李前忠[1]1994年在《鱼抗冷冻多肽的分子结构和抗冻机理》文中指出许多生物体能够在较冷的环境中生存，也就是说它们有抗冷冻能力。而不同的生物体其抗冻能力也不一样。在南北两极和亚极地带，冬季海水温度可低于-1.9℃，然而多数鱼类(包括海水鱼和淡水鱼)的血液在-0.6℃时便开始冻结，使鱼致死。因此，有些鱼类要进行季节性迁移，冬季迁至温水或深水区域，在那里避过寒冬。而有一些鱼能够在这种过冷状态下生存，它们具有特异的抗冻功能。实验发现这些鱼有特异的抗冻功能的原因是由于在这些鱼的血清中有一类抗冷冻多肽链，也称为冰晶生长抑制因子。这些冰晶生长抑制因子能够降低鱼的血清的冰点温度。经过许多实验研究，人们从不同的极区鱼类中分离提取出了这些抗冷冻大分子。这些抗冷冻大分子大致可分为四类：一类是抗冷冻糖蛋白(AFGP)，它们是由重复的三肽链(Ala-Ala-Thr)组成，每个Thr上带有一个双糖。另外三类是不含双糖的抗冻蛋白(AFP)，第一类是富含丙氨酸的较小的抗冻蛋白(Mr 3-5K)，叫AFPⅠ，其二级结构为α螺旋；第二类是富含半胱氨酸的抗冻蛋白，叫AFPⅡ，分子量很大(Mr 14K)，其二级结构中有许多回折(reverse turn)；第三类是中等尺寸的抗冻蛋白(Mr 6-7K)，叫AFPⅢ，其二级结构完全不清楚，且既不富含丙氨酸又不富含半胱氨酸。 过去二十多年，人们对抗冻蛋白分子进行了多方面的研究，得出一些重要的结论：在有冰晶存在的抗冻蛋白和抗冻糖蛋白溶液中，如果溶液的温度是零度，溶液并不冻结，当继续降低溶液的温度时，溶液也不会冻结。只有当溶液的温度降低到一定值时，溶液才全部冻结。人们把这个值叫溶液的冰点，它的大小与抗冷冻蛋白类型和它的分子量有关。当升高抗冻蛋白溶液的温度时，发现如果温度在冰点以上，冰晶并不熔化，只有当溶液的温度升高到接近零度时冰晶才熔化。人们把冰晶开始熔化的温度叫溶液
薛娜[2]2006年在《昆虫抗冻蛋白基因的功能鉴定及遗传转化研究》文中认为物种在其长期的进化过程中,形成了一系列适应或抵御不良环境影响的生理对策。其中一种机制就是产生抗冻蛋白(又称热滞蛋白),它能够保护生物抵抗0℃以下的冻害。抗冻蛋白已从多种鱼类,植物及昆虫中分离得到,这种蛋白可以阻止冰晶生长或屏蔽异源冰核,通过吸附到晶核和冰晶表面来阻止结冰,能以非依数形式降低水溶液的冰点,但对熔点影响甚微,从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值。这种差值称为热滞活性,它是判断抗冻活性的重要指标。昆虫抗冻蛋白的研究主要在几种昆虫中展开,目前已有二十多种昆虫AFP被分离纯化。研究发现昆虫AFP的抗冻活性比鱼类和植物的高几十到一百倍,因而研究昆虫抗冻蛋白并利用抗冻蛋白在低温保存,器官移植手术等方面具有很好的应用前景,同时抗冻蛋白的异源表达,有可能提高植物的抗寒性能,从而使作物在低温胁迫环境中仍能正常生长并提高作物的产量。植物在自然界中生长,需要不断地与周围环境进行物质和能量的交换,外界环境对植物的影响决定着植物能否生存及其生存的适应状况。不良环境(如低温、高温、干旱、盐渍及有毒气体等)作用于植物,会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应,表现为代谢和生长的可逆性抑制,严重时甚至引发不可逆伤害导致整个植株死亡。研究植物对各种环境胁迫的耐受性及抗性,提高植物对这些胁迫的忍耐能力有着重要的现实意义。在各种胁迫中,低温对植物的影响尤为突出。自然环境下温度是决定植物地域分布的主要限制因子,在栽培条件下更影响着农作物及园艺植物等的产量和品质。由于植物的抗寒性为数量形状,受微效多基因控制,而传统的抗寒育种方法对提高植物抗寒性的作用不大。近年来,人们试图利用所分离到的各种动、植物基因通过基因工程对植物进行定向分子改良。由于昆虫抗冻蛋白热滞活性明显高于其它物种,将其抗冻基因的导入可能更有效地提高转基因植物的抗冻性。本研究利用实验室已克隆出的昆虫抗冻蛋白基因,先在原核表达系统中获得表达,制备抗血清,并验证了功能,再将抗冻蛋白基因构建植物表达载体,利用农杆菌介导法将昆虫抗冻蛋白基因整合进烟草基因组中,为进一步研究昆虫抗冻蛋白基因在植物中的
