一、DNA fragmentation in apoptosis and homeostasis（论文文献综述）
牛统娟[1]（2021）在《常温保存过程活性氧诱导猪精子凋亡的研究》文中研究表明畜牧业是国民经济的基础产业和农村经济的支柱产业,养猪业是畜牧业的重要组成部分,在国民经济发展中具有重要意义。而人工授精技术在现代化养猪业发展过程中发挥重要作用,是提高猪肉产品质量、促进品种改良及生猪养殖规模化的重要技术手段。精液保存是家畜人工授精技术中重要的环节。猪精液通常在常温下保存以保证精子在体外的活力和受精能力。但精子在体外保存过程中,精子受活性氧（Reactive oxygen species,ROS）等不利因素的影响,精液品质不断下降,不利于人工授精技术的广泛应用。然而,ROS诱导的精子凋亡在猪精液常温保存中的分子机理尚不清楚。因此,本研究分析了常温保存过程中猪精液品质与ROS水平的相关性,并探讨了常温保存过程ROS诱导的线粒体损伤对猪精子凋亡的作用,同时研究了ROS清除剂姜黄素和N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）对常温保存猪精子的抗凋亡作用,以期提高猪精液常温保存效果。本研究获得以下主要结果:1.本试验使用自配稀释液将猪精液常温保存9 d,在保存不同阶段测定精子活率、质膜和顶体完整率等指标,并分析了ROS水平与精液品质之间的相关性。在常温保存过程中,精子活率、精子质膜和顶体完整率以及抗氧化性能均显着降低,ROS水平显着升高,ROS水平与常温保存猪精液品质呈显着负相关。其中,精子活率在保存前1 d无显着变化,从保存第3 d开始显着降低（P<0.05）,第7 d时降低至65.45%±1.13%。精子质膜和顶体完整率在保存第7 d时显着低于第0 d（P<0.05）,且在保存第7 d时分别为64.45%±2.23%和65.78%±2.95%,因此本试验中猪精液有效保存时间为7 d。保存第3 d精子ROS水平显着高于第0 d和第1 d（P<0.05）,第7 d精子ROS水平显着高于第5 d（P<0.05）;ROS的过量产生导致精子膜结构过氧脂质化,与保存第0 d相比,常温保存第7 d精子T-AOC和抗氧化酶（CAT、SOD、GPX）活性显着降低（P<0.05）,MDA含量显着升高（P<0.05）。本研究表明在猪精液常温保存过程中ROS的过量产生导致精液品质下降。2.本试验通过在猪精液常温保存不同阶段检测精子凋亡水平等指标,表明精子在常温保存过程中ROS诱导线粒体损伤,并导致精子凋亡,且精子ROS水平与线粒体膜电位（r=-0.979）、ATP含量（r=-0.804）、精子凋亡水平（r=0.949）及线粒体T-AOC（r=-0.789）均呈显着相关关系。其中,线粒体内MDA含量在保存第3 d和第7 d时均高于第0 d（P<0.05）;精子线粒体内抗氧化酶不足以清除过多的ROS,导致保存第7 d线粒体T-AOC和抗氧化酶（CAT、SOD、GPX）活性显着低于第0 d（P<0.05）;保存第3 d和第7 d精子线粒体膜电位均显着低于第0 d（P<0.05）,且精子ATP含量在保存第7 d显着低于第0 d（P<0.05）,线粒体膜结构和功能损伤,导致精子凋亡。保存第3 d和第7 d精子凋亡水平显着高于第0 d（P<0.05）。本研究表明在猪精液常温保存过程中ROS的过量产生导致精子线粒体损伤,从而导致精子凋亡。3.为研究ROS清除剂姜黄素和NAC对常温保存过程ROS诱导的猪精子凋亡的影响,本试验在精液常温保存稀释液中分别添加姜黄素（0、5、10、15、20μmol/L）和NAC（0、12.5、25、50、100μmol/L）保存3 d后检测精子活率。试验结果表明添加15μmol/L姜黄素和50μmol/L NAC时精子活率显着高于对照组（P<0.05）,保存第3 d时精子活率分别为84.37%±0.42%和86.24%±1.12%。在稀释液中添加15μmol/L姜黄素和50μmol/L NAC后保存猪精液,研究表明姜黄素和NAC处理组精子ROS水平显着低于对照组（P<0.05）,线粒体膜电位显着高于对照组（P<0.05）。通过凋亡级联通路分析发现,姜黄素和NAC处理组线粒体细胞色素C（Cyt C）显着高于对照组（P<0.05）,而胞质内Cyt C显着低于对照组（P<0.05）;通过Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达水平,结果表明姜黄素和NAC处理组Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9及促凋亡蛋白BAX的表达水平显着低于对照组（P<0.05）,且姜黄素和NAC处理组抗凋亡蛋白BCL-2的表达量显着高于对照组（P<0.05）;姜黄素和NAC处理组精子凋亡水平显着低于对照组（P<0.05）。本研究表明姜黄素和NAC可通过清除ROS抑制常温保存过程中猪精子线粒体依赖性凋亡。因此,在猪精液常温保存过程中,ROS的过量产生导致精子线粒体抗氧化性能降低,线粒体膜结构和功能受损,ATP含量降低,从而引发精子凋亡。在精液常温保存稀释液中添加15μmol/L姜黄素和50μmol/L NAC能够通过清除精子ROS提高线粒体膜电位,降低细胞促凋亡蛋白BAX的表达,提高抗凋亡蛋白BCL-2的表达,抑制线粒体内Cyt C释放至胞质,阻止Caspases通路的激活,抑制精子凋亡,提高精液品质。
王玲丽[2]（2021）在《两种禾本科植物髓腔形成过程中细胞程序性死亡特征及其机制研究》文中指出植物茎髓腔（pith cavity）是茎节间中空部分,是植物茎内中央基本组织细胞或髓细胞在茎生长过程中逐渐降解而形成的空腔。髓腔在水生植物种类中普遍存在,在陆生植物种类中也较常见,如小麦、水稻、竹等植物中。髓腔的形成是髓细胞死亡而引起的,在水生植物中主要作为气体交换的通道,在陆生植物中可减少植物体生长过程中营养物质的消耗,另外空心结构的发生有助于茎具有柔韧性,使植物不易折断或倒伏,确保能更好地支撑植物体地上部分。细胞程序性死亡（PCD）是植物生命活动中重要的细胞学事件,在植物体的生长发育过程中,PCD贯穿于植物生活史的全过程,在植物形态建成、生长发育、有性生殖及相应环境胁迫等过程中发挥着重要作用。为探讨植物茎髓腔发生的PCD过程,本研究以禾本科植物水稻和小麦为研究对象,选取幼茎不同发育阶段的实心期（Stage 1,S1）、空腔出现期（Stage 2,S2）、空腔扩大期（Stage 3,S3）和髓腔成熟期（Stage 4,S4）四个时期的髓组织,通过光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜在细胞学上研究髓细胞死亡过程中细胞核、液泡、线粒体、细胞膜及细胞壁等细胞结构的变化,分析探讨髓细胞死亡的特征。研究结果表明两种植物在髓细胞死亡过程中具有相似的特征。在茎发育早期,髓细胞体积较小,排列紧密,无胞间隙,细胞核大,位于细胞中央,细胞质浓,细胞核和主要细胞器线粒体结构完整,被膜清晰;此时细胞中几乎没有液泡;细胞膜和细胞壁结构整齐。随着茎的发育,髓细胞体积增大,细胞中出现了许多小液泡,随后相互融合形成中央大液泡。同时,液泡在液泡膜多处以内陷方式吞入细胞质基质和部分线粒体等细胞器,被液泡膜包裹的这些小体在液泡水解酶的作用下发生降解。此时细胞核固缩,染色质凝集,核被膜破裂;被液泡挤向边缘的细胞器也开始发生降解,线粒体肿胀,进一步被膜破裂;细胞膜与细胞壁发生分离,细胞膜在多处向胞质内折,同时观察到大量泡状结构存在,细胞壁最后发生降解,是髓细胞死亡的最后事件。通过荧光显微镜观察,DAPI染色和TUNEL检测结果显示在茎发育早期阶段,髓细胞核呈圆形,形态规则,DAPI染色均匀,TUNEL检测为阴性;随着茎的发育,髓组织中出现空腔并进一步扩大,DAPI染色显示细胞核结构畸形,染色不均匀,TUNEL检测为阳性。以上研究结果表明髓腔在发生时髓细胞的死亡是典型的PCD过程。为进一步探讨髓细胞发生PCD的具体机制,对小麦幼茎不同发育时期的髓组织进行了转录组测序,追踪与细胞程序性死亡相关的基因,对四个不同发育时期样本和相关基因表达间的关系进行层级聚类,使用热图呈现聚类结果。结果表明大部分与PCD相关的基因在空腔出现期和空腔扩大期表达水平上调,有的基因在实心期就开始发生表达上调;而在髓腔成熟期时,这些相关基因几乎都发生了表达水平下调,这说明在髓腔成熟期,细胞不再发生PCD事件。将这些与PCD相关的基因按功能进行归类,通过q RT-PCR对其表达水平进行检测验证,结果表明q RT-PCR检测结果与转录组测序结果相互吻合。通过转录组测序发现ACC合成酶（ACS）基因ACS的表达水平在实心期就显着上调,这与乙烯合成途径中ACS是乙烯合成上游途径的关健酶相关,而乙烯合成的关健限速酶ACC氧化酶（ACO）基因ACO的表达在时间和空间上相对滞后,在空腔出现期表达量达到最大。通过免疫印迹对ACO进行定位发现该酶在空腔出现期含量最高,该结果与转录组测序结果和q RT-PCR验证相互一致,进一步说明乙烯作为作为信号分子参与了髓腔发生的PCD过程。钙调蛋白基因（CAM）和钙网蛋白基因（CRT）基因在实心期和空腔出现期相对表达量较高,说明钙离子作为信号分子也参与了PCD过程。ACS、ACO、CAM和CRT基因在实心期及空腔出现期相对表达量较高,说明在茎发育过程中钙离子和乙烯作为上游信号分子共同参与了髓细胞的PCD过程。与活性氧（Reactive oxygen species,ROS）相关的基因中,过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽S转移酶（GST）基因在空腔出现期和扩大期相对表达量较高,说明在髓腔形成的PCD过程中,细胞内了产生了大量ROS。纤维素酶基因（CELLULASE）在空腔扩大期相对表达量最高,这和髓细胞PCD中细胞壁最后降解事件相互吻合。另外线粒体中凋亡诱导因子基因（Apoptosis-Inducing Factor,AIF）、细胞色素c氧化酶亚基6B基因（Cytochrome c Oxidase Subunit 6B,COX6B）和交替氧化酶基因（Alternative Oxidase 1a,AOX1a）及核酸内切酶基因（BIFUNCTIONAL NUCLEASE 1,BFN1）和核糖核酸酶基因（RIBONUCLEASE 3,RNS3）均参与了髓细胞的PCD。半胱氨酸蛋白酶基因PBA1和凋亡蛋白酶激活因子1基因（Apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1）在实心期就大量表达,这可能与髓细胞在发育早期已决定发生PCD的命运相关。通过DNA凝胶电泳对不同发育时期髓组织核DNA进行研究,发现两种植物均在空腔出现期和扩大期呈现DNA条带显着的拖尾现象,说明在这两个时期DNA均发生了降解,进一步证明髓细胞的死亡是典型的PCD过程。Caspase 3-like免疫组化结果表明Caspase 3-like在髓腔发育早期位于细胞核中,可能与染色质浓缩和DNA片段化紧密相关;免疫印迹发现Caspase 3-like在空腔出现期和扩大期的髓细胞中含量居高,说明Caspase 3-like在髓腔发生的PCD过程中发挥着重要作用。通过罗丹明123（Rh123）对不同发育时期线粒体进行染色,发现在空腔出现期和扩大期时线粒体荧光强度降低,说明这两个时期线粒体膜结构破坏,这与电镜下所观察的线粒体在空腔出现期体积肿胀,膜结构破坏的结果相互一致。通过免疫组化、免疫印迹、免疫荧光和免疫胶体金电镜技术分别对线粒体中细胞色素c（Cytochrome c,Cyto c）进行了定位研究。免疫组化结果表明:在空腔出现期和扩大期,Cyto c在细胞质中呈阳性反应。对线粒体提取液及线粒体提取后的细胞质基质进行蛋白免疫印迹,结果表明在空腔出现期和扩大期中,线粒体提取液中Cyto c含量很少。与其相反的是,在这两个时期细胞质基质中有大量Cyto c存在,说明Cyto c在这两个时期已从线粒体释放至细胞质基质。通过免疫胶体金电镜技术进一步对Cyto c的空间位移进行了定位,发现Cyto c金颗粒在茎发育早期主要存在线粒体中,随着茎的发育,Cyto c金颗粒从线粒体释放至细胞质基质中。通过以上不同方法所得的结果均说明在髓腔形成过程中,Cyto c随着线粒体被膜的破裂,从线粒体中释放至细胞质基质,该研究表明线粒体和Cyto c在小麦茎髓细胞PCD过程中发挥了重要作用。
张炎[3]（2021）在《肝癌自发性破裂的相关基因组学研究》文中进行了进一步梳理1研究背景与目的目前主要观点认为原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的发生发展是环境因素和遗传因素双重作用的结局。其发展过程也是一种多因素协同作用和多步骤的过程,在众多环境因素中如,HBV（Hepatitis B virus）感染、HCV（Hepatitis C virus）感染、含有黄曲霉素B1食物污染、水污染和酗酒等都是明显提高HCC发病率的重要因素。从遗传因素方面来说,肝癌是一种遗传物质发生改变的疾病。一些病因如HBV/HCV感染、黄曲霉素B1食物污染和酒精等损害了正常肝细胞基因组,使其形成一种不可逆的损伤,从而引起抑癌基因失活或者原癌基因的活化,导致正常肝脏细胞的增殖、分化和凋亡的规律发生异常改变从而导致肿瘤的发生和发展。肝癌自发性破裂出血（Ruptured HCC,RHCC）是肝脏恶性肿瘤发生发展过程中引起的另一种最严重且致命的症状之一。若不能对该并发症进行正确及时地治疗,患者在发生破裂出血的一个月内病死率可高达25%以上。仅控制肝脏肿瘤的破裂出血并不是对肝癌患者治疗的最终目的,临床上的最终治疗目的是最大限度地延长肝癌患者的生存时间。近年来,随着基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的发展,对肿瘤系统生物学的研究也渐渐地发展起来。在肿瘤系统生物学理论的指导下将基因表达与翻译,结构与功能蛋白质的表达和相互作用,后期各种产物的代谢途径等有关信息进行充分整合,为肿瘤疾病提供了不同种类、不同层次的生命组学数据,进一步理解肿瘤的发生和发展机制。本研究中,从RHCC患者的临床特点以及肿瘤的病理学特征到肝癌破裂患者的遗传易感性和基因表达谱的多层次研究,以提高对RHCC的全面认识,为未来对于RHCC的早期预防、RHCC高危人群的筛查诊断和RHCC治疗方案的设计以及发生肝癌破裂出血的患者预后生存改善提供一定的理论支持。2材料与方法2.1研究对象研究对象来源于2002年至2020年期间就诊于我院诊断为原发性肝细胞肝癌的1543例患者,其中出现肝癌自发性破裂出血的患者186例,定义为破裂组（RHCC）。未出现原发性肝癌破裂的患者1357例,定义为非破裂组（Non-ruptured HCC,NHCC）。