,因此我们采用了锌离子亲和层析、凝胶过滤的方法纯化α2-M。经过蓝色琼脂糖亲和层析后,最终获得了纯度98%的α2-M,工艺的活性回收率在48%左右。利用质谱的方法定性鉴定了终产品,考察了不同温度、p H、不同浓度甲胺对α2-M活性的影响,这为α2-M纯化及保存过程避免活性损失提供了帮助。实验结果显示在温度高于50℃、p H高于9.0、p H小于4.0及甲胺存在的条件下,α2-M的活性很容易损失。(2)从Cohn F IV中规模化制备高纯α2-M关于α2-M纯化制备的报道有很多,但是可能存在的一些问题会制约这些制备工艺的进一步应用。1.几乎所有的纯化方法使用的纯化原料均为人血浆,但当前以血浆作为原料制备α2-M是不现实的。2.有些纯化工艺不能同时取得高纯的α2-M及较高的回收率。免疫吸附虽然是一个很有效的方法,但是应用于工业生产的成本较高。3.很少有关于α2-M大规模制备的工艺报道。虽然利凡诺法曾经被报道可用于α2-M规模化制备,但是20世纪90年代中国政府禁止了利凡诺用于人血液制品的制备。4.很多报道的工艺要求血浆中Hp的类型为1-1型,而该Hp型人群的比例仅为14.5%。本研究中的纯化工艺基于盐析法、锌离子亲和层析、超滤法,以Cohn F IV为原料获得了高纯的α2-M。通过质谱分析及氨基酸组成分析证实,获得的终产品为α2-M。据我们所知,这应该是首先从Cohn F IV分离纯化α2-M的研究。从Cohn F IV制备α2-M提高了血浆利用率,并且本方法无需要求血浆中Hp的类型。经过叁批次规模化制备,获得了280瓶α2-M(40 mg/瓶)。终产品的纯度为94.9%,比活为26.7μg/mg,工艺平均收率为20.5%。根据叁批次产品质量,初步建立了α2-M质量标准,纯度、比活等核心指标被重新设定。制备工艺中使用的锌离子亲和层析介质价格便宜、线性流速快、抗压,这有利于规模化生产。(3)α2-M纯化制备工艺中病毒灭活方法的优化之前关于使用不安全血浆来源的血浆蛋白制品感染HIV、HBV、HCV等病毒的事件是有所报道的。即使现在病毒灭活/去除工艺已经极大提高了病毒安全性,使用人血来源的血液制品时仍然存在感染血源性病原体的风险。巴氏灭活、干热、电离辐射、S/D法、层析法等灭活/去除病毒的方法已经被报道用于血浆蛋白制品的制备工艺中。本研究选取了不同理化性质的病毒,考察巴氏灭活、干热、电离辐射、S/D法、层析法在α2-M工艺中病毒灭活/去除的效果。优化了巴氏灭活、干热、电离辐射过程中的保护剂。实验结果显示无保护剂时巴氏灭活和干热法能够有效的灭活有囊膜病毒和无囊膜病毒。25 k Gy剂量辐照能够将指示病毒完全灭活,但有将近40%α2-M活性受到损失。S/D法可以有效的灭活有囊膜病毒,层析法也能够一定程度当去除病毒。血液制品病毒灭活要求工艺中至少有两种互补的病毒灭活方法。根据我们的研究结果,在今后的进一步应用中从巴氏灭活、干热法、S/D法中选择两种灭活方法是十分必要的。本研究为今后α2-M工业制备中病毒灭活方法的选择奠定基础。(4)α2-M重要生物学功能的研究有报道称α2-M对辐射引发的皮肤和粘膜溃疡、放射性肺炎、放射性膀胱炎、角膜炎和角膜溃疡治疗效果良好。鉴于上述研究基础,我们选择了α2-M作用受体较多的L-929细胞开展研究。考察了α2-M对辐射后L-929细胞增殖、活性氧产生和细胞凋亡的影响。将α2-M用于经受7.25、8.00 Gy照射后的小鼠,并考察小鼠存活和体重变化。