纪宗玲[1]2001年在《人era基因的表达分布及其功能的相关研究》文中研究表明era基因是1986年测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseⅢ的rnc基因下游发现的一个开放读框，其编码的蛋白具有鸟苷酸结合活性，氨基酸序列与人和酵母的Ras有明显相似性，故命名为E.coli Ras-like（era）基因。后来的研究表明，era的同源序列存在于所有探讨过的细菌中，era编码的Era蛋白并不属于Ras家族，其独特的C端使其成为一个新的G蛋白亚家族。 Era蛋白由两个结构域组成，N端是一个典型的鸟苷酸结合蛋白结构域，与其它G蛋白有较高的同源性；C端为Era家族所特有，与其它蛋白家族无任何同源性，其中含有一个RNA结合功能结构域—KH结构域。大肠杆菌era是属于rnc操纵元的一个细菌生存必需的基因，并参与细胞周期的调控，Era可以特异地与16S-rRNA结合。陈苏民教授在美国NIH工作期间，以大肠杆菌Era的C端序列为靶序列，通过计算机搜索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌Era同源的EST序列，以此为线索，成功地克隆了人和小鼠全长的era-cDNA。在此基础上，本文对人Era的组织表达谱及其功能进行了相关研究。 在本研究工作中，首先对人era的表达分布规律进行探索。1、人era-mRNA的组织分布规律：以人era编码区基因为探针，用CLONTECH公司的MTN和MTE ＄四旱医大学俗士攀位论文 第7 页杂交膜进行杂交，发现人。。－mRNA的大小为2．ZKb，分布于所有检测的组织和细胞系中，但表达水平有很大差异。表达最高的组织为心尖部、肝脏、胎肺和甲状腺。2、人。。。的蛋白表达分布规律：用课题组制备并经过亲和纯化的兔抗人Era多克隆抗体对几种胎儿组织进行免疫组织化学染色，结果人Era蛋白分布于绝大多数所检测的组织，由强到弱依次为胰脏、肺、心脏、脾脏、胃、小肠、肝脏和肾脏。 经免疫电镜检测大肠杆菌Era定位于胞浆膜的内侧面，其C端对细胞内定位有着重要意义。为分析人ERA在细胞内的定位，构建了人Era与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体pSMEGFP－hEra和PEGFP－CI－hEra，即目的蛋白分别位于荧光标签蛋白（EGFP）的N端和C端。瞬时转染NIH3T3细胞，带荧光的融合蛋白主要位于靠近核膜的胞浆部分；进一步用纯化的兔抗人Era多克隆抗体对类风湿关节炎滑膜细胞系RA，骨肉瘤细胞系MG63、胃癌细胞系7901等几种培养细胞进行问接免疫荧光检测，发现均有强弱不等的荧光，且主要分布于胞浆中。表明人Era具有不同于大肠杆茵Era的细胞内定位，其细胞内分布以胞浆为主，可能具有与细菌Era不同的信号转导途径。 为研究人Era对细胞形态、细胞周期的影响，进行以下工作：1、对人Era的氨基酸序列进行了计算机分析，在此基础上构建了人Era的定点突变体，其突变的位置分别针对N端结构域的GTP结合位点和C端结构域的KH基序；2、带HA标签的野生型和突变型人Era的真核表达载体，转染Nll－I3T3细胞，筛选到稳定表达的细胞株。3、对稳定表达人Era细胞株的细胞形态和细胞周期进行分析，发现野生型人Era对细胞生长有促进作用，而KH基序突变后对细胞生长起抑制作用。流式细胞仪分析表明，转染野生型Era的细胞株表现为GZ期和S期细胞增多，可能为DNA合成旺盛的结果；转染Era S36N细胞株各时相细胞所占百分数变化不明显；转染 Era 31 ON的细胞株 S期细胞和 GZ期细胞增多异常显着，结合细胞形态和生长曲线，可能存在细胞周期阻滞；即在细胞DNA复制后期不能向M期转化。 进一步使用完全可调控诱导表达系统表达突变型人Era，以深入研究该蛋白的功能。在构建稳定高表达蜕皮激素受体基因的细胞株3V3的基础上，转染突变型人Era的表达载体进行压力筛选，对所得到的单克隆细胞株进行诱导与未诱 DopGI’－’’’ent ofBtochthe andMolecularmp FMMU2001 窜回旱医大学博士学位论文 章 吕 页导条件下细胞周期的分析，结果表明未诱导加酒精的对照细胞可以引起细胞凋亡，而Era诱导表达后可以显着抑制凋亡细胞的数量，Western表明Era S36N可以诱导细胞仇 1－2表达，提示人 Era可能与细胞凋亡相关。 为进一步研究人Era的作用机理，对其结合蛋白的功能区进行鉴定，将人。。a基因克隆入融合表达载体 PRSETB中，转化大肠杆菌 BL21DE3（pLysS），经IPTG诱导，表达6His－hEra融合蛋白。光密度扫描结果表明其占菌体总蛋白50％以上，表达产物分子量约为42KD，以包涵体形式存在。在SM i存在条件下，包涵体溶解，利用6Hk与过渡态金属离子N广高亲合力结合的性质，用N广一叮A亲和树脂一步法纯化，即获得纯度达96％以上的6His－hEra融合蛋白。将纯化的蛋白进行包被，从噬菌体表面呈现随机十＝肽库中经过叁轮淘筛（Biopanning），并用ELISA检测，筛选到具有人Era结合活性的阳性重组噬菌体克隆，测序后发现大多（7／9）具有 HxHSxxH的氨基酸序列，初步认为是人 Era的结合基序，为进一步Era结合蛋白基因的克隆及其功能研究提供了依据。
