董漪[1]2004年在《丙型肝炎病毒HVR1合成肽抗原活性的研究及丙型肝炎Th1/Th2免疫应答的初步探讨》文中研究指明全世界约有超过1.7亿人感染丙型肝炎病毒(HCV)，50％以上的感染者转为慢性。其中又有大约20％的慢性患者在20-30年中发展成肝硬变、肝细胞癌。在大部分的器官移植中心，HCV的感染现在已成为肝移植的主要原因。但是HCV感染的发病机制目前并不十分清楚。研究发现HCV包膜蛋白2(E2／NS1)N端存在一个序列高变区(HVR1)(384-410aa)，它是HCV序列中变异率最高的区域，也是目前被证实存在保护性中和位点的区域。它能够在实验动物体内诱导病毒株特异性抗体及非特异性抗体(交叉反应性抗体)。因此HVR1一直是HCV研究的热点。 本室在先前的HCV研究中，设计及合成了一定数量的HVR1多肽(模拟表位)。其中一号多肽，即7肽(384 GQTYTSG 390)在实验动物免疫原性、与丙肝患者血清交叉反应性等各项生物学指标中均表现出良好的活性。本研究将7肽与部分中国人群HCV军医进修学院硕士毕业论文优势感染亚型(11/lb型和111/Za型)HVRI序列和Genebank序列进行比较分析，发现7肤aa序列与HVRI序列各位点出现频率最高的aa相近，特别是发现HVRIN端aa变异主要发生在相似性质aa之间。说明HVRIN端aa确实是有一定的保守性。推测这些保守位点是构成杭原的基本框架，由此表明7肤的抗原活性强。应用计算机进行同源模建分析和二级结构预测，结果也表明7肤具有较好的抗原活性，是一个线性表位。 我们还研究了7肤与HCV感染者的2此份动态血清的反应特点，初步探讨了与患者病程的关系。结果显示7肤与血清有良好的交叉反应性，总阳性率达到79.8%。分组研究发现7肤与肝硬变组患者血清的反应性要显着高于慢性肝炎组，活动性肝硬变组血清与7肤的反应性显着高于轻度、中度慢性肝炎组。提示7肤和血清的反应性与丙型肝炎的病程相关。通过研究7肤与丙肝患者长期(>半年)动态血清的反应性，发现虽然有一定的波动，但是绝大多数患者在相当长的时期内对其反应阳性，说明7肤能够较好的克服HCV变异造成的免疫逃逸。 本研究还选用7肤对83例HCV感染者外周血单个核细胞(PBMC)进行体外刺激，观察细胞增殖和细胞因子的分泌情况，对7肤引起机体免疫应答的性质以及与HCV发病机制间的关系进行初步探讨。结果发现IFN一Y、IL一10、TNF一a均较未刺激组明显升高，而未检测到IL一2、IL一4、IL一12的分泌。表军医进修学院硕士毕业论文明7肤刺激PBMC后Thl、ThZ细胞因子的分泌水平升高，提示7肤可同时引起细胞和体液免疫应答。但从升高比率看，Thl倾向性可能更大。本研究还发现未加7肤刺激的培养上清中工L一10、TNF一a和工FN-Y与正常人对照比较分泌升高，表明HCV感染者在外周血单个核细胞(P BMC)是ThZ细胞因子分泌占优势，与HCV感染的慢性化有关。 以上研究工作为下一步HCV多杭原肤疫苗和核酸疫苗的研制莫定了基拙。为临床治疗丙型肝炎提供了一些新的思路和方法。
彭佳蓓[2]2008年在《香菇多糖联合丙肝核酸疫苗诱导抗原特异性免疫反应的研究》文中认为第一部分丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)DNA疫苗的制备与鉴定目的:大量制备丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)DNA疫苗,并进行定量及定性分析,为进一步研究其免疫活性奠定基础。方法:将pcDNA3.1-HCV/NS3转化感受态大肠杆菌HB101,克隆后挑取单个菌落扩增,用超纯质粒大量快速提取试剂盒提取pcDNA3.1-HCV/NS3,提取物分别进行核酸定量检测和琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果:本试验成功的转化pcDNA3.1-HCV/NS于大肠杆菌中,铺平皿温育16h后有较多的单菌落生长。扩增提取产物经核酸定量检测,浓度在1.5μg/μl-2μg/μl范围内,纯度均接近1.8,因免疫小鼠所需要的DNA浓度为1μg/μl,所以提取的DNA在浓度和纯度上符合要求,另将扩增提取产物双酶切后经琼脂糖凝胶电泳证实扩增的质粒DNA包含目的基因NS3片段,分子量为1.8Kb。