此外我们研究了α2-M对红细胞保存的影响,检测了血常规、血气、晶体渗透压、游离血红蛋白等指标。研究显示α2-M能够显着提高L-929细胞的增殖、降低其活性氧产生及抑制细胞凋亡,这些结果能够一定程度的解释α2-M的抗辐射作用。然而经过α2-M治疗后,并没有对照射后小鼠的体重恢复、存活率带来积极作用。经过α2-M孵育后红细胞溶血情况比较严重,因此α2-M并没有表现出较好的红细胞保存作用,相关方面的研究正在进行中。动脉粥样硬化是缺血性心脏病、中风、外周动脉疾病和慢性肾脏病等疾病的一个主要诱发因素。迄今缺血性心脏病和中风仍然是世界上引起死亡人数最多的两种疾病。过去叁十年来,通过有效的预防、具有降脂效果的他汀类药物和血管成形术的治疗,动脉粥样硬化等冠状动脉心脏病的死亡率已经有所下降,但死于这种疾病人数仍然远超其他疾病。发展中国家动脉粥样硬化心血管疾病的发病率正在迅速增加,以至于每年花费在该病预防治疗方面的费用超过了癌症、慢性阻塞性肺病和糖尿病等其他一些主要引起死亡的疾病。目前,对于动脉粥样硬化的治疗主要是结合药物和手术综合治疗。使用的药物主要是具有减轻高脂血症、降血压或预防血栓形成并发症效果的他汀类药物、烟酸、阿司匹林、β-受体阻断剂或血管紧张素转化酶抑制剂。血管成形术/支架术和冠状动脉搭桥手术也常结合药物治疗动脉粥样硬化。血管内支架置入以防止收缩性血管重塑已经成功地在一定程度上减少血管手术后再狭窄的发生率,但是手术后3至6个月内患者发生动脉晚期再狭窄的概率仍然高达30%至50%,且这些患者发生严重急性心血管事件的风险仍然非常高。新生内膜增生是动脉粥样硬化和支架术后再狭窄的一个主要病理过程。一种可能的机制表明新生内膜来源于从中膜向内膜异常增殖和迁移的平滑肌细胞。受机械损伤后内皮发生变性并释放细胞因子,这些释放的细胞因子会激活平滑肌细胞并促进其增殖和迁移。血管成形术均会损伤内皮,但并非所有接受手术的患者都会发生血管再狭窄。因此,一些其它因素对手术后血管再狭窄的发生发挥重要作用。最近的一些研究指出血管狭窄可能受到遗传因素的影响。目前新生内膜病变的发生发展是否也受遗传因素的影响尚未在载脂蛋白E敲除小鼠品系中开展研究。Rcn2是一种新的细胞因子表达调节因子,其是否为动脉粥样硬化易感基因也不得而知。氯化钾和性别对心脏性疾病的发生发展有一定影响,至于其对动脉粥样硬化的作用尚不得而知。基于上述背景,本研究分为以下叁章。(1)六种不同品系小鼠载脂蛋白E敲除后动脉粥样硬化易感性差异及机制研究颈动脉的血管重塑是许多心血管疾病如动脉粥样硬化和高血压的重要病理过程。在颈总动脉分叉附近结扎后造成的颈总动脉重塑的模型常被用于血管重塑的研究。在本研究中,将这种动脉重塑模型应用于六种不同的近交系小鼠。在新生内膜形成,管腔面积增加及血管壁肥大等方面观察到了显着的差异。除C3H外,其他5种品系小鼠的结扎侧颈总动脉呈现出正向重塑,与对侧管腔面积相比,B6、BAL SM F1、SWR、BALB、SMJ的结扎侧管腔分别增加171%、63%、38%、15%、12%。除C3H和BAL SM F1外,其他4种品系小鼠的结扎侧血管壁面积显着增加,与对侧血管壁面积相比B6、SWR、BALB、SMJ分别增加209%、170%、79%、68%。与其他品系小鼠相比B6结扎侧血管壁面积的增加是显着的。对于B6、SWR、BAL SM F1、BALB小鼠来说,结扎侧血管壁中细胞数是显着多于对侧的。