郭向云[2]2010年在《从细胞生长和乙醇诱导细胞凋亡的角度初步探讨hEra的功能》文中进行了进一步梳理Era广泛分布于细菌、古细菌和真核生物中,是一个新的G蛋白亚家族。已有的研究结果显示,原核生物era是生存的必需基因,Era参与细胞周期调控和蛋白合成,是细菌生长必需的GTPase分子;真核生物Era的研究目前主要以人Era(hEra)为主,研究发现hEra在多种正常组织中表达,但其具体功能和确切机制还不清楚。因此,进一步研究Era的功能不仅有利于我们认识Era这一新的G蛋白亚家族,更能使我们对细胞生长和凋亡这样重要的生理过程有进一步的了解。hera基因(hera)位于人17号染色体长臂11.2,是我室陈苏民教授1999年克隆并定位的。2000年陈教授发现hera-mRNA存在两种不同的剪接方式:hEra和hEraII。我室前期主要研究hEraII的功能,发现hEraII与细胞生长和凋亡相关;本研究以hEra为主要研究对象,利用完全可诱导真核生物表达系统,对hEra在细胞生长、细胞周期和低浓度乙醇诱导细胞凋亡中的作用进行了研究。然后选取低浓度乙醇诱导细胞凋亡的常用实验材料肝癌细胞HepG2,对其hera RNAi后观察肿瘤细胞相关的生理变化。主要研究结果:1. hEra的功能与细胞生长和乙醇诱导的细胞凋亡相关。本实验采用的“完全可诱导哺乳类表达系统”由受体载体pERV3和可表达目的基因的表达载体pEGSH组成,在昆虫蜕皮激素的类似物Ponasterone A(Pon A)诱导下可表达目的基因。这个可调控表达系统具有高的诱导表达水平和快速开(turn on)关(turn off)效应等特点,是一种利用基因转导技术来研究基因功能的强有力手段。利用完全可诱导真核生物表达系统,我们将hEra在HEK293细胞中稳定转染,诱导稳定表达。细胞形态和生长曲线结果提示hEra的过表达能促进细胞生长,细胞周期检测显示野生型hEra能使G1期细胞降低,S期细胞增多;细胞同步化实验证明hEra的高表达促进细胞进入S期,使细胞在G1期持续时间缩短(诱导前为17.82 h,诱导后为14.13 h);Western blot实验说明hEra能上调cyclin D在蛋白水平的表达;用化学合成siRNA对hEra RNAi后HepG2细胞生长受到抑制。这些实验结果提示hEra可能通过间接上调cyclin D的蛋白表达来促进细胞快速进入S期,加快细胞生长和分裂进程。在我们建立的低浓度乙醇诱导细胞凋亡模型中,发现hEra的高表达能在一定程度上抑制低浓度乙醇诱导的细胞凋亡,而且可以上调c-jun的mRNA表达,下调促凋亡蛋白Bax的蛋白表达。提示hEra对低浓度乙醇诱导细胞凋亡的抑制与转录因子AP-1相关,这为下一步研究hEra的相关分子机制提供了线索。2. hEra N端在细胞生长分裂和乙醇诱导的细胞凋亡中起重要作用。为研究hEra N端的功能,我们构建了2种突变体:1种点突变hera S127N(对应于野生型人Era蛋白的G结构域)和1种截短突变hera 1-343(对应截短去掉人Era蛋白的C端KH结构域)。将其分别克隆于可诱导表达载体系统中,转染于已稳定转染受体载体pERV3的HEK293细胞,诱导表达后,观察对细胞的影响。我们观察到诱导表达的hEra N端GTPase结构域的完整表达即hEra 1-343也能促进细胞生长,但诱导表达的N端相应的单点突变体hEra S127N则不能,相应的细胞周期检测也印证了这一点,因此我们认为hEra N端GTPase结构域的完整对细胞的生长有积极意义。在低浓度乙醇诱导细胞凋亡的研究中,诱导表达的N端截短体hEra 1-343也能有效抑制乙醇诱导的细胞凋亡,而诱导表达的N端相应的单点突变体hEra S127N对这种凋亡没有抑制作用。说明hEra N端GTPase结构域的完整不仅对细胞的生长有积极意义,而且在抑制凋亡中也起重要作用。实验表明,诱导表达的hEra 1-343能上调c-jun mRNA的表达水平,下调c-myc的mRNA和促凋亡蛋白Bax的蛋白表达。提示hEra N端在体内可以独立行使某些生物学功能。3. hEra C端KH domain的活性在hEra的功能行使中可能起“锚定”作用。如结果2所述,用同样方法我们构建另2种突变体:hera I401N(对应于野生型人Era蛋白的KH结构域)和1种截短突变hera ?329(对应截短去掉人Era蛋白的N端GTP结构域)。将其分别克隆于可诱导表达载体系统中,转染于已稳定转染受体载体pERV3的HEK293细胞,诱导表达后,观察对细胞的影响。当hEra N端GTPase结构域完全缺失即只有KH结构域的截短体hEra ?329诱导表达时,细胞生长受到严重抑制,细胞周期检测在G2/M期发生阻滞,提示C端KH domain在hEra功能的行使中有重要作用,而且hEra对细胞的G2/M期也有一定影响。表明诱导表达的hEra ?329对细胞生长的抑制是hEra ?329对内源hEra的dominate negative效应。结合上述实验现象,我们推测:KH结构域是hEra行使功能的“锚定区”, GTP结合结构域是“催化区”。在GTP结构域发生突变时的点突变体hEra S127N中,KH结构域使突变的hEra仍然锚定在作用靶点,但GTP结合结构域不能行使功能,从而直接或间接影响细胞生长;当GTP结构域缺失后(即hEra ?329),KH结构域与内源hEra竞争结合作用靶点,使细胞生长受到严重抑制,细胞曲线明显右移。综合上述研究结果,我们认为hEra在功能上与细胞生长相关,其高表达能抑制低浓度乙醇引起的细胞凋亡。N端GTPase结构域在hEra发挥功能中起重要作用,C端的KH结构域在hEra发挥功能中可能起“锚定”作用。