结论:本实验成功制备了用于免疫动物的HCV/ NS3 DNA疫苗,为进一步研究其免疫活性奠定了基础。第二部分香菇多糖作为免疫佐剂对丙肝病毒非结构蛋白3(NS3)体液免疫效果的影响目的:探讨中药香菇多糖(LNT)作为免疫佐剂对HCV/ NS3核酸疫苗体液免疫效果的影响。方法:HCV-NS3核酸疫苗肌注免疫BALB/c小鼠(100μg/只),10天后加强免疫一次,同时灌胃给予高(1mg/ml)、中(0.5mg/ml)、低(0.1mg/ml)叁种剂量的香菇多糖,于末次免疫后第1、3、5周分别采集小鼠尾血,分离收集血清冻存。用HCV/NS3抗原多肽包被酶标板,采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测小鼠血清特异性IgG抗体水平。并采用ELISA方法检测血清中细胞因子IL-4和IFN-γ分泌水平。结果:二次免疫后1周各组免疫小鼠血清中均产生了不同水平的抗体,以中剂量LNT为佐剂的免疫组在各时间点产生的特异性IgG水平最为显着,而且随着时间的增加,中剂量LNT为佐剂的免疫组和单独免疫核酸疫苗组的特异性IgG水平呈现出上升的趋势,而以高剂量和低剂量的LNT为佐剂免疫组的抗体水平随时间变化不大;中剂量香菇多糖为佐剂免疫组产生的特异性抗体水平较单独免疫核酸疫苗组在各时间点均有显着性提高(P<0.05)。细胞因子分析显示以不同剂量香菇多糖作为佐剂的免疫组较之单独免疫核酸疫苗组IFN-γ的分泌增加,其中中剂量的香菇多糖联合HCV/NS3核酸疫苗组产生IFN-γ的水平较之单独使用核酸疫苗组,差异非常显着(P<0.01)。而IL-4水平各组间无明显差异(P>0.05)。结论:通过二次肌注免疫HCV/NS3核酸疫苗,小鼠体内产生了抗NS3抗原的特异性IgG抗体,而且随着时间的延长,特异性抗体水平也随之升高。中剂量的香菇多糖为佐剂能够增强HCV/NS3核酸疫苗诱导的特异性体液免疫反应。香菇多糖能够刺激Th1类细胞因子IFN-γ分泌,而对Th2类细胞因子IL-4的分泌未明显影响。第叁部分香菇多糖作为佐剂对丙肝病毒非结构蛋白3(NS3)细胞免疫效果的影响目的:探讨中药香菇多糖(LNT)联合丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3核酸疫苗诱导NS3抗原特异性细胞免疫作用。方法:将不同剂量的香菇多糖与HCV/NS3质粒(100μg/只),采用初次加强免疫法联合免疫BALB/c小鼠。第二次免疫10天后取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,与NS3多肽抗原共同孵育作为效应细胞。另培养NS3抗原致敏的P815细胞作为靶细胞。采用MTT法分别检测NS3抗原特异性T细胞增殖反应和细胞毒T细胞特异性杀伤反应(CTL)。结果:研究发现中剂量和低剂量香菇多糖与NS3质粒联用明显增强NS3抗原特异性T细胞增殖反应(P<0.05)。高剂量及中剂量香菇多糖与HCV/NS3核酸疫苗联合应用,在效靶细胞比为50:1和25:1时,可诱导更强NS3抗原特异性CTL反应,与单独免疫NS3质粒相比有显着性差异(P<0.05)。而低剂量的香菇多糖佐剂免疫组的CTL杀伤率与单独使用核酸疫苗组相比没有明显差异。总的趋势是随着效靶细胞比值(E/T)的增大,效应细胞对靶细胞的杀伤力也增大。结论:采用初次加强免疫法将中剂量香菇多糖(0.5mg/ml)与HCV/ NS3核酸疫苗联合免疫BALB/c小鼠,可激发明显增强的抗原特异性T细胞增殖和CTL反应,并结合试验第二部分的细胞因子分析结果,提示香菇多糖作为丙肝病毒NS3核酸疫苗的免疫佐剂,可加强抗原特异性免疫应答效应。
参考文献：
[1]. 丙型肝炎病毒HVR1合成肽抗原活性的研究及丙型肝炎Th1/Th2免疫应答的初步探讨[D]. 董漪. 中国人民解放军军医进修学院. 2004
[2]. 香菇多糖联合丙肝核酸疫苗诱导抗原特异性免疫反应的研究[D]. 彭佳蓓. 华中科技大学. 2008
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