2.2研究方法2.2.1临床资料研究临床病例资料中的一般资料、实验室检查指标、病理资料包括:患者年龄、性别、肝硬化、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、血红蛋白（Hemoglobin,HGB）、白细胞（white blood cell,WBC）、血小板（Platelets,PLT）、肌酐（Creatinine,Cre）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、白蛋白（Albumin,ALB）、天门冬氨酸氨基转酶（Aspartate Aminotransferase,AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase,ALT）、凝血酶原时间（Prothrombin time,PT）、凝血酶原国际标准化比值（International Normalizd ratio,INR）、乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBs Ag）、丙肝抗体（Hepatitis C virus antibody,HCVAb）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）、肿瘤最大直径、肿瘤单发和多发等。再通过临床病例资料中的病案首页所记录的联系方式联系患者及其亲属以获取随访信息。单因素分析两组患者的临床影响因素,多因素Logistic回归模型探讨影响肝癌自发性破裂发生的独立危险因素,Cox回归模型进行生存分析。2.2.2全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies,GWAS）主要步骤如下:采用DNA提取试剂盒提取肝脏肿瘤组织DNA,质检合格后,建立DNA文库,进行文库质检后采用二代测序平台进行上机测序。采用标准化流程比对分析数据,最终筛选出与肝癌自发性破裂相关的高频突变基因和突变类型。2.2.3转录组学测序转录组（Transcriptome）测序主要步骤如下:采用RNA提取试剂盒提取肝脏肿瘤组织以及癌旁正常肝脏组织的RNA,并进行质检后,用分光光度计（OD260/280≥1.9）检测RNA浓度和纯度。将m RNA片段化处理后反转录成双链c DNA后扩增构建测序文库。对构建好的文库进行PCR扩增,产生DNA簇,将DNA扩增子线性化成为单链,完成DNA成簇（Cluster）扩增,经过高通量测序得到fastq数据后进行转录组数据分析。2.2.4统计学方法Excel 2007建立数据库,利用SPSS 23.0进行统计分析。采用两独立样本t检验、卡方检验或Fisher确切概率法、Wilcoxon秩和检验。应用多因素Logistic回归模型以确定导致肝癌自发性破裂的独立危险因素。为了比较两组的总生存期（Overall survival,OS）和无病生存期（recurrence-free survival,RFS）的差异,采用Log-rank方法,并通过Graph Pad Prism 8.2.1软件绘制Kaplan-Meier曲线,生存分析使用Cox回归模型。双侧检验显着性水平为P值小于0.05被认为差异有统计学意义。3结果3.1肝癌患者的临床资料回顾性分析3.1.1临床指标的单因素分析RHCC患者中,其血浆ALB及HGB值均明显低于NHCC患者,而WBC、PLT、TBIL、AST、ALT、PT及INR值均明显高于NHCC患者。3.1.2多因素Logistic回归分析多因素Logistic回归模型分析结果显示,影响原发性肝癌自发性破裂的因素主要有性别、高血压、肿瘤最大直径、WBC、ALB。3.1.3生存分析和多因素Cox分析RHCC组患者经过手术治疗后1年、2年、3年OS分别为75.7%、54.2%、35.6%。NHCC组患者1年、2年、3年OS分别为:85.3%、76.5%、67.6%。两组患者OS差异具有统计学意义。RHCC组患者经过手术治疗1年、2年、3年RFS分别为:70.7%、47.6%、23.8%。NHCC组患者1年、2年、3年RFS分别为:74.5%、57.1%、42.7%。两组患者RFS差异具有统计学意义。Cox比例风险模型进行多因素分析显示破裂、PLT、ALB、AST的P值均小于0.05,不同因素的肝癌病例之间生存风险差异具有统计学意义。3.2全基因组关联研究结果通过对123例RHCC组样本和1052例NHCC组对照样本的（Single nucleotide polymorphism,SNP）分型数据进行全基因组关联分析,确认了1个与肝癌自发性破裂显着性关联的易感位点/基因（17q25.3/TBC1D16）。TBC1D16主要体现在可能参与膜蛋白的转运和免疫复合物（Immune complex,IC）吞噬入巨噬细胞胞浆中进行降解的过程中,导致巨噬细胞与IC结合效率进一步受损。引起IC在小血管壁的沉积,机体通过局部炎症反应而使血管受损使肿瘤发生自发性破裂出血。通过应用大样本量的MHC深度测序数据库作为Reference Pannel对GWAS数据进行Imputation分析,发现人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）遗传变异可能与肝癌自发性破裂有关。3.3转录组学测序结果通过对15例肝癌自发性破裂和18例非破裂肝癌对照样本进行转录组测序,发现差异基因富集于肿瘤代谢与免疫调控等生物学过程或通路,且基因组学中易感基因TBC1D16表达谱的上调可能与巨噬细胞功能受损有关。4结论（1）肝癌患者临床资料分析结果发现,RHCC组患者的ALB、HGB水平明显低于NHCC组。RHCC组患者的WBC、PLT、TBIL、AST、ALT、PT、INR水平明显高于NHCC组。（2）影响原发性肝癌自发性破裂的因素主要有性别、高血压、肿瘤最大直径、WBC、ALB。（3）破裂、PLT、ALB、AST是影响肝癌患者生存风险的重要因素。（4）TBC1D16（17q25.3）系肝癌破裂易感基因,该基因的突变可能导致巨噬细胞与IC结合效率进一步受损,与肝脏肿瘤自发性破裂的发生有关。（5）发现HLA遗传变异可能与肝癌自发性破裂有关。（6）转录组测序结果提示易感基因TBC1D16表达谱上调。其可能与巨噬细胞吞噬功能受损有关。
邢瑶[4]（2021）在《PAK5介导的AIF磷酸化抑制其核移位并促进乳腺癌细胞增殖》文中进行了进一步梳理目的:乳腺癌是女性最常被诊断出的癌症,在女性癌症相关死亡原因中排名第一。越来越多证据表明,随着现代外科技术的不断进步和化疗药物的不断创新,乳腺癌的防治取得了重大进展,显着降低了世界发达地区乳腺癌的死亡率。但是对于进展期乳腺癌,患者的预后依旧很差,治疗的手段也很局限。发展早期诊断指标和新疗法将需要对癌症进展有更深入的分子理解,因此,探寻乳腺癌发生发展的分子机制及治疗靶点对治疗乳腺癌患者尤为重要。P21活化激酶（p21-activated Kinases,PAKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,由六个成员组成,根据不同的生化和结构特征分为两类,每类有三个成员。第一组包括PAK1、PAK2和PAK3,第二组包括PAK4、PAK5和PAK6。在第二组的三个成员中,PAK5（也称为PAK7）是最新发现的PAK家族成员,在细胞骨架微管稳定性和细胞存活的调节中起着不可或缺的作用。越来越多的证据表明,PAK5是一种致癌蛋白,与多种癌症有关,包括胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等。尽管这些研究表明PAK5是肿瘤进展中的关键因子,但其潜在的分子机制尚未完全阐明。线粒体是启动和执行凋亡的关键因素。当受到一系列外部信号的刺激时,线粒体释放凋亡诱导因子如AIF（apoptosis inducing factor）、核酸内切酶G和细胞色素c进入细胞质,并激活半胱氨酸蛋白酶依赖的（caspase-dependent）或半胱氨酸蛋白酶非依赖的（caspase-independent）途径诱导凋亡。在正常生理条件下,AIF定位在线粒体膜间隙发挥氧化还原酶及电子传递的功能。一系列证据表明,当细胞受到凋亡信号刺激时,钙依赖性半胱氨酸蛋白酶calpains可与其他半胱氨酸蛋白酶（即溶酶体组织蛋白酶）一起切割AIF,使其成为57k Da可溶性促凋亡蛋白AIF（成熟AIF）,并能够增加线粒体膜通透性使AIF从线粒体释放到细胞质并进入细胞核,与DNA结合导致染色质凝聚和DNA大片段化,从而诱导caspase非依赖途径的细胞凋亡。AIF从线粒体到细胞核这一过程受多种因素调控。然而,PAK5对AIF功能的影响尚未见报道,AIF对乳腺癌进展的临床影响尚不清楚。在本研究中,我们发现PAK5可以阻止AIF从线粒体释放,并通过磷酸化AIF减少其核移位来抑制caspase非依赖细胞凋亡的发生。重要的是,我们的研究表明,随着乳腺癌的发展,AIF核移位明显减少,这与PAK5在乳腺癌中高度表达密切相关。这些结果提示PAK5-AIF信号通路可能是治疗乳腺癌的一个新的潜在靶点。研究方法:为研究PAK5和AIF在乳腺癌临床组织样本中的表达以及与患者预后的相关性,首先通过TCGA数据库预测AIF在乳腺癌组织的表达量以及在TCGA、GSE31519数据库中预测AIF的总生存率。通过Western-Blot、免疫组化实验检测PAK5和AIF在乳腺癌临床病例中的表达,并分析它们之间表达的相关性以及与肿瘤分级之间的相关性。针对PAK5、AIF不同表达水平对乳腺癌病例进行生存分析。通过蛋白质免疫共沉淀实验以及GST-pull down实验鉴定PAK5与AIF之间的相互作用。免疫荧光实验检测PAK5与AIF在细胞中的共定位。为研究PAK5对AIF从线粒体释放的影响。首先通过免疫荧光实验以及提取线粒体蛋白检测PAK5对AIF在线粒体中定位的改变。提取线粒体蛋白检测线粒体中BCL2/Bax比例变化以评估PAK5对线粒体膜通透性的影响。JC-1染色和流式细胞术检测PAK5对线粒体膜电位的影响。为证明PAK5能够影响caspase非依赖细胞凋亡,首先通过流式细胞术检测PAK5对细胞凋亡的影响。加入caspase阻断剂Z-VAD-FMK和凋亡诱导剂后,Western Blot检测早期凋亡指标cleaved-PARP表达变化。为研究PAK5对AIF核移位调控的具体机制。首先通过GST-pulldown实验检测PAK5与AIF结合的具体结构域。核浆分离及Western Blot检测PAK5对AIF核浆定位的影响。为探究PAK5影响AIF核移位的具体机制,利用免疫共沉淀实验检测AIF与PAK5之间相互作用的位置、AIF与importins之间的相互作用以及PAK5对AIF与importins之间相互作用的影响。为证明PAK5对AIF核移位的影响依赖于磷酸化水平,首先我们通过生物信息学预测PAK5可能磷酸化AIF的位点,核浆分离及Western Blot检测Flag、AIF WT、AIF S202A、AIF T281A核移位的改变。磷酸化蛋白质谱及免疫共沉淀实验验证PAK5磷酸化AIF的T281位点。流式细胞术检测Flag、AIF WT、AIF T281A对细胞凋亡的影响。免疫共沉淀实验检测Flag、AIF WT、AIF T281A与PAK5、importins结合的强弱。克隆形成及CCK-8实验检测Flag、AIF WT、AIF T281A对乳腺癌细胞增殖的影响。利用裸鼠成瘤实验观察分析磷酸化的AIF对乳腺癌细胞增殖能力的影响。为研究PAK5与AIF核移位在临床上的相关性。在乳腺癌旁组织、乳腺良性病、乳腺癌组织中检测AIF的表达和定位,并分析AIF不同表达水平及定位与乳腺癌分级的相关性。通过免疫荧光检测乳腺癌旁组织、乳腺良性病、乳腺癌组织中PAK5与AIF共定位强弱。结果:1.PAK5与AIF在乳腺癌组织中高度表达且呈正相关。TCGA数据库预测AIF在乳腺癌组织中高表达。TCGA、GSE31519数据库预测AIF高度表达患者的总生存率低。Western-Blot、免疫组化实验检测PAK5和AIF在乳腺癌临床病例中高度表达,并且二者在乳腺癌组织中表达呈正相关。与肿瘤分级也呈正相关。生存分析发现PAK5与AIF高度表达的患者预后差。免疫共沉淀实验证实PAK5与AIF在细胞内存在相互作用。GST-pull down实验证实PAK5与AIF在细胞外直接结合。免疫荧光实验证实PAK5与AIF共定位在乳腺癌细胞质中。2.PAK5通过调节线粒体膜通透性和膜电位来抑制AIF的释放。免疫荧光实验证实PAK5与AIF能够共定位在线粒体上,并且PAK5能够使线粒体中AIF的表达增加。提取线粒体蛋白,通过Western-Blot实验证实PAK5能够提高线粒体中BCL2/Bax的比例,降低线粒体膜的通透性。JC-1染色和流式细胞术证实PAK5能够提高线粒体膜电位。3.PAK5介导的AIF磷酸化抑制其核移位并促进乳腺癌增殖。细胞凋亡、Western-Blot实验证实PAK5能够抑制caspase非依赖的细胞凋亡。GST-pull down实验证实PAK5直接结合AIF的263-480a.a结构域。核浆分离证实PAK5能够阻止AIF进入细胞核。免疫共沉淀实验证实PAK5能够减弱AIF与importinα3之间相互作用。磷酸化蛋白质谱及免疫共沉淀实验验证PAK5磷酸化AIF的T281位点。核浆分离以及免疫共沉淀实验证实PAK5通过磷酸化AIF的Thr-281位点减弱其与importinα3的结合来抑制AIF核移位。CCK-8、克隆形成以及裸鼠成瘤实验证实磷酸化的AIF能够促进乳腺癌细胞增殖。免疫组化实验证实相较于乳腺癌旁组织、乳腺良性病,在乳腺癌组织中AIF的表达较高,且AIF核移位现象较少。AIF的表达与乳腺癌分级呈正相关,而AIF核移位与乳腺癌分级呈负相关。免疫荧光实验证实相较于乳腺癌旁组织、乳腺良性病,乳腺癌组织中PAK5与AIF在细胞质中共定位更强。结论:1.PAK5和AIF在乳腺癌临床组织样本中的表达呈正相关,与肿瘤分级呈正相关。PAK5和AIF表达高的患者预后差。2.PAK5与AIF之间存在相互作用,且共定位在细胞质中。3.PAK5通过降低线粒体膜通透性和升高线粒体膜电位来抑制AIF从线粒体释放。4.PAK5能够抑制caspase非依赖细胞凋亡的发生。5.PAK5能够减弱AIF与importinα3的相互作用来阻止AIF进入细胞核。6.PAK5通过磷酸化AIF的Thr-281位点来抑制AIF核移位。7.PAK5介导的AIF磷酸化能够促进乳腺癌细胞增殖。8.在乳腺癌临床病例中,AIF核移位与乳腺癌分级呈负相关。9.相较于乳腺癌旁组织、乳腺良性病,乳腺癌组织中PAK5与AIF在细胞质中共定位更强。