杜孟刚[3]2004年在《用RNA干涉研究人era基因的功能》文中研究说明era最初是在大肠杆菌中发现的基因，编码一种GTP酶，以后发现在生物界广泛存在着与大肠杆菌era同源的基因。era基因编码的蛋白Era与此前所知道的含有3个亚基的大G蛋白和只含有1个结构域的小G蛋白(以RAS为代表)都不同，Era含有N端的GTPase和C端的KH(与RNA结合)2个结构域，从而形成了从微生物到人类都具有的一个独特的、新的G蛋白亚家族---Era家族。 大肠杆菌era是属于rnc操纵元的一个细菌生存必需的基因，并参与细胞周期的调控，Era可以特异地与16S-rRNA结合。陈苏民教授在美国NIH工作期间，以大肠杆菌Era的C端序列为靶序列，通过计算机搜索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌Era同源的EST序列，以此为线索，成功地克隆了人和小鼠的全长era-cDNA。其中人era-cDNA基因全长约2.2 Kb，含长度为1038 bp的开放读框，编码346个氨基酸的蛋白质。而小鼠era-cDNA基因全长约2.2 Kb，含长度为1306 bp的开放读框，编码311个氨基酸的蛋白质。mEra和hEra也是由N端的GTPase结构域和C端KH结构域所构成。有关mera和hera基因功能方面的研究至今还未见报道。第四军医大学硕士学位论文 在此基础上，本文分两部分对真核生物e厂a基因的功能进行了相关研究。本研究工作中，首先对小鼠Era蛋白进行了原核表达及纯化为进一步研究mera基因的功能打下了良好的基础。其次利用RNAi技术封闭人肿瘤细胞e厂a基因的表达观察细胞所发生的变化。 本文第一部分我们利用了本室自行构建的专门用于RNAi的shRNA表达载体，分别封闭了Hela，MCF一了，HHCC等多种肿瘤细胞e厂己基因的表达。由于在真核细胞中e厂a基因的表达水平很低，而且细胞裂解后Era往往在很短的时间内就会被蛋白酶所降解，因此在通过Western Blotting检测hera基因的RNA干涉效果时，采用通常的DAB或NBT/BCIP显色的方法，往往不能检测出细胞内Era的表达。我们在实验的基础上选择了含有NP一40、SDS和脱氧胆酸钠的RIPA细胞裂解液来处理细胞，并且在处理过程中低温裂解，低温离心，经蛋白定量对比，选择优化方案的细胞裂解液中蛋白含量比未采用优化方案的细胞裂解液中蛋白含量提高了5一10倍。为了提高Western Blofting的灵敏度，我们选择了更为灵敏的化学发光法检测Era的表达，确定了真核细胞Era蛋白WesternBIOtting检测的标准，从而证实了siRNA成功的抑制了Era蛋白的表达。为了进一步确定siRNA封闭eI’:基因的效果，我们通过间接免疫荧光法检测了和Hela细胞中e厂a基因的表达，实验结果进一步说明了RNA干涉能够特异地、有效的封闭目的基因的表达。 为了进一步分析人e厂a基因与细胞生长和细胞周期的关系，我们分别做了Hela细胞的细胞生长曲线和流式细胞仪检测，并且分别与吴元明博士所做的人正常胚胎肾细胞HEK293e厂a基因RNA干涉细胞株和董辆博士所做的e二基因突变细胞株的实验结果进行了比较、分析。结果表明，通过RNA干涉或者e厂a基因突变均可引起细胞生长的延迟，利用细胞计数法做细胞生长曲线证实， 3第四军医大学硕士学位论文封闭细胞he厂a基因表达，可以引起细胞生长曲线的右移;流式细胞仪分析表明，封闭细胞hera基因表达后，可引起GZ一M期细胞周期阻滞。目前董柯博士正在作的e厂a基因突变体的研究，也证实了era基因的突变会引起细胞生长曲线的右移，以及GZ一M期细胞周期阻滞的现象。我们现在已经知道e厂a基因与细菌的细胞周期相关，它对细胞周期的作用点在染色体分裂之后、细胞质分裂之前。这正与我们所做的he厂a基因功能的实验结果相吻合。因此，可以确定Era在真核细胞中与在原核细胞中一样都对细胞的生长发育过程有着重要的作用，通过RNA干涉实验和对e厂二基因突变体的研究的对比分析也更加明确地证实了Era对细胞周期的影响，表现为GZ一M期细胞周期阻滞。 为了研究Era对细胞形态的影响，我们分别用光镜及电镜观察了用RNA干涉e厂a基因对肿瘤细胞形态的影响，并与吴元明博士以及董辆博士的实验结果进行了比较分析，发现RNA千涉与e厂a基因突变的实验组细胞均有许多相似之处，具体表现在光镜下可见Hela细胞及人胚胎肾细胞HEK293体积明显增大，具有相同的多核仁改变，视野中分裂相细胞少见。这说明了Era可能会通过某种直接或者间接的途径影响细胞分裂，而当细胞内e厂a表达下降或者e厂a基因突变时，细胞内虽然己经完成了DNA的复制和蛋白质的准备，但是由于细胞内Era改变使细胞分裂停滞于分裂前期。但是对比 Hela细胞和HEK293细胞的超微结构也有一些不同的地方，主要表现在以下几个方面:Hela细胞的细胞形态更加不规则，细胞微绒毛粗大。细胞胞浆内粗面内质网及游离核糖体明显减少，而线粒体的体积增大，数量显着增多、聚集成团并靠近细胞膜。在肿瘤细胞的细胞核内异染色质明显增多，而在HEK293第四军医大学硕士学位论文细胞中则表现为常染色质多，异染色质少。细胞表面微绒毛较少。胞浆内游离核糖体多，粗面内质网少，线粒体内可见致密颗粒，波形蛋白丰富。少数细胞内可以见?