这表明细胞增多是血管壁面积扩大的一个主要因素。SWR和B6小鼠在颈总动脉结扎后容易形成新生内膜病变,但BALB,SMJ和C3H小鼠不容易形成病变。选用SWR小鼠生成的病变通过免疫染色的方法进行细胞成分分析。分别用抗-α-平滑肌肌动蛋白和MOMA-2抗体检测平滑肌细胞和巨噬细胞。新生内膜病变主要由存在于纤维帽附近的平滑肌细胞组成,但没有观察到巨噬细胞。由于病理过程中平滑肌细胞从静止的收缩型转变为合成型,而抗-α-平滑肌肌动蛋白抗体属于收缩平滑肌细胞的特异性抗体,因此大量的合成型平滑肌细胞并没有发生相应的抗原抗体反应。选择B6和C3H来源的平滑肌细胞来研究其增殖和迁移能力。研究显示C3H平滑肌细胞的生长、迁移能力显着弱于B6的平滑肌细胞。(2)Rcn2作为动脉粥样硬化易感基因的鉴定结扎左颈总动脉研究基因Rcn2在动脉粥样硬化的发病过程中的作用。Rcn2-/-小鼠是在B6 apo E-/-小鼠基础上再敲除基因Rcn2获得的。实验中采用B6 apo E-/-小鼠作为对照。在本研究中分别采用高脂饮食和正常饮食饲养动物。在正常饮食条件下,结扎颈总动脉后Rcn-/-小鼠血管中没有观察到新生内膜病变,但B6 apo E-/-小鼠血管中生成了较大的病变。在高脂饮食条件下,B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠血管中都形成了巨大的新生内膜病变。B6 apo E-/-小鼠结扎侧血管壁面积相比对侧显着增加,而在Rcn2-/-结扎侧血管壁面积相比对侧是减少的。在两种饮食条件下,结扎后B6 apo E-/-小鼠的颈总动脉呈现正性重塑,其结扎侧血管腔面积大于对侧管腔面积。Rcn2-/-小鼠结扎动脉呈现负性重塑,其结扎侧管腔面积是减少的。两种饮食条件下,B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠在管腔面积方面的差异均是显着的。通过免疫组织化学染色分析B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠新生内膜病变中的细胞组成。正常饮食组B6 apo E-/-小鼠的新生内膜病变主要由平滑肌细胞和少数灶性聚集的巨噬细胞组成。高脂饮食组在B6 apo E-/-小鼠的病变中观察到一些灶性聚集的巨噬细胞。但由于从收缩型转变成合成型,所使用的抗体检测不到合成型平滑肌细胞。高脂饮食组Rcn2-/-小鼠的新生内膜病变中充满巨噬细胞,这完全不同于B6 apo E-/-小鼠。源于Rcn2-/-小鼠的内皮细胞的迁移能力显着弱于来自B6 apo E-/-小鼠的内皮细胞。敲除Rcn2导致内皮细胞增殖较慢,但该结果没有统计学意义。(3)氯化钾和性别对动脉粥样硬化发病过程的影响性别和氯化钾被认为是心脏性疾病发展过程中的两个重要因素。我们之前观察到血浆中Rcn2浓度与氯化钾浓度呈明显的负相关。在本研究中,对雄性和雌性B6apo E-/-小鼠进行颈动脉结扎,以研究不同性别之间动脉粥样硬化易感性的差异。本研究还评估了氯化钾对源自B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠的内皮细胞的增殖和迁移的影响。对比颈总动脉结扎后的雄性和雌性B6 apo E-/-小鼠,尽管两者在新生内膜病变、结扎侧与对侧血管壁面积差值、新生内膜与结扎侧血管壁面积比方面存在一定差异,但该差异没有统计学意义。雄性小鼠的左侧颈动脉呈现出正性重塑,结扎侧血管腔比对侧增加超过70%,而在雌性小鼠颈动脉呈现负性血管重塑。氯化钾对从B6 apo E-/-和Rcn2-/-主动脉分离的内皮细胞的增殖和迁移没有显着影响。可能是因为氯化钾对细胞的作用是一种慢性过程。