蔡文萍[3]2012年在《小胸鳖甲抗冻蛋白酵母表达条件优化及应用研究》文中进行了进一步梳理抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)最早是1969年Devries在极区海鱼血液中被发现,是一类抑制冰晶生长的蛋白质,能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微,从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值。这种差值称为热滞活性(thermal hysteresis activity, THA),因而AFP亦称为热滞蛋白(thermal hysteresis protein, THP)。具有三个基本特征：热滞效应(THA)、冰晶形态效应、重结晶抑制效应(RI),它广泛存在于多种生物体中,如鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌,其中昆虫抗冻蛋白是目前抗冻活性最高的一类抗冻蛋白。昆虫抗冻蛋白一般认为是在脂肪体中合成,然后释放到血淋巴中通过氢键与冰晶结合阻止冰晶生长从而保护自身。对昆虫抗冻蛋白的研究起步较晚,研究发现许多陆生昆虫都存在抗冻蛋白,并且昆虫抗冻蛋白具有非常高的热滞活性。小胸鳖甲(Microdera punctipennis)是分布于新疆荒漠极端环境中的拟步甲科昆虫,能耐受冬季的低温和春季剧烈的温差变化。其抵抗低温的机制与抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)的生物活性有关。抗冻蛋白可广泛应用于农业、医学、食品、工业等科学领域。天然抗冻蛋白来源十分有限,因此获取高活性高质量的抗冻蛋白日益成为舆待解决的问题。由于昆虫抗冻蛋白独特的结构和生物学活性(分子量小,蛋白亚型多)给分离纯化天然昆虫抗冻蛋白带来一定的难度。通过基因工程技术已对少数昆虫抗冻蛋白进行了表达和纯化。由于高活性的昆虫抗冻蛋白p-螺旋结构的正确折叠需要众多二硫键的参与,因而细菌表达系统中往往不能表达具有正确构象的高活性昆虫抗冻蛋白或者是产生不可溶的包涵体蛋白,这类蛋白必须经过变性、复性、重折叠过程之后才能获得正确折叠的有活性的抗冻蛋白,且该过程往往需要较复杂的纯化方法,不适于大量生产。近年有用酵母表达系统来表达富含二硫键的昆虫抗冻蛋白的报道。但是到目前为止还没有获得生产活性抗冻蛋白的高产表达系统。因此采用基因工程技术获取昆虫抗冻蛋白仍是需要解决的问题。巴斯德毕赤酵母表达系统具有如下优点：在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源,但不存在像细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题：具有真核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境,使生产的蛋白具有天然的空间结构及生物学活性；有两个编码乙醇氧化酶基因：AOX1、AOX2,其中AOXI基因的表达主要受较高水平的甲醇诱导和调节。毕赤酵母既保持了酿酒酵母的优点,还能大幅度提高外源蛋白的产量。