江伟凡[5]（2020）在《双氯芬酸及其代谢物诱导的急性肝毒性和免疫活化研究》文中研究表明非甾体抗炎药（Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）经常作为处方药或非处方药使用于疼痛、发热及关节炎症的治疗。由于NSAIDs的广泛使用,与NSAIDs相关的药物诱导性肝损伤（Drug induced liver injury,DILI）越来越受到关注。双氯芬酸（Diclofenac,DCF）是一种临床上广泛使用的苯乙酸类非甾体抗炎药,也是报道较多的会引起特异质药物性肝损伤的典型药物之一,严重时甚至会导致急性肝衰竭和死亡。目前,除了苯醌亚胺-蛋白加合途径和致线粒体功能紊乱等直接毒性外,免疫毒性也被认为是DCF诱导DILI的另一个主要因素。此外,由于DCF在人体内的代谢途径相对丰富,可以被进一步转化为多种具有潜在肝毒性及免疫原性的反应活性代谢产物,DCF介导的DILI可能是由于多种反应活性代谢物共同作用的结果。因此,了解DCF在生物体内的转化及代谢物的肝毒性机制,有利于指导临床合理用药及规避DILI风险。然而,DCF及其反应活性代谢产物诱导的肝毒性机制以及与免疫系统的相关性仍有待进一步研究。本课题采用人拟化TgCYP3A4/hPXR小鼠模拟DCF在人体中的代谢过程,对DCF及其反应活性代谢物的急性肝毒性进行评价,从药物直接毒性、代谢动力学、肝脏转录组学以及体内外免疫活化等角度对DCF及其反应活性代谢物介导的DILI机制进行探索,具体研究内容及结果如下:1)考虑到DCF代谢途径广泛,除非抑制其他所有代谢途径,否则无法评估DCF原型药物或其某一特定代谢产物在体内与DILI的直接关系。基于此,本研究将DCF及其反应活性代谢物4’-羟基双氯芬酸（4’-OH-DCF）、5-羟基-双氯芬酸（5-OH-DCF）以及双氯芬酸酰基葡萄糖醛酸（DCF-G）以腹腔注射的方式分别直接给予TgCYP3A4/hPXR小鼠,并通过血清生化检测及肝脏组织病理检查评估各DCF反应活性代谢物和急性肝损伤的相关性。结果显示,DCF及其反应活性代谢物均可以引起TgCYP3A4/hPXR小鼠发生不同程度的急性肝毒性,主要表现为血清ALT水平显着增加以及肝细胞水肿变性。其中,DCF-G在这三种反应活性代谢物中对肝脏的损伤最为显着。2)为了探究DCF在体内潜在的直接肝毒性机制,本研究利用LC-MS/MS方法评估DCF诱导的急性肝损伤小鼠中肝脏谷胱甘肽（Glutathione,GSH）含量变化,结果发现DCF不是通过GSH耗竭对肝脏细胞产生直接毒性,说明在体内可能存在其他的毒性机制间接参与DCF急性肝损伤的发生。3)为了进一步探讨DCF急性肝损伤敏感性和DCF及其反应活性代谢物代谢分布的相关性,本研究首先建立了一种高选择性的、准确并可靠的DCF及其代谢物LC-MS/MS检测方法。通过LC-MS/MS技术和血清ALT活性检测分别比较TgCYP3A4/hPXR小鼠和野生型BALB/c小鼠中DCF的代谢分布和对DCF致急性肝损伤的敏感性。结果发现相对于野生型BALB/c小鼠,TgCYP3A4/hPXR小鼠对于DCF诱导的急性肝损伤更敏感,且DCF反应活性代谢物在敏感小鼠肝脏中更加富集。这些不仅证实了TgCYP3A4/hPXR小鼠可以作为进一步研究DCF介导DILI机制的理想模型,也表明了DCF反应活性代谢物在肝脏中的富集程度可能直接影响DILI的敏感性。另外,本研究基于上述通过DCF及其代谢物直接给药建立的急性肝毒性TgCYP3A4/hPXR小鼠模型,对DCF、4’-OH-DCF、5-OH-DCF以及DCF-G直接进入体内后在全血和肝脏中的转化及暴露水平进行了评估。结果显示,DCF-G直接给予小鼠后可以在体内转变为原型药及其他反应活性代谢物,提示DCF-G在体内可能会引起再次伤害;另外,DCF-G在DCF和DCF-G直接给药所诱导的急性毒性肝脏中表现出明显的富集。这些进一步表明DCF诱导的急性肝毒性和DCF-G在肝脏中的富集有关。4)为了进一步探究药物性急性肝损伤机制以及和免疫系统的关联,本研究利用肝脏转录组高通量测序（RNA-seq）技术进一步评估DCF及其反应活性代谢物在急性肝损伤条件下对肝脏转录组的影响,并采用Real-time qPCR技术对RNA-seq结果进行验证。结果显示,DCF及其反应活性代谢物均可不同程度地影响肝脏基因组转录,其中DCF-G的影响最为显着。DCF-G可以诱导大量“免疫系统”和“细胞死亡”相关基因的表达,包括 Cxcl1、Ccl2、C3ar1、C5ar1、Tnfaip3、Fga、Fgb、Fgg 以及 Serpine1 等,而这些基因主要与“TNF信号通路”、“IL-17信号通路”以及“补体和凝血级联途径”等生物学通路有关。DCF-G可通过诱导这些基因及其生物学通路促进肝脏局部炎症反应,促使肝细胞对TNF-α介导细胞凋亡的敏感性增加,以及导致凝血功能障碍等,从而在急性肝损伤进程中起着关键作用。此外,4’-OH-DCF也可以诱导部分“免疫系统”和“细胞死亡”相关基因表达,表现出和“TNF信号通路”以及“IL-17信号通路”一定的相关性。然而,急性肝毒性较弱的5-OH-DCF对这些基因的影响较少。这些结果表明肝脏免疫系统的活化和DCF及其反应活性代谢产物诱导的急性肝毒性有关,特别是DCF-G。5)本研究进一步评估了 DCF及其代谢物在体内外对免疫细胞及因子的活化作用。本研究通过利用小鼠单核巨噬细胞J774A.1和小鼠肝癌细胞系Hepa1c1c7细胞建立了共培养模型,在体外进一步评估DCF及其反应活性代谢物的炎性刺激作用和细胞毒性。体外细胞实验表明DCF在J774A.1细胞和Hepa1c1c7细胞的共培养体系中表现出了一定的“协同”细胞毒性。但是,DCF活性代谢物在体外共培养体系中并没有表现出一致的协同毒性,并且DCF及DCF-G不会直接刺激小鼠单核巨噬细胞J774A.1的炎症反应。这些提示了巨噬细胞在DCF诱导的DILI可能起着部分的作用,而DCF反应活性代谢物产生的急性肝毒性可能是更多因素作用的结果,在体内存在其他的毒性机制介导DILI的发生。另一方面,本研究利用多重细胞因子检测技术对急性肝毒性小鼠血清中免疫相关细胞因子进行了分析,结果表明DCF及其反应活性代谢物可以诱导血清免疫相关因子水平不同程度的增加,其中DCF-G和4’-OH-DCF在急性肝毒性发生早期可以显着诱导IL-12、IL-17和TNF-α血清水平的上调,这些在一定程度上印证了肝脏转录组的结果。本课题通过探索DCF反应活性代谢物致肝毒性机制,包括与免疫系统的相关性,确定了 DCF-G是DCF急性肝损伤的主要贡献者,而这和DCF-G在肝脏中的富集以及对肝脏免疫系统的过度活化相关,主要涉及“TNF信号通路”、“IL-17信号通路”以及“补体和凝血级联途径”等生物学通路。通过确定的代谢产物及免疫活化途径,也可为此类药物肝毒性,尤其是急性肝毒性,提供预测和规避的方向及潜在的干预靶点。这些发现有助于进一步阐明DILI的作用机制,同时为创新药物开发及临床安全性评价提供参考依据。
朱雄[6]（2020）在《EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究》文中认为神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类以中枢神经系统（神经元）和（或）外周神经系统（髓鞘）的变性、凋亡所导致的结构和功能的进行性退化为特征的异质性疾病。随着人口老龄化问题日益突出,神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病的发病机理极其复杂,至今尚不能被完全解释清楚,到目前为止缺少有效的诊断和治疗方法。目的:在神经退行性疾病中,脑和视网膜神经退行性病变是目前研究的热点。此类疾病引起损害的病理是神经元细胞的不可逆性损伤,目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。视网膜营养不良（Retinal dystrophy）是一类因光感受器功能丧失而引起的异质性遗传性疾病。在全球尤其是工业化国家中,视网膜变性疾病是致盲的重要原因之一。这些疾病的临床表型复杂性和等位基因的异质性给疾病的正确诊断带来困难。内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在酿酒酵母中被鉴定为内质网中蛋白质折叠所需的6亚单位跨膜蛋白复合物。EMC亚基的丢失会导致错误折叠的膜蛋白的积累和未折叠蛋白反应（UPR）的诱导。有研究报道,EMC1基因突变与视网膜营养不良及小脑发育退化综合征相关。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于内质网,并与EMC1和钙连蛋白（calnexin）结合并相互作用。此外,内质网膜蛋白复合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的稳定表达所必需的,如视紫红质和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失会导致果蝇单眼细胞的变性。这些结果共同表明,EMC是包括视紫红质1在内的多通道跨膜蛋白生物发生过程中的一个关键因素,其缺失会导致视网膜变性。EMC1和EMC3组成复合物参与内质网相关降解（ERAD）途径,表明EMC与ERAD途径之间存在密切联系。内质网结构和功能的紊乱在神经退行性疾病中已被广泛观察到,但内质网功能障碍是神经退行性疾病病变的原因,还是仅仅是神经元死亡的表现,目前尚不清楚。本论文重点研究EMC3在小脑和视网膜中的功能。方法:构建EMC3、EMC1等表达质粒载体（包括野生型和突变型）,分别进行细胞转染,结合免疫组化等方法,通过高分辨激光共聚焦显微镜、荧光共定位等分析其在细胞中的表达及定位情况,分析EMC1突变是否引起细胞中定位发生变化。研究EMC3与EMC其他亚基的表达及定位分析。在前期工作中,本研究发现小鼠Emc3基因胚胎敲除导致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre转基因小鼠和Emc3条件性敲除小鼠建立了一个在小脑浦肯野神经细胞和视网膜双极细胞中特异敲除Emc3基因的动物模型。本论文综合运用分子生物学,细胞生物学和免疫组化等方法,详细研究Emc3在双极细胞和小脑浦肯野细胞中的功能。利用双极细胞和小脑浦肯野细胞中特异蛋白标志物,对Emc3缺失的小鼠视网膜和小脑冰冻切片进行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦显微镜,详细分析这些关键蛋白的运输和定位。结果:EMC3由小鼠Tmem111基因编码,是高度保守的内质网膜蛋白复合物（EMC）的一个亚基。本研究发现Emc3的靶向缺失导致了小鼠严重的神经病变表型。同时Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以长期存活并是可育的,但行为学上表现出类似于小脑共济失调的表型。与野生型小鼠相比较,三月龄的成年Emc3突变小鼠小脑中浦肯野细胞的树突发育有明显减少。本研究进一步发现,浦肯野细胞中Emc3的选择性缺失导致内质网错误折叠的膜蛋白的积累,阻碍了浦肯野细胞的分泌运输,并导致了树突萎缩。这些表型表现为小脑体积变小和浦肯野细胞数量减少,导致共济失调。浦肯野细胞丢失和共济失调最初出现在出生后两个星期左右,但随着年龄的增长逐渐恶化。Emc3的缺失导致浦肯野细胞缺失区域神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和星形胶质细胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BIP）表达水平升高表明浦肯野细胞在可见细胞丢失之前存在内质网应激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小脑浦肯野细胞出现细胞凋亡。本文的数据表明,浦肯野细胞中Emc3的缺失导致蛋白质折叠和运输缺陷,树突密度显着降低,星形胶质细胞增生和浦肯野细胞死亡。此外,本研究发现Emc3突变小鼠视网膜中视杆双极细胞与野生型小鼠相比有进行性病变,这表明Emc3在小鼠的视网膜结构和功能维持发挥重要作用。结论:研究结果表明了Emc3在小鼠浦肯野细胞和视网膜双极细胞的发育和功能维持发挥重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小脑浦肯野细胞和视网膜中的重要作用,为研究小脑共济失调和视网膜神经退行性疾病提供了新方向与思路。
熊颖黎[7]（2020）在《猪细小病毒诱导猪胎盘滋养层细胞自噬性死亡作用研究》文中研究说明猪细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）属于细小病毒科、细小病毒属成员,是引起初孕母猪繁殖障碍性疾病的重要病原。PPV能感染多种猪原代和传代细胞,其中猪胎盘滋养层细胞（placental trophoblast cells,PTCs）是其主要靶细胞。PTCs是构成猪胎盘屏障的重要组成部分,在胎盘形成和胎儿发育过程中发挥重要的生理和免疫保护功能。本实验室前期研究证实,PPV感染PTCs可引起细胞自噬和细胞凋亡,然而PPV引起的PTCs自噬与细胞凋亡之间的关系,以及PPV感染PTCs中是否存在细胞自噬性死亡,迄今尚不清楚。本论文首先探讨PPV感染诱导PTCs自噬和细胞凋亡之间的关系,进一步检测PPV感染PTCs是否引起细胞自噬性死亡,并明确这种细胞死亡方式的特征,最后,研究细胞自噬对PPV诱导PTCs自噬性死亡的影响。研究取得以下结果。1.以1 MOI PPV感染PTCs,DNA Ladder检测结果显示,PPV感染36 h.p.i.,PTCs染色体DNA开始出现片段化,且在48 h.p.i.、60 h.p.i.、72 h.p.i.都能检测到明显的细胞染色体DNA片段化。流式细胞术检测结果显示,与感染0 h相比,PPV感染PTCs12 h.p.i.细胞凋亡率极显着升高（p<0.01）,24 h.p.i.和36 h.p.i.细胞凋亡率均极显着升高（p<0.01）。caspase活性检测结果显示,与感染0 h相比,PPV感染12 h.p.i.细胞中caspase-3和caspase-9活性显着增加（p<0.05）,24 h.p.i.和36 h.p.i.极显着增加（p<0.01）。结果表明,PPV感染能够诱导PTCs凋亡。以自噬激动剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA,100 n M）或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3methyladenine,3-MA,5 m M）分别预处理PTCs后,1 MOI PPV感染细胞24 h.p.i.,细胞凋亡检测结果显示,与对照组比较,用3-MA抑制细胞自噬后PPV感染PTCs中caspase-3和caspase-9的活性无显着差异（p>0.05）,细胞凋亡率显着增加（p<0.05）;用RAPA诱导细胞自噬使PPV感染PTCs中caspase-3和caspase-9的活性水平极显着降低（p<0.01）,细胞凋亡率显着降低（p<0.05）。结果表明,诱导细胞自噬可以抑制PPV诱导的细胞凋亡发生,而抑制细胞自噬则促进了PPV诱导细胞凋亡。2.1 MOI PPV感染PTCs,流式细胞术检测细胞死亡率,结果显示,PPV感染24h.p.i.细胞死亡率达到31.23%±1.98%,利用caspase特异性抑制剂z VAD-fmk（10 m M）预处理PTCs后,PPV感染仍能引起10.71%±1.12%的细胞死亡,提示在PPV感染的细胞中存在非凋亡通路介导的其它细胞死亡形式。