孙宏[4]2008年在《核受体介导的环境化学物内分泌干扰效应研究》文中认为环境中存在着大量人工合成的化学物,这些人类创新产物中的一部分可能会干扰人体内分泌系统的正常的功能,导致生殖内分泌系统肿瘤,不孕不育,甚至会影响到人类的生存繁衍,他们属于环境内分泌二扰物(EEDs)。本研究旨在通过建立核受体介导的in vitro报告基因试验方法(也称为转录激活试验),来研究这些环境化学物对雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)和甲状腺激素受体(TR)功能的干扰作用。受体报告基因试验是以受体介导理论为基础,应用基因重组技术,将报告基因置于外源性激素反应元件(HRE)的调控之下,构建重组报告基因载体,应用基因转染技术导入真核细胞内,通过检测化学物作用下报告基因编码的酶活性或蛋白表达的变化,间接反映内源性基因的表达情况。这种方法既可检测化学物与受体的结合能力,又可检测结合后引起的生物学效应,而且能够区分激动剂和拮抗剂,与受体结合试验相比可提供更多的信息,因此成为EEDs筛选的有力工具。针对ER、AR和TR叁种不同的核受体,我们的研究分为叁个部分,分别构建了相应的HRE调控的报告基因质粒,用来瞬时或者稳定转染不同的哺乳动物细胞,并且研究了环境化学物通过核受体介导的内分泌干扰效应。第一部分环境化学物雌激素干扰效应研究目的以虫荧光素酶(Luc)为报告基因,采用瞬时和稳定转染的方法建立ER介导的转录激活试验方法,为化学物拟/抗雌激素活性的检测提供研究工具。应用建立的方法评价烷基酚类(APs)、双酚A(BPA)、苯基苯酚等结构类似物和一些饮用水水源水样本的雌激素活性。方法1.将表达大鼠ERα的质粒rERα/pCI与重组Luc报告基因质粒pERE-aug-Luc、对照质粒phRL-tk共转染CV-1细胞,建立rERα介导的报告基因试验。以雌二醇(E_2)为阳性对照检测方法的筛选效率。CV-1细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的ER激动作用。2.将表达人ERα配体结合域和Gal4-BD(酵母转录因子结合域)融合蛋白的质粒pGal4-ERαdef与Gal4反应的报告基因质粒pUAS-tk-luc、对照质粒phRL-tk分别共转染MCF-7细胞,建立ER介导的报告基因试验。以E_2为阳性对照检测方法的筛选效率。MCF-7细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的ER激动作用。根据该物质能否拮抗E_2诱导的Luc表达,判断化学物的ER拮抗作用。3.采用稳定转染了pVit-tk-Luc质粒的MVLN细胞,接种到96孔板,染毒受试化学物,检测Luc的表达来研究化学物的拟雌激素活性。结果1.rERα报告基因试验方法的实际最低检测限为10~(10)M E_2,10~(-7)M达最大值,诱导倍数为溶剂对照的25.9倍,随着E_2染毒剂量的增加,在10~(-7)M E_2浓度后,Luc的表达量维持在较高的平台水平,EC_(50)为4.7nM。E_2对Luc诱导作用在组内变异系数(CV)为7.8%,组间CV为12.6%。2.hERα报告基因试验方法的实际最低检测限为0.5×10~(-10)M E_2,10~(-9)M达最大值,诱导倍数为溶剂对照的17.9倍,随着E_2染毒剂量的加大,在10~(-9)M E_2浓度后,Luc的量维持在较高的平台水平。EC_(50)为0.16nM。组内CV为6.7%,组间CV为12.8%。3.采用hERα介导的报告系统研究BPA、苯基苯酚和APs等化学物的拟雌激素活性,试验结果表明,随着取代基上碳原子数目从3增加到8,烷基酚及其结构类似化合物诱导Luc表达的能力也在逐步增加,但是所有受试物的拟雌激素活性均远远低于E_2。采用rERα介导的报告系统取得相似的结果,受试化学物的雌激素活性大小是4。丙基酚＜4-丁基酚＜4-戊基酚＜4-苯基苯酚＜4-辛基酚＜BPA。4.采用rERα报告基因系统研究饮用水源地采取的水样品的雌激素干扰活性,结果两个采样点的水样的200倍浓缩品均显示出拟雌激素的活性。5.0.5pM浓度的E2开始诱导MVLN细胞表达Luc,而到了50pM达到最高效应,最大诱导倍数为溶剂对照的4倍。结论1.本研究建立的ER报告基因试验具有较高的灵敏度和重复性。E_@对Luc的诱导是ER依赖性,并呈剂量-效应关系。以上结果表明本研究建立的方法能够有效地筛选ER激动剂和拮抗剂,可作为化学物(抗)雌激素活性筛选的理想模型。2.所研究的APs和BPA等化学物具有拟雌激素活性,其活性随着取代基大小的增加而增强。而且,体外筛选试验所采用的细胞系类型和ER的种属不影响APs及其类似物的雌激素活性的检测。3.所检测的饮用水水源水样本具有拟雌激素活性的能力。4.稳定转染pVit-tk-Luc质粒的MVLN细胞株能用来研究化学物雌激素干扰活性。第二部分环境化学物雄激素干扰效应研究目的采用瞬时和稳定转染方法,建立AR介导的Luc报告基因试验,为化学物拟/抗雄激素活性的检测提供研究工具。应用建立的方法研究一些常用农药和化学物的雄激素干扰活性。方法1.合成含四个ARE和一个TATA启动子的小鼠乳腺癌病毒长末端重复序列(MMTV-ETR),定向插入报告基因质粒pGL_3-basic的多克隆位点内切酶KpnⅠ和BglⅡ之间,构建受ARE调控的Luc报告基因质粒pMMTV-Luc。