程文琴[6]2006年在《～（60）co-γ射线辐照在血浆蛋白制品病毒灭活中的应用研究》文中提出目的：~(60)Co-γ射线对多种微生物均有杀灭作用，其中包括经血液传播的病毒体。~(60)Co-γ射线辐照技术过去主要用于医疗用品的消毒灭菌处理，本研究尝试用它灭活处理血浆蛋白制品中的病毒，目的是寻找新的血浆蛋白制品病毒灭活技术，提高血液制品应用的高安全性。 方法：以sindbis病毒作为试验病毒，以人静脉注射用免疫球蛋白作为处理对象，以Vc、Vc-Na和TP叁种强抗氧化剂作为蛋白保护剂，观察了蛋白保护剂对γ-射线灭活液态和冻干血浆蛋白制品中病毒的影响，同时通过PAGE电泳、HPLC、ITM、SRID、ELISA以及Western-blot等方法分析了IgG分子结构与功能的变化： 结果： 一、~(60)Co-γ射线灭活液态IVIG中的病毒：30kGy ~(60)Co-γ射线辐照能完全灭活液态IVIG中6.5 LgTCID_(50)的Sindbis病毒，但对IgG分子结构和功能损伤明显，活性抗原量与辐照前相比仅剩30％左右。加入0.025—0.2 mg／ml的Vc、Vc-Na和TP叁种蛋白保护剂不影响~(60)Co-γ射线(30kGy)灭活液态IVIG中的Sindbis病毒效果，IgG分子结构得到一定保护，分子聚合及断裂明显减少；含0.2mg／ml蛋白保护剂的液态样品中，IgG活性抗原量与无保护剂组相比提高了近一倍，叁种保护剂的保护效果基本一致。同样加入2.5—40mg／ml浓度的蛋白保护剂Vc也不影响~(60)Co-γ射线(45kGy)灭活液态IVIG中的Sindbis病毒效果；IgG分子结
李秀娟[7]2008年在《亚甲兰光化学法灭活血浆乙肝病毒及对红细胞膜的损伤研究》文中进行了进一步梳理目的:研究不同浓度的MB(1.0μmol/L, 5.0μmol/L, 10.0μmol/L),在光照度为40000LUX,分别荧光照射血浆0、20、40、60min,灭活血浆病毒DNA,通过荧光定量PCR技术对血浆病毒灭活的各个不同时间段乙肝病毒DNA浓度进行监测,判断灭活效果,选定最佳灭活条件,并观察病毒灭活后对血浆成分的影响。研究5.0μmol/L的MB浓度,在光照度为40000LUX,分别照射红细胞悬液0、20、40、60min,观察MB法处理悬液的同时膜的损伤程度,间接了解对红细胞生物学功能的影响,探讨亚甲蓝光化学法在红细胞制品病毒灭活方面的可行性。方法:在已知HBV-DNA阳性血浆中加入MB ,调整MB终浓度分别为1.0μmol/l、5.0μmol/l、10.0μmol/l ,光照度为40000LUX,照射时间分别为0min、20min、40min、60 min,在各点分别取样抽提基因组DNA用于荧光定量分析,测定HBV-DNA的浓度,推断在不同时间和浓度下的灭活效果。在灭活效果最好的点取样检测血浆正常成分有无显着变化,其中包括生化指标,酶学指标,凝血因子FⅧ:C活性,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白亚基的变化,蛋白免疫印迹观察血浆的抗体蛋白活性变化。