在z VAD-fmk存在的情况下,以5m M 3-MA或100 n M RAPA预处理PTCs,在PPV感染PTCs 24 h.p.i.,3-MA抑制细胞自噬使PPV感染引起的细胞死亡率显着降低（p<0.05）;RAPA诱导细胞自噬使细胞死亡率显着升高（p<0.05）;特异性si ATG5抑制细胞自噬能使PPV感染引起的细胞死亡率显着降低（p<0.05）。这些结果表明PPV感染能诱导PTCs自噬性死亡。流式细胞术检测PPV感染PTCs溶酶体膜通透性变化,结果显示,1 MOI PPV感染PTCs24 h.p.i.细胞中lysosome tracker DND26平均荧光强度（DND26 MFI）显着降低（p<0.05）,z VAD-fmk预处理细胞后,PPV感染亦引起PTCs中DND26 MFI显着降低（p<0.05）,但是在z VAD-fmk存在的情况下,3-MA预处理后PPV感染PTCs中DND26MFI与Mock细胞相比无明显变化（p>0.05）。western blotting结果显示,PPV感染促进组织蛋白酶D和组织蛋白酶L从溶酶体释放到细胞浆中,且3-MA能显着减少PPV感染细胞胞浆中的组织蛋白酶D和L（p<0.05）,而z VAD-fmk则没有这种作用。这些结果表明,PPV感染PTCs可以诱导以溶酶体损伤为特征的细胞自噬性死亡。3.流式细胞术检测1 MOI PPV感染72 h内PTCs死亡率和溶酶体膜通透性变化,结果显示,在z VAD-fmk预处理后,随着感染时间延长细胞死亡率不断增加,与感染0 h相比,PPV感染PTCs 24 h.p.i.、48 h.p.i.和72 h.p.i.细胞死亡率均极显着增加（p<0.01）,与细胞死亡率结果一致,PPV感染PTCs 24 h.p.i.细胞中DND26 MFI显着降低（p<0.05）,48 h.p.i.和72 h.p.i.极显着降低（p<0.01）,这表明PPV感染引起的以溶酶体损伤为特征的细胞自噬性死亡率呈时间依赖性。细胞自噬性死亡率检测结果显示,与PPV感染组相比,100 n M RAPA预处理诱导PTCs完全自噬使PPV感染PTCs的自噬性死亡率显着增加（p<0.05）,DND26 MFI显着降低（p<0.05）,但是100 n M RAPA&100 n M BAF预处理诱导PTCs不完全自噬,对PPV感染PTCs的自噬性死亡率和DND26荧光强度无明显影响（p>0.05）。western blotting结果显示,与DND26 MFI变化一致,在72 h.p.i.,细胞中组织蛋白酶D和组织蛋白酶L从溶酶体释放到细胞浆中,且与PPV感染组细胞相比,RAPA预处理诱导细胞完全自噬促进组织蛋白D和组织蛋白L向细胞浆中释放（p<0.05）,而RAPA&BAF预处理诱导细胞不完全自噬对PPV感染细胞中组织蛋白D和组织蛋白L的释放无明显影响（p>0.05）。上述结果表明,诱导细胞完全自噬促进PPV感染引起的PTCs自噬性死亡,而诱导细胞不完全自噬对PTCs自噬性死亡无明显影响。本研究明确了诱导PTCs自噬可以抑制PPV诱导的细胞凋亡,而抑制PTCs自噬促进了PPV诱导细胞凋亡。发现了PPV感染引起了以溶酶体损伤为特征的PTCs自噬性死亡。进一步研究发现,细胞完全自噬促进PPV诱导的PTCs自噬性死亡,而细胞不完全自噬对PTCs自噬性死亡无明显影响。研究结果阐明了PPV诱导PTCs自噬与凋亡的关系以及不同细胞自噬对PPV诱导PTCs自噬性死亡的影响,为进一步揭示PPV的致病机制提供了理论依据。
王亚楠[8]（2020）在《蜱唾液腺组织退化中的细胞自噬和细胞凋亡的联络机制研究》文中提出蜱是仅次于蚊子的第二大病原传播媒介。蜱的唾液腺在吸血过程中具有关键作用,也是蜱传播病原的主要器官。蜱的唾液腺在饱血后会经历快速的退化,以适应后续蜕皮发育或生殖产卵的生理学需要,但其调控机制不明。本论文以镰形扇头蜱为研究对象,聚焦蜱吸血后唾液腺退化这一生物学现象,从唾液腺退化过程中细胞自噬和凋亡的联络机制上展开研究,以期在分子水平上解析蜱的退化机制,为蜱的新型控制技术提供理论基础。主要研究结果如下:一、蜱唾液腺退化过程中的细胞自噬和细胞凋亡的动态检测和转录组分析通过透射电镜（TEM）和TUNEL染色结果显示在整个蜱的吸血期和饱血后均可观察到双层膜包裹的自噬体,细胞自噬无显着变化;但进入快速吸血期和饱血后蜱的唾液腺TUNEL染色阳性率显着升高,表明蜱的唾液腺退化以细胞凋亡为主。根据上述结果,选择未吸血及饱血后唾液腺进行转录组差异分析筛选关键基因,结果表明大部分细胞自噬相关基因的转录水平无显着变化,而大部分细胞凋亡相关基因的转录水平饱血后显着上升,与饱血后蜱唾液腺细胞凋亡水平显着升高基本一致。二、蜱唾液腺退化中重要的细胞自噬和凋亡分子的基因克隆、序列分析和重组表达根据不同吸血时间唾液腺转录组的分析结果,我们选择其中两个自噬相关（ATG）分子和三个细胞凋亡相关胱天蛋白酶（Caspase）分子开展进一步研究,分别克隆其编码基因。根据序列比对结果,两个ATG分子命名为RhATG5和RhATG6。三个细胞凋亡相关Caspase分子,命名为RhCaspases-7、-8、-9,均具有胱天蛋白酶的保守序列特征。经原核表达获得重组蛋白用于制备多克隆抗体,后续研究奠定了基础。三、RhCaspase-7、-8、-9之间的相互作用及其在蜱唾液腺退化中的作用机制RT-qPCR分析证实,RhCaspase-7、-8、-9的转录水平在每个发育阶段的饱血阶段（饱血幼蜱、饱血若蜱和饱血成蜱）显着升高。饱血后唾液腺中RhCaspases-7、-8、-9的转录水平比其他组织增加也更加显着。RNA干扰RhCaspase-9可显着抑制蜱的吸血,而干扰RhCaspase-7、-8后对蜱的吸血并无影响;与对照组相比,干扰RhCaspase-7、-8和-9后,凋亡水平显着降低。共转染实验表明RhCaspase-7可被RhCaspase-8和RhCaspase-9剪切,表明了RhCaspase-7为效应Caspase分子,而RhCaspase-8和RhCaspase-9为启始Caspase分子。四、RhATG5调控蜱唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化通过western blot检测发现RhATG5在蜱的吸血前期表达量低,后期表达量升高,与凋亡标志分子一致。同时RhATG5在蜱的吸血后期发生剪切。His-RhATG5与μ-Calpain共孵育,结果显示RhATG5在Ca2+存在的条件下可被μ-Calpain剪切。体外培养的蜱的唾液腺组织中加入不同浓度的20E,高浓度的20E处理后,导致蜱唾液腺中的Ca2+浓度和RhCalpains的转录水平表达量升高,RhATG5裂解为NtRhATG5,自噬标志分子降低而凋亡标志分子表达量升高,促进了细胞自噬向细胞凋亡转化。RhATG5的体外RNAi结果显示,唾液腺中的细胞自噬和细胞凋亡均被抑制,证明RhATG5对蜱的细胞自噬和细胞凋亡均有调节作用。上述结果表明,高浓度的20E可通过升高细胞内Ca2+的浓度导致RhATG5的剪切,并引起细胞自噬向细胞凋亡的转化,加快唾液腺的退化进程。五、宿主Beclin-1分子调控唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化通过免疫荧光检测,发现宿主来源的Beclin-1出现在蜱唾液腺退化过程中,且其出现在蜱血淋巴中的时间（吸血第5-7天）要早于蜱唾液腺中（饱血后1-2天）时间。蜱显微注射homo-Beclin-1重组蛋白可引起唾液腺的自噬和凋亡相关分子转录水平和TUNEL染色阳性率的显着升高,与注射20E效果一致。同时注射Beclin-1和20E后,蜱的唾液腺退化进程加快,而当加注自噬和凋亡抑制剂后,自噬和凋亡相关因子转录水平明显降低。Beclin-1被Caspase酶降解是Beclin-1促凋亡作用的机制之一,western blot检测结果表明在快速吸血期蜱唾液腺中宿主来源的Beclin-1发生了剪切。体外共转染实验结果显示,homo-Beclin-1可被三个RhCaspase剪切,而切割位点突变后的homo-Beclin-1不会被剪切。Co-IP结果发现homo-Beclin-1可与RhBCL-2结合形成免疫共沉淀,使RhBCL-2的BH3结构域被封闭,RhBCL-2抗凋亡作用消失,加速细胞凋亡发生。综上所述,本研究表明蜱唾液腺的退化是以细胞凋亡为主,细胞自噬参与的细胞程序化死亡的过程。快速吸血期,血淋巴中蜕皮激素浓度升高,Ca2+浓度升高,导致自噬分子ATG5发生剪切,细胞自噬转化为细胞凋亡;另一方面,宿主Beclin-1分子在唾液腺内发生累积,可被蜱源的Caspase剪切,或通过与蜱源BCL-2的结合,进一步促进细胞自噬向细胞凋亡转化,加快唾液腺的退化进程。因此,蜱唾液腺退化过程中,蜱自噬分子ATG5和宿主来源的Beclin-1发挥了细胞自噬和凋亡之间的分子联络作用。
张文会[9]（2019）在《基于p53通路新型黄酮螺环骨架衍生物的多靶点机制研究》文中研究表明肿瘤已成为严重威胁人类健康的重大疾病之一,其形成与发展是一个多阶段、多因素、多基因和多细胞信号通路参与的复杂过程。由于肿瘤细胞的异质性及复杂性,相对于单靶点药物和药物联合使用,基于系统生物学的多靶点药物可能在肿瘤治疗上具有更好的优势。因此,合理设计出协同调节多病理靶点且安全有效的先导化合物已成为抗肿瘤新药研发的热点。p53是人体重要的抑癌基因,具有抑制细胞增殖,诱导细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等功能。5-Lox在多种恶性肿瘤中均过表达,其促进细胞增殖,抑制凋亡和分化的作用与PI3K/Akt和p53等信号通路密切相关。研究表明,Akt可以推迟p53介导的凋亡,并通过抑制MDM2自磷酸化来稳定p53表达水平,p53-MDM2信号通路和PI3K/Akt之间存在协同对话效应。肿瘤细胞中作用于p53通路的同时抑制Akt活性,可能增强p53激活剂的治疗效果。因此,本论文在以5-Lox及Akt等为抗肿瘤治疗靶点的黄酮骨架上,合理引入p53-MDM2结合抑制剂氧化吲哚,设计并合成一系列黄酮螺环骨架衍生物的新型分子。通过体外抗肿瘤活性筛选,得到活性最强的两个化合物3d和3e,并对其抗肿瘤作用途径及机制进行探究。在此基础上,通过建立Lewis肺癌移植瘤动物模型,对化合物3e的体内活性及作用机制进行研究。以期得到疗效更佳,毒副作用更低的抗肿瘤先导化合物,为多靶点抗肿瘤药物研发提供理论参考。本论文的主要工作如下:（一）靶标化合物的合成及体外抗肿瘤活性研究以p53信号通路为研究对象,采用药效团组合法,理性设计并合成26个新型黄酮螺环骨架衍生物,所有化合物结构经1H NMR、13C NMR、HR-ESI-MS及X-单晶映射技术确证。MTT法增殖研究结果表明,部分化合物显着抑制A549、K562、NCI-H1299及PC-3细胞的增殖,尤其是化合物3d(IC50=4.72±0.35μM)和3e(IC50=3.15±0.51μM)对表达野生型p53的A549细胞最为敏感,表现出优于阳性对照顺铂(IC50=17.58±1.12μM)和母核白杨素(IC50>50μM)的抑制活性,且对正常细胞的毒性较小,表明在正常细胞与肿瘤细胞之间具有良好的选择性。在此基础上,通过计算机模拟分子对接,初步探究化合物3e与受体Akt、5-Lox及MDM2的作用模式和结合能力,结果验证化合物3e的抗肿瘤作用靶点与设计理念中的Akt、5-Lox及MDM2靶点相关。通过生物试验显示,靶标化合物3d和3e以浓度或时间依赖性的方式显着激活A549细胞内p53蛋白和m RNA表达,证明靶标化合物确实能影响p53通路。（二）化合物3d和3e抑制A549细胞增殖作用研究以人肺癌A549细胞为研究对象,分别从细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭等方面研究化合物3d和3e抑制细胞增殖的作用。软琼脂集落形成及平板克隆实验显示,化合物3d和3e均显着抑制A549细胞克隆形成,再次证实靶标化合物对A549细胞的抗增殖作用;划痕及Transwell实验显示,化合物3d和3e显着抑制A549细胞的迁移和侵袭能力;通过形态学观察、PI及AO/EB荧光染色初步表明化合物3d和3e诱导A549细胞发生了凋亡,且凋亡程度随化合物浓度的增加而增强;随后的琼脂糖凝胶电泳显示,20μM的化合物3d和3e分别处理A549细胞24 h,能明显观察到DNA ladder的形成,表明其诱导A549细胞基因组DNA发生片段化;流式细胞术检测显示,A549细胞凋亡百分率随着化合物处理浓度的增加或时间的延长而逐渐提高,细胞倾向于晚期凋亡;且化合物3d和3e处理24 h引起A549细胞G1期阻滞。以上结果均表明化合物3d和3e具有显着抑制A549细胞增殖活性,且该作用与诱导细胞凋亡并使周期阻滞相关。（三）化合物3d和3e诱导A549细胞凋亡作用机制研究通过检测细胞内ROS水平研究发现,化合物3d和3e均浓度依赖性的提高A549细胞内ROS水平;Caspase活性检测结果表明,化合物3d和3e显着激活细胞内凋亡相关的Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶活力。提示激活的p53调控增加细胞线粒体膜通透性,A549细胞凋亡可能与Caspase级联反应有关。为了进一步探究其作用机制,选择Bcl-2、Bax、Cyt c、p53、p21、MDM2、Akt、5-Lox等p53信号通路上相关蛋白及基因进行研究。Western blot和Real-time PCR研究结果表明,化合物3d和3e均显着上调A549细胞内Bax、Cyt c、p21及p53蛋白表达,下调Bcl-2、MDM2、Akt及5-Lox蛋白表达;此外,上调A549细胞内p53 m RNA水平,并下调Akt m RNA水平。根据以上结果,推测A549细胞凋亡的机制为:化合物3d和3e通过抑制MDM2活性,释放p53,激活p53信号通路;同时抑制Akt及5-Lox蛋白表达,协同增加p53通路抗肿瘤作用效果。激活的p53通过调控p21蛋白表达,诱导A549细胞G1期阻滞;与此同时,改变Bax/Bcl-2的比值,增加细胞内ROS水平,导致细胞内氧化还原失衡,DNA损伤,细胞线粒体膜通透性增加,释放促凋亡因子Cyt c,从而活化Caspase-9,启动内源性线粒体凋亡途径。此外,通过激活Caspase-8酶活力,启动外源性死亡受体凋亡途径。（四）化合物3d和3e急性毒性及体内抗肿瘤作用机制研究根据急性毒性分别标准,化合物3d和3e均属于低毒。在此基础上,通过构建C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,对化合物3e的体内抗肿瘤作用机制进行研究。结果表明,化合物3e有效抑制Lewis肺癌小鼠体内移植瘤的生长,并具有良好的剂量依赖关系。其中,高剂量（400 mg/kg）具有最高的抑瘤率（56.87±1.47%）。通过Western blot研究,推测其体内抗肿瘤作用机制为:化合物3e通过抑制瘤细胞内MDM2、Akt及5-Lox蛋白表达,上调p53蛋白表达,激活并协同作用于p53信号通路。一方面,上调促凋亡蛋白Bax表达量,下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,增加Bax/Bcl-2比值,并释放Cyt c,从而诱导瘤细胞凋亡;另一方面,下调血管生成因子VEGF、细胞粘附因子ICAM-1及基质金属蛋白酶MMP-2蛋白水平,阻滞瘤细胞血管再生并抑制Lewis肺癌小鼠体内肿瘤的转移。综上,本研究设计并合成26个新型黄酮螺环骨架衍生物,通过体外抗肿瘤活性筛选,并对高活性化合物3d和3e体外抗A549细胞增殖和化合物3e抑制Lewis肺癌小鼠体内移植瘤生长的作用机制进行研究,揭示了靶标化合物体内外抗肿瘤作用机制。为进一步多靶点黄酮类化合物抗肿瘤药物的研发提供理论基础和技术支撑,具有一定的理论价值及指导意义。