本研究采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698,通过筛选高拷贝转化菌株,并对巴斯德毕赤酵母表达条件进行优化；同时对真核表达的MpAFP698的低温保护活性、酸碱及热稳定性进行测定；检测MpAFP698对小鼠脏器,昆虫卵细胞SF9及葡萄的低温保护作用。主要研究结果如下：1.构建真核表达载体pPIC9K-Mpafp698,转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris,筛选获得重组子后甲醇诱导巴斯德酵母表达系统表达小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698。提取已经获得的酵母重组子基因组,PCR鉴定目的基因的整合及转化子的Mut表型,小量摇瓶发酵后取上清液作Tricine SDS-PAGE电泳和免疫印迹(Western blotting)分析。结果表明Mpafp698基因成功整合到宿主菌的基因组中,且所有的His+阳性转化子均为Mut+表型；经诱导发酵MpAFP698表达正确。2.采用不同浓度G418抗性筛选高拷贝阳性转化子,诱导表达MpAFP698后对其蛋白浓度,THA, SCP,之间的相关性进行分析；并检测重组抗冻蛋白MpAFP698的耐酸碱性和耐热性,同时测定内源表达MpAFP698的酵母菌的耐寒性及外源添加MpAFP698对细菌的保护活性。在MD平板上筛选到His+阳性克隆,经G418抗性筛选,获得高拷贝阳性转化子；同时昆虫抗冻蛋白MpAFP698具有较强的热稳定特性,可以耐受100℃高温,并能维持10-15min而使活性变化不大。MpAFP698具有较强的酸碱稳定特性,可耐受极端酸碱环境。表达MpAFP698的酵母菌耐寒性显著提高；MpAFP698可显著提高菌体在-7℃及42℃的存活率。3.对工程菌发酵甲醇诱导浓度、诱导时间及温度条件进行优化。研究表明,在甲醇浓度为1.0%,温度为25℃时,发酵时间为4d时MpAFP698的表达量最高。4.检测低温条件下小胸鳖甲抗冻蛋白对小鼠脏器细胞形态、血细胞的溶血、昆虫SF9细胞存活率以及低温保存葡萄的影响,表明小胸鳖甲抗冻蛋白可显著改善冷冻小鼠肝脏等的细胞形态,明显降低血细胞在4℃的溶血并提高SF9细胞冻融后的存活率；同时可显著提高不同葡萄品系4℃保存时的保水率。本研究为小胸鳖甲抗冻蛋白的大规模真核发酵研究提供了参考,同时为进一步揭示昆虫抗冻蛋白抗冻保护活性机理奠定了理论基础。
于晶[4]2009年在《寒地冬小麦东农冬麦1号抗寒机理研究》文中提出小麦营养价值丰富,经济价值较高,在中国是仅次于玉米和水稻的重要粮食作物。小麦有冬小麦和春小麦两种类型。冬小麦从分蘖期到拔节期跨越整个冬季,使其种植区域受到限制,在黑龙江省等北方寒地冬季温度极低,导致冬小麦不能安全越冬,成为冬小麦种植的禁区,常年以种植春小麦为主,而春小麦分蘖能力差,成穗率低,且在生产过程中经常受到春旱、春涝、收获期高温多雨等诸多不良因素的制约,结果导致年际间产量不稳,生产成本偏高。若能种植冬小麦就能很大程度的避开春旱、春涝及收获期高温多雨对其造成的不利影响,产量比春麦可提高约30%。“东农冬麦1号”是唯一可以在黑龙江省安全越冬的冬小麦品种,田间返青率在80%以上。以往对抗寒性的研究大部分都是在室内模拟低温条件下进行品种间的抗寒性比较,与其自然生长的环境温度及光照条件(光照条件与抗寒性直接相关)存在差异,特别是不能很好实现逐级降温适应锻炼。此外,对小麦抗寒性的研究多以苗期幼嫩叶片为取材部位,而北方高寒地区小麦实现越冬的主要部位是地下器官。因此,品种室内模拟低温环境的抗寒性研究结果难以代表其在大田的实际情况,对指导作物抗寒育种及生产有一定的局限性。