同样方法,亚甲蓝光化学法处理红细胞悬液,光照度为40000LUX,MB浓度为5.0μmol/L,在光照0min、20min、40min、60 min后的不同时间点提膜测定红细胞膜Na+-K+ATP酶,膜AchE活性,并观察红细胞形态的变化及膜的通透性改变。结果:当MB为10.0μmol/L,光照60min时,灭活乙肝病毒的效果最好,对于高拷贝数的病毒浓度,在本实验的条件下,尚无法完全灭活病毒,但可以使HBV-DNA浓度明显下降;从病毒灭活的表格看,灭活效果与时间和MB浓度呈正相关,作用60min时血浆中主要成分的生化指标无显着变化及凝血因子FⅧ:C活性无明显改变,部分血浆酶活性有明显下降(P <0.05)。血浆蛋白的亚基数目和迁移速度未见明显变化,血浆的抗体蛋白也具有正常的生物学活性。在用于红细胞制品灭活方面,亚甲蓝法还有缺陷,对红细胞膜的损伤较明显。随着照射时间的延长,红细胞的边缘出现了不规则、粘连,附着物也逐渐增多。红细胞的溶血度显着增大(P <0.05),几乎呈线性。在照射过程中,Na+-K+ATP酶无明显下降。膜AchE在40min后下降速率增大,与对照组比,下降了大约65%(P<0.05)。在照射20min后渗透脆性也渐出现明显升高(P<0.05)。推测亚甲蓝对膜损伤的主要机制可能是单线态氧和自由基的氧化作用。结论:MB10μmol/L辅助荧光光照60min可使血浆中乙肝病毒量明显降低,但无法完全灭活。在此实验条件下,血浆的大多数成分能保持较高活性。MB法对红细胞膜有损伤作用,其损伤的机制可能是由于单线态氧和自由基对膜的过氧化作用。
倪小菊, 王迅, 郑岚, 黄宇闻, 莫琴[8]2007年在《亚甲蓝光化学法降解丙型肝炎病毒核酸的研究》文中指出目的研究亚甲蓝光化学法(methylene blue photochemistry,MB-P)降解病毒核酸的作用机制,为该方法在临床血液制品病毒灭活中的应用提供理论依据。方法以丙型肝炎病毒(HCV)为研究对象,选择HCV基因组中相对保守的5′-NCR为模板,应用荧光定量PCR技术观察不同处理时间HCV RNA降解情况。同时,对体外转录的同区段的HCV RNA在无蛋白成分的代血浆(羟乙基淀粉20-氯化钠注射液)及PBS缓冲液中的降解模式进行分析。结果MB-P处理条件下,HCV RNA含量呈对数形式下降,该方法对体外转录RNA的灭活效率低于对血浆中病毒颗粒的灭活效率。结论亚甲蓝能作用于病毒核酸,在光照条件下使RNA迅速降解,从而达到病毒灭活的效果。
张爽[9]2016年在《短波紫外线法灭活血小板悬液中病毒的实验研究》文中认为目的通过自行研制的短波紫外线(UVC)灭活装置研究短波紫外线对血小板悬液中指示病毒(辛德毕斯病毒和伪狂犬病毒)灭活的实验方法,以期在保护血小板功能质量前提下提高血小板的安全性。方法1、血小板病毒灭活方法的建立(1)富血小板血浆(PRP)的制备:采用白膜法分离血小板。用400ml的一次性采血袋采集健康献血员静脉血,边采集边缓慢混匀,以免血液凝集或溶血。采血完成后将血袋置于低温离心机中,调节温度22±2℃,离心转速为4000rpm,离心10min。离心结束后用全血成分分离机分离出白膜成分。白膜经第二次离心,转速为800rpm,离心10min后用夹板手工分离出血袋上层淡黄色的富血小板血浆,置22±2℃振荡保存。(2)血小板的病毒灭活:试验前先配制好血小板添加剂SSP+盐溶液备用。