沈鹏程[10]（2019）在《LOX-1调控骨关节软骨损伤的作用及机制的研究》文中研究指明第一部分 LOX-1在骨关节炎患者中的表达及临床意义目的:评价LOX-1和ox-LDL在骨关节炎患者中的水平变化,明确LOX-1和ox-LDL与骨关节炎患者功能水平之间的相关性。方法:纳入上海市第六人民医院行全膝关节置换术骨关节炎患者40例（n=40）,采集软骨和滑液样本;同时从获得无OA史的对照个体40例,获得正常软骨和滑液。通过定量逆转录PCR评价LOX-1在骨关节炎患者中的表达水平。通过酶联免疫吸附法在关节滑液中检测ox-LDL。通过西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）评分对骨关节炎患者进行功能性评分。通过相关性分析,分别评价了LOX-1与ox-LDL的水平和WOMAC总分之间的相关性及LOX-1和ox-LDL两者水平之间的相关性。结果:相较于对照个体的关节软骨组织,LOX-1在骨关节炎患者的关节软骨组织中表达水平显着升高,差异有统计学意义（0.49±0.11 vs.0.33±0.04;p<0.05）。相较于对照个体的关节滑液中ox-LDL的水平,骨关节炎患者关节滑液中ox-LDL的水平显着升高,两组个体比较差异有统计学意义（[（64.8±18.3）mU/ml vs.（34.5±15.7）mU/ml;p<0.05）。骨关节炎患者中LOX-1的表达与WOMAC总分之间存在相关性（相关系数r=0.805,p<0.05）。骨关节炎患者中滑膜液中ox-LDL的水平与WOMAC总分之间存在相关性（相关系数r=0.786,p<0.05）。骨关节炎患者中LOX-1的表达与滑膜液中ox-LDL的水平之间存在相关性（相关系数r=0.786,p<0.05）。结论:LOX-1和ox-LDL在骨关节炎患者中的水平升高,它们能够反映骨关节炎患者功能,并且LOX-1和ox-LDL之间可能也存在着相关性。第二部分体外实验评价LOX-1在骨关节炎中的作用和机制目的:通过体外建立软骨细胞凋亡模型,评价LOX-1和ox-LDL对软骨细胞凋亡的调控作用及可能的机制。方法:在LOX-1中和抗体（10μg/ml）存在或不存在的情况下,采用ox-LDL（20μg/ml）和/或TNF-α（50ng/ml）处理融合度为70-80%的人关节软骨细胞,共处理24-48小时。通过台盼兰染色评价细胞的死亡;通过流式细胞术评价细胞的凋亡;通过胶电泳DNA片段测定法（DNA ladder）评价软骨细胞的凋亡。Western-blotting检测凋亡蛋白分子Caspase-8和Caspase-3的水平及自噬标记物LC3的变化。通过自噬抑制剂3-MA 及 Atg5 siRNA 处理后评价对上述 ox-LDL（20μg/ml）和/或 TNF-α（50ng/ml）诱导的软骨细胞凋亡的影响。结果:与对照组相比,单独使用TNF-α和ox-LDL对细胞死亡没有明显影响（TNF-α vs.ox-LDLvs.对照组:4.65±2.21%vs.6.86±4.65%vs.3.60±1.04%;P>0.05）然而,结合使用TNF-α和ox-LDL可导致软骨细胞死亡显着增加,而Lox-1单克隆抗体可逆转这些作用（TNF+oxLDL vs.control:66.90±6.98%vs.3.60±1.04%;TNF+oxLDL vs.TNF+oxLDL+Lox-1 Ab:66.90±6.98%vs.11.40±1.50%;P>0.05）。LOX-1 抗体中和能够降低TNF-α联合ox-LDL诱导的软骨细胞中DNA片段化增加及降低TNF-α联合ox-LDL诱导的软骨细胞中caspase-8和caspase-3水平增加的情况。Western-blotting及免疫荧光结果显示TNF-α联合ox-LDL处理的软骨细胞中细胞自噬的水平显着升高,而LOX-1抗体中和能够显着降低细胞自噬水平。通过3-MA抑制自噬或Atg5 siRNA抑制自噬能够产生类似LOX-1抗体中和对TNF-α联合ox-LDL诱导的软骨细胞的作用效应。结论:ox-LDL通过其与LOX-1的相互作用促进TNF-α介导的软骨细胞死亡,并且自噬作为机制参与到两者的作用效应中。第三部分体内实验评价LOX-1在骨关节炎中的作用和机制目的:通过体内建立实验性小鼠骨关节炎模型,评价LOX-1对软骨细胞的调控作用及可能的机制。方法:通过建立在内侧半月板去稳定（DMM）手术诱导骨关节炎,并且通过系统性注射LOX-1中和抗体进行治疗评价LOX-1抗体中和对骨关节炎小鼠疾病进展的影响,同时通过TUNEL染色法对小鼠软骨组织中的软骨细胞的凋亡情况评价,及LC3染色评价自噬阳性的细胞来对相关的机制进行阐明。结果:Safranin O染色的结果显示LOX-1中和抗体处理能够显着减轻骨关节炎小鼠的疾病严重程度。LOX-1中和抗体处理能够降低骨关节炎小鼠的OARSI评分（3.95±0.40 vs.5.80±0.50;p=0.007）及骨刺的水平（1.30±0.10 vs.1.65±0.10;p=0.02）。LOX-1中和抗体处理能够降低骨关节炎小鼠的滑膜炎症水平及评分（2.02±0.10 vs.2.70±0.28;p=0.02）。LOX-1中和抗体处理能够降低骨关节炎小鼠的胫骨平台软骨下骨中骨体积/组织体积（BV/TV）比,但是差异无统计学意义。LOX-1中和抗体处理能够显着降低骨关节炎小鼠软骨细胞的凋亡。LOX-1中和抗体处理能够显着降低骨关节炎小鼠LC3+软骨细胞的数量。结论:LOX-1中和抗体能够显着减轻骨关节炎小鼠的疾病严重程度,其主要是通过影响软骨细胞凋亡和降低LC3+软骨细胞的数量得以实现。
二、DNA fragmentation in apoptosis and homeostasis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DNA fragmentation in apoptosis and homeostasis（论文提纲范文）
（1）常温保存过程活性氧诱导猪精子凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 人工授精技术发展概况 |
| 1.2 猪精液常温保存技术 |
| 1.3 抗氧化剂研究进展 |
| 1.3.1 酶促抗氧化剂 |
| 1.3.2 非酶促抗氧化剂 |
| 1.4 姜黄素研究进展 |
| 1.4.1 姜黄素的抗氧化作用 |
| 1.4.2 姜黄素的抗氧化机制 |
| 1.5 活性氧研究进展 |
| 1.6 精子凋亡研究进展 |
| 1.7 猪精液品质鉴定常用指标 |
| 1.7.1 精子活率 |
| 1.7.2 精子质膜完整率 |
| 1.7.3 精子顶体完整率 |
| 1.7.4 精子线粒体膜电位 |
| 1.8 精子抗氧化检测指标 |
| 1.8.1 精子抗氧化防御系统 |
| 1.8.2 丙二醛含量 |
| 1.9 本研究的目的与意义 |
| 1.9.1 研究目的 |
| 1.9.2 研究意义 |
| 第二章 常温保存过程猪精液品质与活性氧相关性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 常温保存过程猪精子活率的变化 |
| 2.2.2 常温保存过程猪精子质膜完整率和顶体完整率的变化 |
| 2.2.3 常温保存过程猪精子活性氧水平的变化 |
| 2.2.4 常温保存过程猪精子抗氧化性能的变化 |
| 2.2.5 活性氧水平与猪精液品质的相关性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 常温保存过程猪精子活率、质膜和顶体完整率的变化 |
| 2.3.2 常温保存过程猪精子活性氧水平的变化 |
| 2.3.3 常温保存过程猪精子抗氧化性能的变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 活性氧诱导的线粒体损伤对猪精子凋亡的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 常温保存过程猪精子凋亡水平的变化 |
| 3.2.2 常温保存过程猪精子线粒体膜电位的变化 |
| 3.2.3 常温保存过程猪精子ATP含量的变化 |
| 3.2.4 常温保存过程猪精子线粒体抗氧化性能的变化 |
| 3.2.5 活性氧水平与猪精子线粒体凋亡的相关性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 活性氧清除剂对常温保存猪精子的抗凋亡作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 姜黄素和NAC对常温保存猪精子活率的影响 |
| 4.2.2 姜黄素和NAC对常温保存猪精子活性氧水平的影响 |
| 4.2.3 姜黄素和NAC对常温保存猪精子线粒体膜电位的影响 |
| 4.2.4 姜黄素和NAC对常温保存猪精子凋亡水平的影响 |
| 4.2.5 姜黄素和NAC对常温保存猪精子细胞色素C的影响 |
| 4.2.6 姜黄素和NAC对常温保存猪精子凋亡蛋白的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）两种禾本科植物髓腔形成过程中细胞程序性死亡特征及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物髓腔 |
| 1.1.1 植物茎的结构 |
| 1.1.2 植物的髓 |
| 1.1.3 植物的髓腔 |
| 1.1.4 植物髓腔的研究进展 |
| 1.2 细胞程序性死亡 |
| 1.2.1 细胞程序性死亡的涵义 |
| 1.2.2 植物细胞程序性死亡的类型 |
| 1.2.3 植物细胞程序性死亡发生及调控机制的研究进展 |
| 1.3 转录组应用的研究进展 |
| 1.3.1 转录组的涵义 |
| 1.3.2 转录组在PCD中的应用 |
| 1.4 本研究的目的意义和主要内容 |
| 1.4.1 研究目的意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.5 本文研究的特色与创新 |
| 第二章 水稻和小麦幼茎髓细胞的细胞学研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 石蜡切片法 |
| 2.2.2 半薄切片法 |
| 2.2.3 Evens Blue染色法 |
| 2.2.4 PAS反应 |
| 2.2.5 扫描电子显微镜 |
| 2.2.6 透射电子显微镜 |
| 2.2.7 DAPI染色 |
| 2.2.8 TUNEL检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 两种植物不同发育阶段幼茎的形态结构及细胞活性 |
| 2.3.2 小麦不同发育阶段幼茎的扫描电镜结果 |
| 2.3.3 两种植物不同发育阶段幼茎的超微结构 |
| 2.3.4 水稻不同发育阶段幼茎的DAPI染色和TUNEL检测 |
| 2.3.5 小麦不同发育阶段幼茎的DAPI染色 |
| 2.3.6 小麦不同发育阶段幼茎TUNEL检测 |
| 2.3.7 小麦不同发育阶段幼茎多糖类物质的动态变化 |
| 第三章 小麦不同发育阶段幼茎的转录组特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 样本RNA的提取和测序 |
| 3.1.3 样本RNA的检测及定量 |
| 3.1.4 样本RNA测序 |
| 3.1.5 测序评估 |
| 3.1.6 qRT-PCR分析差异表达基因 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 样本RNA质量的检测结果 |
| 3.2.2 转录组测序评估结果 |
| 3.2.3 比对统计 |
| 3.2.4 基因统计 |
| 3.2.5 差异分析 |
| 3.2.6 qRT-PCR验证相关基因表达结果 |
| 第四章 小麦幼茎髓细胞PCD发生的关键因子 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DNA凝胶电泳 |
| 4.2.2 免疫组织化学技术 |
| 4.2.3 免疫印迹技术 |
| 4.2.4 免疫荧光技术 |
| 4.2.5 免疫胶体金电镜技术 |
| 4.2.6 髓细胞线粒体的提取 |
| 4.2.7 线粒体膜通透性测定 |
| 4.2.8 线粒体膜电位的检测 |
| 4.2.9 线粒体荧光观察 |
| 4.2.10 线粒体的超微结构观察 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 核DNA凝胶电泳结果 |
| 4.3.2 Caspase3-like蛋白的免疫组织化学定位 |
| 4.3.3 Caspase3-like蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹 |
| 4.3.4 ACO免疫印迹 |
| 4.3.5 髓细胞线粒体膜通透性变化 |
| 4.3.6 髓细胞线粒体荧光强度变化 |
| 4.3.7 线粒体荧光观察结果 |
| 4.3.8 线粒体超微结构 |
| 4.3.9 Cyto c免疫定位结果 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 髓腔形成中髓细胞的细胞学特征 |
| 5.1.2 髓腔形成中髓细胞的转录组特征 |
| 5.1.3 髓腔形成中髓细胞死亡的分子机制 |
| 5.1.4 线粒体在髓腔形成中的作用 |
| 5.2 讨论 |
| 5.2.1 髓细胞PCD的细胞学特征 |
| 5.2.2 参与髓细胞PCD的关键因子 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）肝癌自发性破裂的相关基因组学研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 肝癌自发性破裂相关危险因素分析和生存分析 |