本研究以东农冬麦1号为试验材料(济麦22为对照,该材料来自山东),在田间自然降温条件下,观察幼苗习性及返青率;测定不同器官与抗寒相关的生理生化变化、解剖结构变化,揭示冬小麦抗寒性的生理基础和结构基础;通过不同方式不同浓度外源施用植物生长调节剂,探索小麦抗寒的激素调控机制;通过双向电泳结合质谱技术挖掘抗寒相关蛋白,揭示冬小麦抗寒的分子基础。该研究对于揭示冬小麦的抗寒机制、挖掘抗寒相关新蛋白,具有重要的理论和实践意义,为今后我国北方寒地选育抗寒小麦种质资源及冬小麦新品种的选育提供理论依据和技术支持。研究结果如下:(1)越冬麦苗的生长习性及返青率东农冬麦1号越冬期幼苗匍匐于地面生长,返青率与土壤含水量及温度直接相关,含水量在25%左右最适于该品种生长及返青,随着低温时间的延长及温度的降低,返青率略有下降,幅度在60%~100%。在一定范围内,温度与返青率间呈极显著正相关,含水量与返青率呈负相关。(2)越冬期前麦苗的生理生化变化东农冬麦1号各器官(根、分蘖节和叶片)在抗寒性上的代谢适应和物质准备表现为如下规律:相对含水量高低依次为分蘖节>根>叶片;可溶性糖含量依次为分蘖节>根>叶片;蛋白质含量依次为叶片>分蘖节>根;脯氨酸含量表现为前期为分蘖节>根>叶片,中期为根>分蘖节>叶片,后期为分蘖节>叶片>根;过氧化物歧化酶(POD)活性大小依次为分蘖节>根>叶片;超氧化物酶(SOD)活性大小表现为前期分蘖节>叶片>根,后期为叶片>分蘖节>根;相对电导率大小依次为根>分蘖节>叶片;脱落酸(ABA)含量表现为前期叶>节>根,后期节>叶>根;赤霉素(GA)含量依次为叶>根>节;生长素(IAA)含量前期为叶>节>根,后期为叶>节>根;玉米素(ZR)含量依次为节>叶>根。总体表现为分蘖节的抗寒代谢适应和物质准备能力最强,是小麦安全越冬的重要器官,对其第二年的返青具有直接影响。东农冬麦1号分蘖节中的SOD活性、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、ABA、ZR及IAA各指标之间呈现出不同程度的相关,表明各生理指标是协同作用,共同影响小麦的抗寒性,其中可溶性糖含量与其它6项指标之间均达到了显著相关,说明可溶性糖的含量对东农冬麦1号抗寒性的影响非常重要。(3)植物生长调节剂对麦苗抗寒性的调节外源ABA对东农冬麦1号的抗冷性有很大影响,低浓度的ABA可以提高低温下麦苗的生长,而高浓度则抑制生长,ABA提高抗冷性的最适浓度为10-7M;苗期低温下,ABA可以提高叶绿素含量、可溶性糖、可溶性蛋白含量,提高SOD活性、降低膜透性。根浸ABA对提高幼苗抗冷效果要强于叶喷ABA。大田分蘖前期根际浇灌不同浓度(10-7、10-6、10-5、10-4 M)ABA、GA、6-BA可以影响东农冬麦1号的返青率,其中ABA及6-BA均提高返青率,10-5 M返青率增加效果最明显,GA降低返青率,10-4 M时返青率降为0。(4)抗寒相关蛋白在pH 4~7范围内,东农冬麦1号分蘖节蛋白质双向电泳表达图谱中发现56个蛋白质点在-30℃低温的表达量与5℃低温有明显差异(±2倍以上),通过质谱分析及数据库检索均得到了完整的肽指纹图谱。在这些蛋白中逆境蛋白占14.3%(包括抗病蛋白、类抗病蛋白、热激蛋白、热激蛋白70前体、热激蛋白70、热激蛋白90、冷诱导蛋白、干旱敏感蛋白、过氧化物酶及过氧化物酶前体等,在低温后表达量上调)、代谢相关蛋白占23.2%(包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、苹果酸脱氢酶、腺苷酸α水解酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶F0-F1 ATP羧化酶α亚基、脂氧化酶、四氢叶酸还原酶、淀粉合酶、核糖核酸酶等在低温胁迫条件下它们的表达量上调或下调)、信号分子蛋白占17.9%(包括酪氨酸激酶、丝裂原活化蛋白激酶、丝苏氨酸蛋白激酶、类CBF蛋白、钙调蛋白、类钙结合蛋白、转录因子等)、未知功能蛋白占17.9%,其他类蛋白占26.8%。