首先取1袋手工血小板,先经3000rpm,20min离心去除上层血浆,然后加入配制好的SSP+溶液混匀,重悬血小板。再加入1/10体积的指示病毒(辛德毕斯病毒或伪狂犬病毒)和核黄素磷酸钠溶液混匀,制得含有指示病毒的血小板悬液,使核黄素磷酸钠工作浓度约200 μM。最后,向长宽约14cm×5cm的光照袋中加入20ml血小板SSP+悬液,使其液层厚度约3mm。置于自制的UVC灭活仪中进行紫外线照射0,15s,30s,1min,2min。每一时间点照射结束后,留取0.5ml样本做病毒滴度检测。(3)血小板病毒灭活效果检测:选用病毒敏感的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞株)接种于96孔板中,采用微量细胞病变法。将上述经紫外线辐照前后的样品做10倍系列稀释后,立即加入已接种检测细胞的96孔板中,每个稀释度做8复孔,放37℃,5%CO2培养箱中孵育72小时,光镜下观察并记录细胞病变(CPE)情况,计算TCID50。2、病毒灭活处理后血小板功能检测(1)血小板计数:用血细胞计数仪测定病毒灭活处理前后血小板计数(PLT)。(2)血小板活化后生长因子释放量的检测:VEGF、PDGF-BB、TGF-β、IGF、bFGF和EGF六种生长因子,用ELISA试剂盒进行定量检测,实验操作严格按照试剂盒说明书进行。(3)血小板活化上清促细胞增殖试验:选用CCK-8法检测病毒灭活前后血小板活化上清对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的促进作用。调整细胞计数约5× 104个/ml,铺96孔板,待细胞贴壁后进行给药。根据生长因子含量检测结果,选择稀释320倍的血小板活化上清(用含0.4%胎牛血清的1640培养基稀释),每个标本3复孔,每孔100 μ 1。阴性对照孔吸去培养基后加入0.4%胎牛血清的1640培养基。培养24h,48h,72h后每孔加入10 μ 1的CCK-8试剂,放入37℃C 5%C02培养箱中2个小时后,在主波长570nm,次波长630nm的双波长下测吸光度值。通过吸光度值的比较判断细胞增殖的情况。(4)血小板超微结构观察:取2ml血小板样品,以8000×g离心2min,去上清,PBS洗涤2次,加入3%戊二醛4℃下固定交由本院医学实验科做超薄切片,透射电子显微镜下观察血小板的超微结构。结果1、非洲绿猴肾细胞在含10%胎牛血清的MEM培养基中生长状态良好,4h可见部分细胞贴壁,逐渐伸出伪足;24h细胞完全贴壁,边界清楚,为长梭形;2-3d融合成致密单层,为铺路石样排列,细胞生长较快。在感染伪狂犬病毒/辛德毕斯病毒24h即可出现镜下可见的细胞病变效应,细胞肿胀变圆,折光性变强,可见合胞体,并逐渐脱落。2、自制的短波紫外线(UVC)灭活装置对血小板病毒灭活效果显着。在单面辐照强度为4.32mw/cm2,单独紫外线光照处理30s即能有效灭活血小板悬液中的辛德毕斯病毒和伪狂犬病毒,使病毒滴度降低4个对数级(［og)。照射lmin,可使伪狂犬病毒全部灭活(下降5.38个对数级),辛德毕斯病毒全部灭活(下降4.59个对数级)。在辐照剂量相同的条件下,单独UVC处理组和添加核黄素磷酸钠组两组病毒灭活效果没有显着差异。