| 1.引言 |
| 2.研究材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 入选标准 |
| 2.1.2 排除标准 |
| 2.1.3 总生存时间和无瘤生存时间标准定义 |
| 2.2 资料收集 |
| 2.3 随访质量控制 |
| 2.4 诊断分类标准 |
| 2.5 信息的录入及整理 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 破裂组与非破裂组患者的一般情况分析 |
| 3.2 两组患者肿瘤病理情况的差异性分析 |
| 3.3 两组患者的临床指标的结果分析 |
| 3.4 多因素Logistic回归分析 |
| 3.5 生存分析和多因素Cox分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 基因组学对肝癌自发性破裂中差异基因的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.2.1 DNA提取试剂 |
| 2.2.2 电泳试剂 |
| 2.2.3 全基因组基因分型用试剂 |
| 2.2.4 Sequenom基因分型试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.3.1 DNA提取器材 |
| 2.3.2 电泳仪器 |
| 2.3.3 DNA标准化仪器 |
| 2.3.4 全基因组基因分型仪器 |
| 2.3.5 Sequenom基因分型仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 GWAS分析 |
| 2.4.2 Illumina NOVA6000 测序 |
| 2.5 遗传学数据分析 |
| 2.5.1 数据质量控制 |
| 2.5.2 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 肝癌自发性破裂的全基因组SNPs分型关联分析 |
| 3.2 验证阶段分型数据的统计分析 |
| 3.3 合并68个SNPs的 GWAS和验证阶段分型数据的统计学分析 |
| 3.4 Imputation分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝癌自发性破裂的易感区域17q25.3 |
| 4.2 HLA与肝癌自发性破裂 |
| 5.结论 |
| 第三部分 基于转录组学技术对肝癌自发性破裂表达谱的分析 |
| 1.引言 |
| 2.材料方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 RNA-seq检测试剂 |
| 2.3 RNA-seq仪器 |
| 2.4 采集新鲜组织标本 |
| 2.5 RNA提取 |
| 2.6 RNA质检 |
| 2.7 RNA文库构建 |
| 2.7.1 mRNA分离与片段化 |
| 2.7.2 双链cDNA合成 |
| 2.7.3 双链cDNA纯化 |
| 2.7.4 末端dA-Tailing |
| 2.7.5 接头连接 |
| 2.7.6 连接产物纯化和片段大小分选 |
| 2.7.7 文库扩增 |
| 2.7.8 文库纯化及筛选 |
| 2.8 转录组数据分析 |
| 2.8.1 数据质控 |
| 2.8.2 序列比对到参考基因组 |
| 2.8.3 基因表达水平定量 |
| 2.8.4 差异表达基因分析 |
| 2.8.5 生物学途径富集分析 |
| 2.8.6 通路分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 转录组测序对象的临床特征及统计结果 |
| 3.2 转录组测序结果定量分析 |
| 3.3 转录组测序结果差异分析 |
| 3.4 易感基因TBC1D16 在转录组数据中的表达情况 |
| 3.5 差异基因的富集分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 巨噬细胞功能的转变及调节 |
| 参考文献 |
（4）PAK5介导的AIF磷酸化抑制其核移位并促进乳腺癌细胞增殖（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:PAK5与AIF在乳腺癌临床组织样本中的表达及相关性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 感受态细菌 |
| 2.1.3 原核以及真核表达载体 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 酶类 |
| 2.1.6 试剂 |
| 2.1.7 实验中主要的溶液配制 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 分子克隆 |
| 2.3.3 体外GST-Pulldown实验 |
| 2.3.4 脂质体转染法转染 |
| 2.3.5 提取细胞中的总蛋白 |
| 2.3.6 Western Blot |
| 2.3.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.3.8 细胞免疫荧光及共聚焦激光扫描显微镜检测 |
| 2.3.9 免疫组织化学染色 |
| 2.3.10 统计学方法 |
| 2.4 组织来源 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AIF在乳腺癌TCGA数据库中的表达及生存预测 |
| 3.2 PAK5和AIF表达与乳腺癌患者预后不良呈正相关 |
| 3.3 AIF是PAK5直接结合底物 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:PAK5抑制AIF从线粒体释放 |
| 6 前言 |
| 7 材料和方法 |
| 7.1 材料和仪器 |
| 7.1.1 主要试剂 |
| 7.1.2 实验中主要的溶液配制 |
| 7.1.3 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 脂质体转染法转染 |
| 7.2.2 Western Blot |
| 7.2.3 细胞免疫荧光及共聚焦激光扫描显微镜检测 |
| 7.2.4 线粒体蛋白提取 |
| 7.2.5 JC-1染色 |
| 7.2.6 统计学方法 |
| 8 实验结果 |
| 8.1 PAK5能够抑制AIF从线粒体释放 |
| 8.2 PAK5能够降低线粒体膜的通透性 |
| 8.3 PAK5能够提高线粒体膜电位 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分:PAK5介导的AIF磷酸化抑制其核移位并促进乳腺癌细胞增殖 |
| 11 前言 |
| 12 材料和方法 |
| 12.1 实验材料及仪器 |
| 12.1.1 主要试剂 |
| 12.1.2 实验中主要的溶液配制 |
| 12.1.3 仪器 |
| 12.1.4 组织来源 |
| 12.2 实验方法 |
| 12.2.1 免疫组织化学染色 |
| 12.2.2 组织免疫荧光及共聚焦激光扫描显微镜检测 |
| 12.2.3 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 12.2.4 细胞凋亡检测 |
| 12.2.5 CCK-8检测 |
| 12.2.6 克隆形成 |
| 12.2.7 裸鼠成瘤实验 |
| 12.2.8 核浆分离 |
| 12.2.9 分子克隆 |
| 12.2.10 体外GST-Pulldown实验 |
| 12.2.11 脂质体转染法转染 |
| 12.2.12 Western Blot |
| 12.2.13 统计学方法 |
| 13 实验结果 |
| 13.1 PAK5能够抑制caspase-independent细胞凋亡 |
| 13.2 PAK5通过阻断AIF核移位抑制细胞凋亡 |
| 13.3 PAK5通过磷酸化AIF的T281位点来抑制AIF核移位 |
| 13.4 磷酸化的AIF可促进乳腺癌细胞的增殖 |
| 13.5 AIF核移位与乳腺癌进程呈负相关 |
| 13.6 在乳腺癌临床组织样本中AIF核移位与PAK5呈负相关 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体凋亡对乳腺癌发生发展的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）双氯芬酸及其代谢物诱导的急性肝毒性和免疫活化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 药物诱导性肝损伤 |
| 1.1.1 药物诱导性肝损伤现状 |
| 1.1.2 DILI的表型及分类 |
| 1.1.3 DILI的影响因素 |
| 1.2 药物代谢及转运和DILI |
| 1.2.1 肝脏和药物代谢及转运 |
| 1.2.2 药物代谢及转运与DILI的关系 |
| 1.3 肝脏免疫系统及DILI的研究概况 |
| 1.3.1 基于免疫反应的DILI有害结局通路 |
| 1.3.2 肝脏的结构及组成 |
| 1.3.3 肝细胞 |
| 1.3.4 肝脏非实质性细胞 |
| 1.3.5 肝脏固有免疫与DILI |
| 1.3.6 适应性免疫与DILI |
| 1.4 DCF诱导的肝毒性研究进展 |
| 1.4.1 非甾体抗炎药和DILI |
| 1.4.2 DCF的代谢途径 |
| 1.4.3 DCF诱导的肝细胞毒性 |
| 1.4.4 DCF诱导的免疫肝毒性 |
| 1.4.5 细胞因子介导的协同毒性 |
| 1.4.6 LPS免疫应激介导的协同毒性 |
| 1.4.7 药物代谢酶及转运体的基因多态性 |
| 1.5 人源化DILI动物模型研究现状 |
| 1.5.1 人肝嵌合体小鼠模型 |
| 1.5.2 人拟化转基因小鼠模型 |
| 1.6 本课题研究目的和意义 |
| 1.7 本课题研究思路及内容 |
| 第二章 DCF及其代谢物诱导人拟化TgCYP3A4/hPXR小鼠急性肝毒性潜能的初步评估 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂 |
| 2.2.2 主要仪器及设备 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.2.4 主要相关溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 给药途径及剂量 |
| 2.3.2 动物实验 |
| 2.3.3 小鼠血清样品分离 |
| 2.3.4 血清ALT的检测 |
| 2.3.5 HE染色实验 |
| 2.3.6 肝脏GSH及GSSG的检测 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 临床观察 |
| 2.4.2 DCF及DCF代谢物对血清ALT的影响 |
| 2.4.3 DCF和DCF代谢物处理后小鼠病理检查结果 |
| 2.4.4 GSH/GSSG在DCF诱导的急性肝损伤中的作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 DCF及其代谢物代谢动力学与排泄特征研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器设备 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.2.4 主要相关溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物给药及样本采集方案 |
| 3.3.2 样本处理及检测 |
| 3.3.3 色谱条件 |
| 3.3.4 质谱条件 |
| 3.3.5 数据处理与统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 DCF及其代谢物LC-MS/MS检测方法的确定 |
| 3.4.2 不同品系小鼠对DCF急性肝毒性敏感性比较 |
| 3.4.3 DCF在不同品系小鼠中药物代谢动力学比较 |
| 3.4.4 DCF代谢物直接给药后含量分布以及与急性肝毒性相关性分析 |
| 3.4.5 DCF及其代谢产物在TgCYP3A4/hPXR小鼠中的排泄特征 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 DCF及其代谢物致急性肝毒性的肝脏转录组学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 实验设备仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 动物实验 |
| 4.3.2 肝脏total RNA的提取 |
| 4.3.3 肝脏转录组高通量测序 |
| 4.3.4 RNA逆转录实验 |
| 4.3.5 荧光定量PCR检测 |
| 4.3.6 数据处理及统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 肝脏转录组数据的统计分析 |
| 4.4.2 肝脏对DCF及其代谢物的基因组反应 |
| 4.4.3 DCF及其代谢物对肝脏基因生物学过程的影响 |
| 4.4.4 DCF和DCF代谢物诱导性急性肝损伤相关的KEGG通路分析 |
| 4.4.5 DCF和其代谢物诱导性急性肝损伤相关蛋白的互作分析 |
| 4.4.6 实时荧光定量PCR验证 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 DCF及其代谢物体内外免疫激活相关性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 主要实验试剂 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 实验细胞系 |
| 5.2.4 主要相关溶液的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞毒性实验 |
| 5.3.2 Caspase-1活性及IL-1β含量检测 |
| 5.3.3 混合细胞培养实验 |
| 5.3.4 血清细胞因子测定 |
| 5.3.5 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 DCF及其代谢物的体外细胞毒性评估 |
| 5.4.2 DCF对J774A.1/Hepa1c1c7共培养细胞的毒性评估 |
| 5.4.3 DCF代谢物处理J774A.1细胞上清对Hepa1c1c7的细胞毒性评估 |