这些蛋白的高量或低量表达可能对东农冬麦1号抗寒具有重要作用。对蛋白液进行冰棱晶体结构观察表明,随着温度的降低,冰棱晶体结构发生明显的变化,说明已经有抗冻蛋白在分蘖节中产生。(5)冬小麦抗寒的组织细胞解剖结构东农冬麦1号各器官(根、叶、分蘖节)在-15℃左右低温下结构仍很完整。叶片细胞间隙大,根系射线细胞小,分蘖节内部交织着大量纵横交错的疏导组织。低温后叶绿体依然呈椭圆形,类囊体基粒片层和基质片层跺叠整齐,沿叶绿体的长轴平行排列,均匀分布于叶绿体中。线粒体略微肿胀,但没有嵴消失现象。这些结构特点进一步证实了东农冬麦1号的强抗寒性。
王艳[5]2008年在《昆虫抗冻蛋白基因转化烟草抗寒性功能的研究》文中研究说明抗冻蛋白(AFP)是广泛存于各种生命体中的一种高效抗冻活性物质,它能以非依数的形式(冰晶的熔点温度与其生长点温度不具有相同的变化)降低水溶液的冰点而对熔点影响甚微,因而保护多种有机体免受结冰引起的伤害,其抗冻活性通常定义为热滞值,大小用热滞系数表示。比较来源不同的多种抗冻蛋白的热滞活性,昆虫抗冻蛋白的热滞值最高为3～6℃,因而昆虫抗冻蛋白基因目前越来越多地做为提高植物抗寒性转化的首选基因。本实验室从新疆极地荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲中克隆了抗冻蛋白基因MpAFP149 (含信号肽),它编码120个氨基酸残基,分子量大小为12.7 kDa。去除信号肽的成熟肽含有98个氨基酸,理论分子量大小为10.2 kDa。在成熟的蛋白质序列中,一级结构由l2个氨基酸TCTxSxxCxxAx (X表示其它的任意氨基酸残基)的TXT重复序列组成,每隔6个氨基酸残基,就有一个半胱氨酸重复,除了第一和第二个重复序列,其他重复单位中的每两个半胱氨酸形成一个二硫键。本试验中我们构建了含有MpAFP149基因的不同植物表达载体,采用不同的转化方式转化模式植物烟草,试探讨新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因在植物体内的抗寒功能及提高昆虫抗冻蛋白在植物体内表达和热滞活性的几种途径和方法。以高效的烟草核转化体系为平台,构建了含有新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MpAFP149的核单价植物表达载体,通过叶圆盘法转化模式植物烟草,获得了2株转录水平较高的T1代转基因植株T1-5和T1-39。在-1℃处理1 d、2 d和3 d的抗寒实验中,转基因烟草的抗寒能力明显优于野生型烟草。当低温处理1 d时,转基因烟草和对照野生型烟草的离子外渗率都有一定程度的上升但差异不大。当低温处理延长至2 d时,野生型烟草的电导率达到65%,而转基因烟草T1-5和T1-39的相对电导率仅分别为28%和27%。当处理第三天时,相对电导率的增长趋势与第二天相似,野生型烟草、T1-5和T1-39的相对电导率分别为71%,28%和36%。丙二醛是反应植物细胞膜脂过氧化程度的一个指标,它含量的变化可间接反应相对电导率的变化。冷处理前,野生型和转基因烟草的丙二醛差异不大,但随着低温处理时间的延长,野生型烟草的丙二醛含量是转基因烟草丙二醛含量的3倍。结果表明野生型烟草遭受了比转基因烟草更为严重的膜脂氧化伤害。