3、在病毒灭活处理后血小板功能评价方面,UVC处理后血小板计数明显下降,P<0.05;在辐照剂量相同的条件下,添加核黄素磷酸钠组血小板计数降低较无核黄素磷酸钠组降低缓慢,两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。并且在病毒灭活处理30s,血小板活化上清中,除TGF-β外其余五种生长因子,处理组较未处理组明显降低,P<0.05,有统计学差异;TGF-β在UVC处理后升高,P<0.05,差异有统计学意义。在细胞增殖实验中,处理前后的血小板活化上清均有促细胞增殖的作用;在第24h新鲜未处理组PRP活化上清对细胞增殖作用最强,P<0.01;在第48h和第72h单独UVC处理组PRP活化上清对脐静脉内皮细胞增殖作用最强,P<0.01。电镜结果发现处理组血小板伪足伸出,细胞肿胀,内容物释放。结论短波紫外线UVC法可有效灭活血小板悬液中辛德毕斯病毒和伪狂犬病毒,在短时间内使病毒滴度均降低4个对数级以上,达到了国家对血液制品病毒灭活的要求;在此灭活体系中添加核黄素磷酸钠对病毒灭活并无明显促进作用,但对血小板的质量和功能有一定的保护作用。UVC照射灭活病毒的同时会损伤血小板,使血小板数量降低、结构有一定程度破坏等,是下一步研究中需要解决的问题。
周锡鹏, 马平, 张艳宇, 吕丽萍, 许金波[10]2012年在《~(60)Coγ-射线辐照灭活冻干血浆中病毒的研究》文中研究指明冷冻干燥血浆做为一种常用的血液制品,由于病毒安全性的问题没有完全解决已停用多年。冻干血浆具有可在常温下保存,且保存时间长,重量轻,易于运输,适合于大批量生产等优点。随着临床方面的需要,尤其是非常适合战时的需要。国内已有多家科研单位和血液制品生产厂商在开展冻干血浆病毒灭活的研究工作。大家所选用的方法多为有机溶剂/表面活性剂(S/D)方法、干热方法(如72℃、80℃干烤)和100℃煮沸30min等。本文按《病毒灭活规程》的要求,探索用60Coγ-射线不同剂量辐照冻干血浆,观察对所加入的几种指示病毒的灭活效果。
参考文献：
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[2]. 亚甲蓝光化学法灭活血浆中丙型肝炎病毒的分子生物学机理[D]. 倪小菊. 华东师范大学. 2007
[3]. 通用型病毒灭活血浆制备方法研究[D]. 王淑英. 中国人民解放军医学院. 2012
[4]. 荧光与亚甲蓝联用对血浆中病毒灭活的研究[J]. 黄宇闻, 程庆文, 莫琴, 谢如锋, 钱开诚. 中国消毒学杂志. 2000
[5]. Ⅰ.高纯α2-巨球蛋白的规模化制备及其重要生物学功能研究 Ⅱ.六种近交系小鼠动脉粥样硬化易感性差异分析及动脉粥样硬化易感基因Rcn2的鉴定[D]. 皇甫超济. 中国人民解放军军事医学科学院. 2017
[6]. ～（60）co-γ射线辐照在血浆蛋白制品病毒灭活中的应用研究[D]. 程文琴. 中国人民解放军军事医学科学院. 2006
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[8]. 亚甲蓝光化学法降解丙型肝炎病毒核酸的研究[J]. 倪小菊, 王迅, 郑岚, 黄宇闻, 莫琴. 临床输血与检验. 2007
[9]. 短波紫外线法灭活血小板悬液中病毒的实验研究[D]. 张爽. 广州中医药大学. 2016
[10]. ~(60)Coγ-射线辐照灭活冻干血浆中病毒的研究[J]. 周锡鹏, 马平, 张艳宇, 吕丽萍, 许金波. 中国输血杂志. 2012