将该质粒与表达AR的质粒AR/pcDNA3.1和阳性对照质粒phRL-tk共转染CV-1,建立AR报告基因试验。以5α-双氢睾酮(5α-DHT)为阳性对照检测该方法的筛选效率。CV-1转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的AR激动作用;根据该物质能否拮抗5α-DHT诱导的Luc表达,判断化学物的AR拮抗作用。2.应用稳定转染了pMMTV-Luc质粒的MDA-kb2细胞,接种到96孔板上,单独或者与DHT共同染毒受试化学物,检测Luc表达研究化学物拟/抗雄激素作用。结果1.本方法的最低检测限为10~(-10)M 5α-DHT。5α-DHT对Luc诱导作用的组内CV为8.9%,组间CV为13.1%。对只转染pMMTV-Luc和phRL-tk而不转染AR/pcDNA3.1的CV-1染毒,5α-DHT不诱导Luc的表达。5α-DHT对共转染叁种质粒的CV-1的诱导作用表现为:10~(-10)M的5α-DHT显着诱导Luc的表达,10~(-7)M时达最大值,诱导倍数为61.83,随着5α-DHT染毒剂量的加大,在10~(-7)M-10~(-6)M范围内Luc的表达量维持在较高的平台水平,计算其半数效应浓度EC_(50)为3.65 nM。糖皮质激素受体(GR)激动剂地塞米松(dexamethasone)不诱导Luc的表达。AR拮抗剂尼鲁他明(nilutamide)和氟鲁他明(flutamide)在10~(-7)M-10~(-5)M浓度范围内显着拮抗1nM的5α-DHT诱导的Luc的表达,其半数抑制浓度(IC_(50))分别为4.05μM和3.49μM。2.在对农药的AR激动作用进行检测时发现氰戊菊酯(Fen)、氯氰菊酯(Cyp)、氯菊酯(Per)以及3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)对Luc没有明显的诱导作用。在进行AR拮抗作用检测时发现:Fen、Cyp、Fer以及3-PBA在10~(-4)M的浓度均能显着拮抗1nM的5α-DHT诱导的Luc的表达。IC_(50)分别为0.37mM、0.42mM、0.43mM和1.21mM。3.双酚A(BPA)、四氯双酚A(TCBPA)和五氯酚(PCP)单独染毒不能的诱导Luc表达。PCP不能拮抗1nM浓度的5α-DHT诱导的Luc的表达。BPA的浓度为10~(-7)M时对5α-DHT无明显的拮抗作用,随着染毒浓度的加大,在10~(-6)M和10~(-5)M时能拮抗1 nM 5α-DHT诱导的Luc的表达,差异有显着性,其IC_(50)为2.14μM。10~(-5)M浓度的TCB能够显着性抑制1nM 5α-DHT诱导的Luc表达,其IC_(50)为10.45μM。4.10~(-10)M DHT开始诱导MDA-kb2细胞系表达Luc,而到10~(-8)M浓度时,作用达到平台期,诱导倍数为对照的9倍左右。结论1.本研究建立的AR报告基因试验具有较高的灵敏度和重复性。5α-DHT对Luc的诱导是AR依赖性,并呈剂量-效应关系。该方法不存在与GR激动剂地塞米松的交叉反应,具有较高的特异性。本方法能够检出AR拮抗剂尼鲁他明和氟鲁他明对5α-DHT作用的拮抗作用。以上结果提示本研究建立的方法能够有效地筛选AR激动剂和拮抗剂,可作为化学物(抗)雄激素活性筛选的理想模型。2.Fen、Cyp、Per和3-PBA无AR激动作用,但他们都能拮抗雄激素的功能。3.BPA、TCBPA和PCP无AR激动作用;BPA和TCBPA能拮抗雄激素功能;PCP未表现出对雄激素的拮抗作用。4.稳定转染了pMMTV-Luc质粒的MDA-kb2细胞株能够用来研究化学物雄激素干扰活性。第叁部分环境化学物甲状腺激素干扰效应研究目的建立瞬时转染的TR介导的Luc报告基因试验体系,以及对甲状腺激素反应的GH_3细胞增殖试验,为化学物拟/抗甲状腺激素活性的检测提供研究工具。应用建立的方法研究一些常用农药和化学物的甲状腺激素干扰活性。方法1.采用无血清的PCM培养基配方培养GH_3细胞,在2500细胞/孔的密度种植到96孔板中,检测T_3和受试化学物对细胞增殖的影响。2.将表达人甲状腺激素受体的质粒pCMX-hTRβ和含甲状腺激素反应元件DR4的重组报告基因质粒pDR4-tk-CAT以及内参pSV-β-Gal共同转染到CV-1细胞内,建立hTRβ介导的报告基因试验方法。以T_3作为阳性对照来检测方法的筛选效率。CV-1细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的TR激动作用,根据该物质能否拮抗T_3诱导的Luc表达,判断化学物的TR拮抗作用。3.将表达人TRβ配体结合域和Gal4-BD(酵母转录因子结合域)融合蛋白的质粒pGal4-L-TRβ与Gal4反应的报告基因质粒pUAS-tk-luc、对照质粒phRL-tk共转染HepG_2细胞,建立TR介导的报告基因试验,以T_3为阳性对照检测方法的筛选效率。CV-1细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的TR激动作用。根据该物质能否拮抗T_3诱导的Luc表达,判断化学物的TR拮抗作用。