| 5.4.4 DCF及DCF-G对J774A.1细胞的炎性刺激作用 |
| 5.4.5 DCF及其代谢物对血清中免疫相关因子的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 神经退行性疾病国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 Emc3基因研究历史与现状 |
| 1.2.2 神经退行性疾病发病种类和机制研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.3.1 主要贡献 |
| 1.3.2 创新 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 EMC3基因在神经退行性疾病发病机制的功能研究 |
| 2.1 课题背景 |
| 2.1.1 脑神经元病变 |
| 2.1.2 视网膜神经元病变 |
| 2.2 选题依据 |
| 2.2.1 EMC1基因突变导致脑和视网膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蝇感光细胞合成视紫红质和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以复合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 内质网相关蛋白的合成和降解途径 |
| 2.3.2 内质网应激介导的非折叠蛋白应答途径 |
| 2.4 研究流程和关键技术 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已经报道的EMC1突变进行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.4 内质网膜蛋白复合物亚基免疫共沉淀及WB检测 |
| 2.6 展望未来 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 Emc3缺失导致小脑共济失调和浦肯野细胞变性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验技术原理 |
| 3.2.2 实验所用材料 |
| 3.2.3 实验所用方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系统构建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技术对Emc3 CKO小鼠DNA进行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO条件性敲除小鼠生长发育异常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO条件敲除型小鼠小脑发育异常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO条件敲除型小鼠行为学异常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO条件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO条件型敲除小鼠进行性小脑萎缩和浦肯野细胞丢失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO条件敲除型小鼠浦肯野细胞变性和星形胶质细胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野细胞中Emc3 的缺失导致内质网应激 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 浦肯野细胞Emc3缺失影响小鼠的运动协调能力 |
| 3.4.2 星形胶质细胞激活与浦肯野细胞死亡的关系 |
| 3.4.3 浦肯野细胞Emc3缺失怎样激发内质网应激 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Emc3的丢失导致视网膜杆状双极细胞变性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 实验材料和方法 |
| 4.3.1 实验技术原理 |
| 4.3.2 实验所用材料 |
| 4.3.3 实验所用方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Emc3在视网膜上的表达定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表达水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠视网膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.5 感光细胞抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫组化和H&E染色结果 |
| 4.4.7 Emc3缺失损害视杆细胞和视杆双极细胞之间的突触传递 |
| 4.4.8 Emc3 CKO视网膜中的反应性神经胶质增生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 玻璃体视网膜病变FZD4和NDP基因突变研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 伦理声明 |
| 5.2.2 全外显子组测序和变异确认 |
| 5.2.3 表达质粒的构建 |
| 5.2.4 荧光素酶报告分析 |
| 5.2.5 FZD4在细胞中的表达研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 测序结果分析 |
| 5.3.2 突变FZD4 蛋白介导的Norrin信号缺陷 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（7）猪细小病毒诱导猪胎盘滋养层细胞自噬性死亡作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒诱导细胞自噬和细胞凋亡研究进展 |
| 1.1 动物病毒诱导细胞自噬研究进展 |
| 1.1.1 细胞自噬概述 |
| 1.1.2 动物病毒诱导的细胞自噬 |
| 1.2 动物病毒诱导细胞凋亡研究进展 |
| 1.2.1 细胞凋亡概述 |
| 1.2.2 动物病毒诱导细胞凋亡 |
| 1.3 动物病毒诱导细胞自噬和细胞凋亡的关系 |
| 1.3.1 细胞自噬促进病毒诱导的细胞凋亡 |
| 1.3.2 细胞自噬抑制病毒诱导的细胞凋亡 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪细小病毒诱导的猪胎盘滋养层细胞自噬对细胞凋亡影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒种和细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PTCs的培养 |
| 2.2.2 PPV的增殖及鉴定 |
| 2.2.3 PPV TCID50 测定 |
| 2.2.4 PTCs DNA片段化检测 |
| 2.2.5 流式细胞术检测PTCs凋亡率 |
| 2.2.6 PTCs中 Caspase活性检测 |
| 2.2.7 PTCs自噬对细胞凋亡影响检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPV的增殖及鉴定 |
| 2.3.3 PPV的 TCID50测定 |
| 2.3.4 PPV感染引起PTCs中 DNA出现片段化 |
| 2.3.5 PPV感染引起PTCs凋亡率升高 |
| 2.3.6 PPV感染引起PTCs的 caspase活性增强 |
| 2.3.7 PTCs自噬抑制PPV诱导的PTCs凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪细小病毒感染诱导猪胎盘滋养层细胞自噬性死亡 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒种和细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 流式细胞术检测细胞死亡率 |
| 3.2.2 siATG5转染 |
| 3.2.3 流式细胞术检测溶酶体膜通透性 |
| 3.2.4 细胞浆蛋白提取 |
| 3.2.5 western blotting检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PPV感染引起PTCs自噬性死亡 |
| 3.3.2 抑制细胞自噬阻止PPV感染PTCs中 DND26 MFI降低 |
| 3.3.3 PPV感染引起组织蛋白酶从溶酶体向细胞浆中释放 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 细胞自噬对猪细小病毒诱导自噬性死亡影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒种和细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 流式细胞术检测PTCs自噬性死亡率 |
| 4.2.2 流式细胞术检测溶酶体膜通透性 |
| 4.2.3 western blotting检测组织蛋白酶从溶酶体向细胞浆中释放 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 细胞完全自噬促进PPV感染PTCs自噬性死亡率增加 |
| 4.3.2 PPV感染诱导PTCs中 DND26 MFI降低 |
| 4.3.3 细胞完全自噬促进PPV感染PTCs中 DND26 MFI降低 |
| 4.3.4 细胞完全自噬促进PPV感染后期组织蛋白酶从溶酶体向细胞浆中释放 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 主要符号对照表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）蜱唾液腺组织退化中的细胞自噬和细胞凋亡的联络机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蜱的概述 |
| 1.2 蜱唾液腺的生物学特性 |
| 1.2.1 蜱唾液腺的结构与功能 |
| 1.2.2 蜱唾液腺退化的现象 |
| 1.3 哺乳动物中的细胞程序化死亡 |
| 1.3.1 细胞自噬 |
| 1.3.2 细胞凋亡 |
| 1.3.3 细胞自噬和细胞凋亡的联络通路 |
| 1.4 节肢动物昆虫中的细胞程序化死亡 |
| 1.4.1 昆虫中的细胞自噬 |
| 1.4.2 昆虫中的细胞凋亡 |
| 1.4.3 昆虫中的细胞凋亡和细胞自噬的联络通路 |
| 1.5 蜱中细胞自噬和细胞凋亡的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 蜱唾液腺退化时期细胞自噬和凋亡水平的动态检测和转录组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 镰形扇头蜱唾液腺的形态学及透射电镜(TEM)观察 |
| 2.3.2 TUNEL染色 |
| 2.3.3 蜱唾液腺的转录组测序及其差异分析 |
| 2.3.4 RT-qPCR检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的体外形态学观察 |
| 2.4.2 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的透射电镜观察 |
| 2.4.3 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的TUNEL染色 |
| 2.4.4 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的转录组差异分析 |
| 2.4.5 蜱唾液腺退化过程中大部分自噬相关基因的转录水平无显着变化 |
| 2.4.6 蜱唾液腺退化过程中细胞凋亡相关基因的转录水平显着升高 |
| 2.4.7 细胞自噬相关基因的转录高峰出现在细胞凋亡相关基因之前 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 蜱唾液腺中细胞自噬和细胞凋亡相关分子的初步鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺总RNA的提取 |
| 3.3.2 cDNA合成 |
| 3.3.3 自噬和凋亡相关基因的克隆与测序 |
| 3.3.4 细胞自噬和细胞凋亡基因的序列分析 |
| 3.3.5 自噬和凋亡相关基因的原核表达 |
| 3.3.6 重组蛋白的表达纯化 |
| 3.3.7 多克隆抗体的制备 |
| 3.3.8 Western blot鉴定多克隆抗体 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 细胞自噬和细胞凋亡基因的克隆 |
| 3.4.2 细胞自噬和细胞凋亡相关基因的序列分析 |
| 3.4.3 细胞自噬和细胞凋亡相关蛋白的表达纯化 |
| 3.4.4 多克隆抗体的鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 RHCASPASE-7、-8、-9 功能鉴定及其在蜱唾液腺退化中的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 商品化试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 不同发育阶段不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺总RNA的提取 |
| 4.3.2 cDNA的合成 |
| 4.3.3 RT-qPCR |
| 4.3.4 dsRNA的合成 |
| 4.3.5 RNA干扰 |
| 4.3.6 Western blot检测 |
| 4.3.7 TUNEL染色 |
| 4.3.8 真核表达载体的构建 |
| 4.3.9 真核质粒的共转染 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 不同发育阶段、不同组织不同吸血时间RhCaspase-7、-8、-9 的转录水平的变化 |