同时丙二醛和相对电导率的含量都随着低温处理的延长而增加,二者之间存在明显的相关性,相关系数为R2=0.9132,这表明相对电导率的提高是由于低温引起的膜脂过氧化造成的。T1代单价转基因烟草(pCAMBIA1302-MpAFP149)在低温下的表型及生理生化结果进一步揭示了准噶尔小胸鳖甲昆虫抗冻蛋白MpAFP149能够赋予植物一定程度的耐寒性。国外学者在体外试验中发现,小分子物质柠檬酸可提高昆虫抗冻蛋白的热滞活性,柠檬酸是抗冻蛋白的增强剂。为了进一步提高抗冻蛋白在植物体内的热滞活性,利用RT-PCR技术扩增了烟草柠檬酸合成酶基因tacs,使其构建至单价植物表达载体pCAMBIA1302-MpAFP149中,最终构建成一个同时含有MpAFP149和烟草柠檬酸合成酶基因tacs的植物双价表达载体pCAMBIA1302-MpAFP149-tacs,转化至农杆菌EHA105中。利用叶圆盘法转化烟草,获得了T1代双价转基因烟草。对T1代单价和双价转基因烟草进行了体外-1℃低温试验,转基因烟草的表型明显优于野生型烟草,但单双价转基因烟草之间的表型差异不大。室温恢复中,转基因烟草可恢复生长并仍能存活,而野生型烟草已造成了不可逆的低温伤害。试验结果表明含有昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149的单双价转基因烟草均表现出比野生型烟草较强的抗寒能力,但柠檬酸在植物体内未能协同抗冻蛋白进一步提高双价转基因烟草的抗寒性。由于叶绿体基因工程能有效解决当前转基因植物中外源基因表达量过低的问题,因而构建了抗冻蛋白基因MpAFP149的叶绿体表达载体,转化植物,旨在提高异源蛋白在植物中的表达量,从而进一步提高植物的耐寒性。根据已构建的大豆叶绿体表达载体,设计特异性引物,将昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149插入此载体中,利用基因枪轰击法,转化烟草,经500 mg/L壮观霉素的反复多轮筛选获得四株转基因株系。在-1℃抗寒表型实验中,叶绿体型转基因烟草的耐寒性优于野生型烟草,与核转化的T1代单价转基因烟草抗寒性差别不大,推测可能是由于异源基因MpAFP149在烟草叶绿体基因组中同质化程度较低所造成。通过激光扫描共聚焦和免疫胶体金技术显示异源抗冻蛋白MpAFP149主要表达在转基因植物质外体空间的细胞壁上。透射电镜对-1℃连续三天低温处理的细胞器形态学变化进行比较,转基因烟草和野生型烟草的超微结构存在差异,尤其表现在细胞膜、叶绿体和线粒体的膜上。这种超微结构差异可能是由于异源表达的抗冻蛋白与细胞壁间发生相互作用,同时降低了植物细胞的冰点,因而抑制了质外体中冰晶的生长稳定了膜系结构,避免了细胞的冻害,最终提高了转基因烟草细胞的冷耐受性。总之本试验获得的转基因烟草在-1℃抗寒实验中均比野生型烟草表现一定的抗寒能力,说明此昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149无需进行密码子优化就可有效地在植物体内进行正确表达,可以做为今后转化作物的抗寒首选基因。该结果为减轻新疆冷敏感经济作物棉花在春季遭受冻害及葡萄冬季掩埋等问题提供了理论依据和应用基础。
参考文献：
[1]. 鱼抗冷冻多肽的分子结构和抗冻机理[D]. 李前忠. 内蒙古大学. 1994
[2]. 昆虫抗冻蛋白基因的功能鉴定及遗传转化研究[D]. 薛娜. 新疆大学. 2006
[3]. 小胸鳖甲抗冻蛋白酵母表达条件优化及应用研究[D]. 蔡文萍. 新疆大学. 2012
[4]. 寒地冬小麦东农冬麦1号抗寒机理研究[D]. 于晶. 东北农业大学. 2009
[5]. 昆虫抗冻蛋白基因转化烟草抗寒性功能的研究[D]. 王艳. 新疆大学. 2008