结果1.1nM浓度的T_3能够诱导相对于溶剂对照3倍的GH_3细胞的表达。OH-PCB_(106)和1nM T_3共同染毒GH_3细胞,结果表明:OH-PCB_(106)在10~(-9)M以上浓度时,能够抑制1nM T_3诱导的GH_3细胞的增殖2.采用CAT报告基因研究OH-PCB_(106)抗甲状腺激素作用时,10nM T_3能够诱导3倍于对照的CAT的表达。10~(-11)M浓度的OH-PCB_(106)就能够抑制10nM T_3对CAT活性的诱导,随着PCB浓度的增加,这种抑制作用的增加不是很明显,直到增加到10~(-5)M浓度,才与10~(-11)M出现显着性下降。3.TR介导的Luc报告基因试验的最低检测限为10~(-11)M T_3,10~(-8)M时达最大值,诱导倍数为7.85,随着T_3染毒剂量的加大,在10~(-8)M-10~(-6)M范围内Luc的表达量维持在较高的平台水平,计算其半数效应浓度EC_(50)为0.46nM。采用48孔板,10~(-9)M的T_3对Luc诱导作用组内变异系数为5.9%,组间的变异系数11.7%。4.农药甲萘成和它的代谢产物1-萘酚以及结构类似物2-萘酚叁种受试物在10~(-4)M及以下浓度时,都不能诱导Luc表达,而叁者在10~(-5)M及以上浓度都可以不同程度抑制5nM T_3诱导的报告基因表达,IC_(50)分别为8.40×10~(-5)M,7.62×10~(-5)M和7.73×10~(-5)M。结论1.在体外,OH-PCB_(106)具有抑制甲状腺激素活性能力。2.本研究建立的TR介导Luc报告基因试验具有较高的灵敏度和重复性,能够有效地筛选AR激动剂和拮抗剂,可作为化学物(抗)甲状腺激素活性筛选的理想模型。3.甲萘威、1-萘酚和2-萘酚能够拮抗T_3的功能。
黄曼婷[5]2005年在《17β-雌二醇对骨外膜来源骨原细胞作用的研究》文中研究表明研究背景 绝经后卵巢功能减退、雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症发生的重要因素。由于人口的老龄化，骨质疏松症在世界范围内影响着数以百万计的妇女，造成相当高的发病率和死亡率。至今，雌激素对骨质疏松发病的分子机理尚不十分清楚。多年来关于雌激素对成骨功能影响的研究热点主要集中在骨髓基质干细胞。骨髓基质中干细胞仅为成骨细胞祖细胞的来源之一，成骨细胞祖细胞的另一来源．骨膜中的骨原细胞却被忽视。 在临床观察中可以发现完整的骨膜套对于骨损伤的修复发挥着关键的作用。2003年Ahlborg等人研究了绝经15年妇女皮质骨下骨吸收和骨膜成骨的关系，发现皮质骨下骨吸收越多的妇女骨外膜成骨也越多，虽然骨髓腔向外扩张，但皮质骨的厚度并没有变薄，横切面上的骨面积增加，这有助于增加横切面上的骨量，减少骨的净丢失量。骨强度不仅依赖于骨的材料特性，如：骨密度、骨组织的矿化含量，也依赖于骨骼的结构特性，如：骨骼大小、形态和叁维结构等。绝经后骨外膜成骨增加，骨骼的大小增加，部分抵消了由于骨量下降造成的骨强度下降。所以骨外膜成骨是一个被忽略的影响骨强度的重要因素。这为我们寻找预防和治疗骨脆性增加性疾病提供了新思路：鉴于骨外膜成骨的独特生物力学优势，骨膜-骨衬细胞将成为新的药物治疗靶点。 研究目的 1．建立研究骨膜成骨的大鼠颅骨骨外膜细胞的体外培养模型。 2．探讨不同浓度17β-雌二醇对骨外膜来源骨原细胞的增殖作用的影响。 3．探讨不同浓度17β-雌二醇对骨外膜来源骨原细胞各种功能相关的基因表达水平的影响。 4．构建雌激素作用前后人骨外膜细胞差异表达基因文库，研究雌激素对人骨外膜细胞基因表达的调控，寻找雌激素作用的靶基因。 材料和方法 1、大鼠颅骨骨膜细胞的体外培养模型的建立
关铮[6]2008年在《应用BERKO和SCID小鼠模型对ERβ与子宫内膜异位症相关性研究》文中研究指明目的:研究雌激素受体不同亚型在子宫内膜异位症及子宫腺肌症病灶中的分布规律及与内异症相关的部分因子(OTR、COX-2等)之间的关系,在雌激素β受体基因敲除小鼠及SCID小鼠建立子宫内膜异位症模型,探讨雌激素β受体在子宫内膜异位症及子宫腺肌症发病过程中的作用,为临床应用雌激素β受体激动剂WAY-200070治疗子宫内膜异位症提供实验数据。方法:1)收集正常子宫内膜、正常子宫肌肉、子宫内膜异位症在位内膜、卵巢子宫内膜异位囊肿及子宫腺肌症组织标本,利用Western blotting、RT-PCR、ELISA及免疫组织化学方法检测上述组织内ERα、ERβ、COX-2、OTR等蛋白含量及分布;2)利用雌激素β基因敲除小鼠建立子宫内膜异位症模型,研究ERβ在先天缺乏时对内异症病灶形成的影响;3)分别用人正常子宫内膜、内异症在位内膜、子宫腺肌症病灶及卵巢异位囊肿壁在SCID小鼠建立子宫内膜异位症模型,同时注射雌激素β受体激动剂WAY-200070 14天,然后处死小鼠取出病灶观察ERβ对异位病灶形成的影响。结果:1)在不同组织中均有ER的表达,但ERα含量高于ERβ;OTR及COX-2在内异症在位子宫内膜中的蛋白含量明显高于正常内膜,与在位内膜中ERα含量呈正相关,与ERβ无明显相关性。2)应用Westernblotting和RT-PCR方法检测子宫腺肌症病灶内各种受体蛋白含量与其他部位比较,ERα和ERβ蛋白含量明显低于其他各组,OTR和COX-2明显高于其他各组;但免疫组化法显示ERα、ERβ在异位病灶及在位子宫内膜中的表达均高于正常子宫内膜。