| 4.4.2 不同吸血时间唾液腺中RhCaspase-7、-8、-9的蛋白水平的变化 |
| 4.4.3 RhCaspase-7、-8、-9的RNAi |
| 4.4.4 RhCaspase-7、-8、-9 之间的相互作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 RHATG5调控蜱唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 商品化试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 蜱唾液腺的体外培养和20E处理 |
| 5.3.2 TEM检测 |
| 5.3.3 RT-qPCR |
| 5.3.4 Rh ATG5与Calpain蛋白酶的相互作用及活性位点的鉴定 |
| 5.3.5 TUNEL染色 |
| 5.3.6 多克隆抗体的制备 |
| 5.3.7 Western blot检测 |
| 5.3.8 间接免疫荧光(IFAT)检测 |
| 5.3.9 唾液腺中Ca2+浓度检测 |
| 5.3.10 ds Rh ATG5 的合成 |
| 5.3.11 Rh ATG5的RNAi(体内和体外) |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 快速吸血期的唾液腺中RhATG5在发生剪切 |
| 5.4.2 快速吸血期唾液腺内Ca2+浓度显着升高 |
| 5.4.3 一定浓度Ca2+条件下Rh ATG5 可被Calpain剪切 |
| 5.4.4 20E可诱导蜱唾液腺的细胞程序化死亡 |
| 5.4.5 高浓度20E引起唾液腺中Ca2+浓度升高介导Rh ATG5 的剪切 |
| 5.4.6 抑制RhATG5的表达可减缓蜱唾液腺的退化 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 宿主自噬相关蛋白BECLIN-1 参与调节蜱唾液腺的退化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验动物 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 dsRNA的合成 |
| 6.3.2 RhATG6的RNAi |
| 6.3.3 蜱唾液腺的质谱检测 |
| 6.3.4 Western blot检测 |
| 6.3.5 IFAT检测 |
| 6.3.6 RT-qPCR检测 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 干扰RhATG6可一定程度上抑制蜱的吸血 |
| 6.4.2 唾液腺质谱中发现了宿主来源的Beclin-1 的特异性肽段 |
| 6.4.3 不同组织不同吸血时间宿主来源的Beclin-1 的western blot检测 |
| 6.4.4 不同吸血时间血淋巴宿主来源Beclin-1的IFA检测 |
| 6.4.5 不同吸血时间唾液腺中宿主来源Beclin-1的IFA检测 |
| 6.4.6 显微注射重组蛋白Beclin-1 可导致蜱唾液腺的细胞程序化死亡 |
| 6.4.7 宿主Beclin-1 可被RhCaspases剪切 |
| 6.4.8 宿主来源的Beclin-1 可与Rh BCL-2 结合 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）基于p53通路新型黄酮螺环骨架衍生物的多靶点机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 p53基因 |
| 1.2.1 p53基因的概述 |
| 1.2.2 p53与MDM2负反馈调节维持自身稳定 |
| 1.3 p53的肿瘤抑制功能 |
| 1.3.1 p53抑制肿瘤细胞的增殖 |
| 1.3.2 p53促进肿瘤细胞的凋亡 |
| 1.3.3 p53抑制肿瘤细胞的迁移 |
| 1.3.4 p53抑制肿瘤细胞的血管生成 |
| 1.4 小分子p53-MDM2结合抑制剂 |
| 1.4.1 Nutlin类抑制剂 |
| 1.4.2 螺环羟吲哚类抑制剂 |
| 1.4.3 RG7388类抑制剂 |
| 1.5 黄酮类化合物及其抗肿瘤作用 |
| 1.6 多靶点药物设计 |
| 1.6.1 多靶点抗肿瘤药物研究进展 |
| 1.6.2 多靶点药物分子的设计方法 |
| 1.7 立题依据及主要研究内容 |
| 1.7.1 立题依据 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 第二章 靶标化合物的合成及体外抗肿瘤活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 课题设计思路 |
| 2.3 实验材料与仪器设备 |
| 2.3.1 细胞株 |
| 2.3.2 实验试剂 |
| 2.3.3 仪器与设备 |
| 2.3.4 试剂的配置 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 靶标化合物的合成 |
| 2.4.2 细胞培养 |
| 2.4.3 MTT法测定靶标化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用 |
| 2.4.4 正常细胞毒性测定 |
| 2.4.5 分子模拟对接 |
| 2.4.6 统计学分析 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 靶标化合物的合成及结构表征 |
| 2.5.2 靶标化合物体外抗肿瘤活性筛选 |
| 2.5.3 化合物3d和3e抑制肿瘤细胞增殖活性研究 |
| 2.5.4 化合物3d和3e的毒性分析 |
| 2.5.5 化合物3e与受体Akt、5-Lox及 MDM2 的分子模拟 |
| 2.5.6 化合物3d和3e诱导p53的激活 |
| 2.6 本章小节 |
| 第三章 化合物3d和3e抑制A549细胞增殖作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器设备 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.2.4 试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 肿瘤细胞集落形成测定 |
| 3.3.3 肿瘤细胞伤口愈合测定 |
| 3.3.4 肿瘤细胞迁移及侵袭测定 |
| 3.3.5 肿瘤细胞凋亡检测 |
| 3.3.6 肿瘤细胞周期检测 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 化合物3d和3e对A549细胞克隆形成的影响 |
| 3.4.2 化合物3d和3e对A549细胞软琼脂集落形成的影响 |
| 3.4.3 化合物3d和3e对A549细胞伤口愈合的影响 |
| 3.4.4 化合物3d和3e对 A549 细胞Transwell迁移的影响 |
| 3.4.5 化合物3d和3e对 A549 细胞Transwell侵袭的影响 |
| 3.4.6 化合物3d和3e对A549细胞凋亡形态学的影响 |
| 3.4.7 化合物3d和3e对A549细胞凋亡的影响(PI染色) |
| 3.4.8 化合物3d和3e对 A549 细胞凋亡的影响(AO/EB染色) |
| 3.4.9 化合物3d和3e对 A549 细胞DNA损伤的影响 |
| 3.4.10 化合物3d和3e对A549细胞凋亡水平的影响 |
| 3.4.11 化合物3d和3e对A549细胞周期的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 化合物3d和3e诱导A549细胞凋亡机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂与仪器设备 |
| 4.2.1 细胞株 |
| 4.2.2 实验试剂及耗材 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.2.4 试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 细胞内活性氧(ROS)测定 |
| 4.3.3 Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 酶活力测定 |
| 4.3.4 Western blot检测 |
| 4.3.5 Real-time PCR(RT-PCR)检测 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 化合物3d和3e对 A549 细胞内ROS的影响 |
| 4.4.2 化合物3d和3e对 A549 细胞内Caspase酶释放水平的影响 |
| 4.4.3 化合物3d对 A549 细胞内Bcl-2 家族及Cyt c蛋白的影响 |
| 4.4.4 化合物3e对 A549 细胞内Bcl-2 家族及Cyt c蛋白的影响 |
| 4.4.5 化合物3d对A549细胞内p53信号通路上相关蛋白的影响 |
| 4.4.6 化合物3e对A549细胞内p53信号通路上相关蛋白的影响 |
| 4.4.7 化合物3d和3e对A549细胞内p53相关靶基因的影响 |
| 4.5 化合物3d和3e诱导A549细胞凋亡的分子机制 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 化合物3d和3e急性毒性及体内抗肿瘤作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器设备 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 实验动物 |
| 5.2.3 实验试剂及耗材 |
| 5.2.4 仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 急性毒性测定 |
| 5.3.3 建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型及分组 |
| 5.3.4 小鼠Lewis肺癌实体瘤抑制率的测定 |
| 5.3.5 小鼠Lewis肺癌细胞凋亡检测 |
| 5.3.6 小鼠Lewis肺癌移植瘤瘤体蛋白的提取 |
| 5.3.7 Western blot检测 |
| 5.3.8 统计学分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 化合物3d和3e对 Balb/c小鼠急性毒性的影响 |
| 5.4.2 小鼠Lewis肺癌移植瘤病理检测 |
| 5.4.3 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠体重变化的影响 |
| 5.4.4 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠移植瘤体积变化的影响 |
| 5.4.5 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠实体瘤生长的抑制作用 |
| 5.4.6 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠实体瘤凋亡的影响 |
| 5.4.7 化合物3e对瘤细胞内Bcl-2 家族及Cyt c蛋白的影响 |
| 5.4.8 化合物3e对瘤细胞内p53信号通路上相关蛋白的影响 |
| 5.4.9 化合物3e对瘤细胞内VEGF、ICAM-1及MMP-2 蛋白的影响 |
| 5.5 化合物3e抑制Lewis肺癌小鼠体内移植瘤生长的作用机制 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 主要缩略词表 |
| 附录二 在读期间科研成果 |
| 附图一 化合物3d核磁图谱 |
| 附图二 化合物3e核磁图谱 |
| 附图三 化合物3e对移植瘤的抑制作用 |
| 附图四 化合物3e诱导瘤细胞凋亡 |
（10）LOX-1调控骨关节软骨损伤的作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 LOX-1在骨关节炎患者中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 体外实验评价LOX-1在骨关节炎中的作用和机制 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 体内实验评价LOX-1在骨关节炎中的作用和机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2. 方法 |
| 3. 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨关节炎基础和临床的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本文出版或公开发表的论着 |
| 致谢 |
四、DNA fragmentation in apoptosis and homeostasis（论文参考文献）
- [1]常温保存过程活性氧诱导猪精子凋亡的研究[D]. 牛统娟. 西北农林科技大学, 2021
- [2]两种禾本科植物髓腔形成过程中细胞程序性死亡特征及其机制研究[D]. 王玲丽. 西北大学, 2021(12)
- [3]肝癌自发性破裂的相关基因组学研究[D]. 张炎. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]PAK5介导的AIF磷酸化抑制其核移位并促进乳腺癌细胞增殖[D]. 邢瑶. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]双氯芬酸及其代谢物诱导的急性肝毒性和免疫活化研究[D]. 江伟凡. 华南理工大学, 2020(05)
- [6]EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究[D]. 朱雄. 电子科技大学, 2020(03)
- [7]猪细小病毒诱导猪胎盘滋养层细胞自噬性死亡作用研究[D]. 熊颖黎. 西北农林科技大学, 2020
- [8]蜱唾液腺组织退化中的细胞自噬和细胞凋亡的联络机制研究[D]. 王亚楠. 中国农业科学院, 2020
- [9]基于p53通路新型黄酮螺环骨架衍生物的多靶点机制研究[D]. 张文会. 贵州大学, 2019(05)
- [10]LOX-1调控骨关节软骨损伤的作用及机制的研究[D]. 沈鹏程. 苏州大学, 2019(06)