3)卵巢子宫内膜异位囊肿壁内各种受体蛋白含量与其他部位比较,OTR和COX-2蛋白含量显着高于正常内膜和在位内膜;ERα显著低于正常子宫内膜和在位内膜;而ERβ则无明显差异。4)雌激素β受体基因敲除小鼠子宫内膜异位症模型与同源非敲除小鼠比较无显著差异(P＞0.05),但卵巢切除否对异位病灶的形成有明显影响(P＜0.05)。5)利用不同组织在SCID小鼠建立异位症模型后应用雌激素β受体激动剂WAY-200070,发现正常子宫内膜、在位内膜及卵巢异位囊肿壁模型组病灶重量在种植后有明显缩小(P＜0.05),但与对照组比较无显着差异(P＞0.05);而子宫腺肌症病灶用药组重量缩小的差值与对照组比较有差异(P=0.03)。结论:在正常子宫内膜、子宫肌肉、内异症子宫在位内膜、卵巢异位囊肿及子宫腺肌症病灶内均有ER的表达,但ERβ含量明显低于ERα。应用ERβ基因敲除小鼠建立子宫内膜异位症模型显示ERβ存在与否对异位病灶的形成无明显影响,而雌激素β受体激动剂WAY-200070对SCID小鼠内异症模型的病灶发展亦无明显影响,提示ERβ对子宫内膜异位症及子宫腺肌症的发病作用影响微弱。
张可丽[7]2009年在《中药植物雌激素对人晶状体上皮细胞雌激素受体表达的影响及其信号转导机制的研究》文中研究说明研究目的本课题拟研究人晶状体上皮细胞(Lens epithelial cell,LEC)雌激素受体表达的情况及中药植物雌激素异补骨脂素(Isopsoralen)和蜕皮甾酮(Ecdysterone)对受体表达的影响,并探讨其细胞信号转导机制,为中药植物雌激素防治老年性白内障提供科学的实验依据。研究方法本研究采用ECR和ISR与人晶状体上皮细胞(HLEC)共同孵育,以雌二醇(β-Estradiol,E_2)作为阳性对照,再用H_2O_2对HLEC造成氧化损伤后,进行下列研究。1.采用流式细胞术(Flow Cytometer,FCM)检测不同浓度的ECR和ISR作用于经H_2O_2处理的HLEC的雌激素受体a(estrogen receptor a,ERa)蛋白的表达变化,探讨ECR和ISR对HLEC的抗氧化损伤作用及机制;2.采用流式细胞术(Flow Cytometer,FCM)检测不同浓度的ECR和ISR作用于经H_2O_2处理的HLEC的雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)蛋白的表达变化,探讨ECR和ISR对HLEC的抗氧化损伤作用及机制;3.采用流式细胞术(Flow Cytometer,FCM)检测一定浓度的ECR和ISR作用于经H_2O_2处理的HLEC的磷酸化的ERK蛋白的表达变化,探讨ECR和ISR对HLEC的抗氧化损伤的细胞信号转导机制。研究结果一、FCM检测经H_2O_2处理的HLEC上ERa蛋白的表达1.正常HLEC内存在ERa的表达;2.H_2O_2组HLEC内ERa表达明显下降,与空白组比较有非常显着性差异(p＜0.01);3.E_2、ECR、ISR高中低浓度组的HLEC内ERa表达明显升高,与H_2O_2组比较有非常显着性的差异(p＜0.01);且随ECR和ISR浓度的增高HLEC内ERa表达逐渐升高,并呈明显的浓度依赖关系。二、FCM检测经H_2O_2处理的HLEC上ERβ蛋白的表达1.正常HLEC内存在ERβ的表达;2.H_2O_2组HIEC内ERβ表达明显下降,与空白组比较有非常显着性差异(p＜0.01);3.E_2、ECR、ISR高中低浓度组的HLEC内ERβ表达明显升高,与H_2O_2组比较有非常显着性的差异(p＜0.01);且随ECR和ISR浓度的增高HLEC内ERβ表达逐渐升高,并呈明显的浓度依赖关系。叁、FCM检测经H_2O_2处理的HLEC上不同时段的磷酸化的ERK蛋白表达1、正常HLEC内存在p-ERK的表达,并在6h时出现峰值。2、H_2O_2作用于HLEC后,HLEC内p-ERK的表达量随作用时间延长呈逐渐下降趋势,在0.5h时其值显着高于正常组;H_2O_2用1h时后,其值显着低于正常组,各时段值与空白组比较有显着性差异(p＜0.01);3、E_2作用于HLEC以后,HLEC内p-ERK的表达随作用时间延长呈逐渐升高,6h后各时段p-ERK表达量显着高于同时段H_2O_2组(p＜0.01),且在6h时出现峰值;4、中浓度ECR作用于HLEC 3h以后,各时段p-ERK表达量较同时段H_2O_2组显着升高(p＜0.01),且在12h时出现峰值;5、中浓度ISR作用于HLEC1h以后,各时段p-ERK表达量较同时段H_2O_2组显着升高(p＜0.01),且在1h时出现峰值。研究结论1.正常HLEC上存在ERα、ERβ、p-ERK表达。2.H_2O_2能下调HLEC的ERα、ERβ表达。3.E_2、ECR、ISR能上调经H_2O_2处理的HLEC的ERα、ERβ表达,并呈明显的浓度依赖关系:E_2、ECR、ISR的抗氧化损伤作用,可能是通过上调经HLEC的ERα、ERβ表达实现的。4.经H_2O_2处理的p-ERK表达量随时间的延长而减少。5.E_2、ECR、ISR各组p-ERK表达量分别在作用6h、12h、1h时达到高峰。6.E_2、ECR、ISR的抗氧化损伤作用,可能与ERK/MAPK信号通路有关。
傅佩芬[8]2013年在《胰岛素样生长因子1受体在乳腺癌中的表达及临床意义》文中提出第一部分实验目的：胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)在乳腺癌的发生发展中起着重要作用,目前已成为靶向治疗新的热点方向。然而,IGF1R同预后的相关性长期以来一直存在着争议。本研究将从IGF1R基因拷贝数、基因表达和蛋白表达叁个方面来全方位分析这一分子标志物与预后的关系,以期为今后的靶向治疗提供合适的指标。材料与方法：通过对325名原发浸润性乳腺癌患者的肿瘤标本进行包括基因拷贝数、mRNA表达和蛋白表达的全面综合分析,评估IGF1R表达情况与临床病理因素和预后的相关性。结果：IGF1R mRNA水平不仅与蛋白表达相关,还和许多临床病理因素及预后有高度相关性。低组织学分级、腋窝淋巴结阴性、激素受体阳性、Her2阴性、Ki67阴性以及luminal亚型肿瘤显示高表达IGF1RmRNA.在单变量分析中,IGF1RmRNA与较好的RFS和BCSS相关；在多变量分析中,仍然是BCSS的独立预后因子。IGF1R蛋白表达在单变量分析中与延长的BCSS有关。IGF1R基因拷贝数与mRNA或蛋白表达无明显相关性,并且未发现有预后意义。在Luminal肿瘤亚型中,IGF1RmRNA高表达提示更好的BCSS.结论：原发性乳腺癌中IGF1RmRNA和蛋白表达具有相关性,而IGF1RmRNA表达则可以作为预后指标。这些研究结果将为IGF1R靶向治疗提供重要信息。第二部分实验目的：IGF1R被认为在浸润性乳腺癌的发生及发展过程中起到重要作用。本实验通过定量检测浸润性乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本中IGF1R的基因含量,来证实FFPE标本是否与冰冻组织(FF)标本检测结果具有相关性,判断其与传统乳腺癌临床病理因素的关联,进而评价其是否可以作为独立的乳腺癌预后分子,并且评估乳腺癌FFPE标本对浸润性乳腺癌诊断治疗的价值。材料与方法：我们收集了77对乳腺癌FF及FFPE标本,用qRT-PCR定量检测两种标本中的IGF1R基因表达量,并判断其是否有关联。此外,我们还应用了一个260例乳腺癌FFPE标本集合去分析乳腺癌FFPE标本中IGF1R基因的定量检测对乳腺癌预后判断的可行性。结果：从95.4%的FFPE标本中提取出的总RNA含量都在30ng/μL以上,而大约有90%的FFPE标本成功实施了基于Taqman探针的实时定量PCR检测。结果表明,IGF1R的表达量在两种标本(FF和FFPE)中有显着的相关性(秩相关系数为0.74),且都与IGF1R的蛋白表达呈正相关。Kaplan-Meier生存曲线表明,IGF1R的mRNA水平越高,病人RFS和BCSS越长。结论：从乳腺癌FFPE标本中定量分析IGF1R基因的含量不但可行,而且还可以为判断浸润性乳腺癌的生物学行为及预后提供可靠依据。第叁部分实验目的：前两部分研究结果已经证实乳腺癌中IGF1R mRNA的表达可以作为乳腺癌预后的指标,IGF1R mRNA和蛋白存在明显正相关,但IGF1R mRNA和蛋白表达的调控机制并不清楚。材料与方法：选取不同的乳腺癌细胞株,包括ER阳性和ER阴性的细胞株,检测其IGF1RmRNA和蛋白表达差异；并用IGF-1因子激活IGF1R通路,观察IGF1RmRNA和蛋白表达变化；进一步,采用染色体蛋白免疫共沉淀(ChIP)的方法,检测IGF1R蛋白与IGF1R DNA启动子区域是否结合。结果：ER阳性和ER阴性乳腺癌细胞的IGF1R表达存在明显差异,ER阳性的细胞IGF1RmRNA和蛋白表达明显较ER阴性的细胞高；IGF-1激活IGF1R通路后,可以促进IGF1RmRNA和蛋白表达增高；ChiP结果显示,在不同细胞株内,均发现IGF1R蛋白与IGF1R基因启动子区域的结合。结论：IGF1R的表达与ER状态相关,提示ER可能参与IGF1R的表达；IGF1R蛋白可以通过与自身基因的启动子区域结合,促进IGF1R mRNA转录增多,而mRNA表达上调可能进一步促进蛋白表达增多,从而导致IGF1R的mRNA表达与其蛋白表达成正相关。
参考文献：
[1]. 人era基因的表达分布及其功能的相关研究[D]. 纪宗玲. 第四军医大学. 2001
[2]. 从细胞生长和乙醇诱导细胞凋亡的角度初步探讨hEra的功能[D]. 郭向云. 第四军医大学. 2010
[3]. 用RNA干涉研究人era基因的功能[D]. 杜孟刚. 第四军医大学. 2004
[4]. 核受体介导的环境化学物内分泌干扰效应研究[D]. 孙宏. 南京医科大学. 2008
[5]. 17β-雌二醇对骨外膜来源骨原细胞作用的研究[D]. 黄曼婷. 中国协和医科大学. 2005
[6]. 应用BERKO和SCID小鼠模型对ERβ与子宫内膜异位症相关性研究[D]. 关铮. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[7]. 中药植物雌激素对人晶状体上皮细胞雌激素受体表达的影响及其信号转导机制的研究[D]. 张可丽. 福建中医学院. 2009
[8]. 胰岛素样生长因子1受体在乳腺癌中的表达及临床意义[D]. 傅佩芬. 浙江大学. 2013