于继云[1]2002年在《CTLA4-Ig的表达、修饰和肿瘤免疫治疗策略性研究》文中进行了进一步梳理CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2、CH3区组成的融合蛋白,可以与B7结合,通过阻断B7与CD28的结合,从而阻断B7介导的T细胞活化必需的共刺激信号,可作为免疫抑制剂用于器官移植。在本研究中,我们将CTLA4Ig融合分子克隆到真核表达载体pCI-dhfr,并用脂质体方法转染到COS7和CHO-dhfr细胞中,转染的CHO-dhfr-细胞用氨甲喋呤(MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT-PCR,ELISA,细胞免疫荧光染色和Western-blot进行鉴定。最后采用protein A纯化重组蛋白质。 CTLA4是T细胞表面T细胞活化的负调控因子,和CD28同样为B7分子的配体。虽然T细胞表面的CTLA-4表达非常少,其表达丰度仅为CD28的2%-3%,但CTLA-4与B7分子的结合力要比CD28与B7的结合力高20-50倍。。因此,CTLA-4具有优先结合B7分子的特性,其作用在于传递阴性第二信号,调节T细胞活化。CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2、CH3区组成的融合蛋白,与细胞表面的B7分子结合后,可以起到封闭作用。利用多种方法研究表明,CTLA4Ig是一种新型的人源性粘附分子类免疫抑制剂,治疗以T细胞为主介导的移植排斥反应是其最具潜力的应用领域。另外,抗CTLA4抗体还能够有效地用于抗肿瘤治疗。本研究将CTLA4Ig融合分子克隆到含二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的真核表达载体pCI-dhfr中,并转染到CHO-dhfr细胞中获得了稳定表达,为进一步筛选高表达的工程细胞株奠定了基础。
高剑[2]2012年在《IDO1和IDO2在胆囊癌细胞免疫耐受形成中的作用机制研究》文中认为原发性胆囊癌（primary carcinoma of the gallbladder,PCG）是胆道系统常见的恶性肿瘤,居消化道肿瘤的第5～6位。PCG患者常有胆囊结石等疾病的掩盖，早期诊断率仅为9.1%，就诊时往往已到晚期，失去手术机会，而传统的化疗和放疗疗效不明显，因此PCG患者5年生存率仅为4.9%。随着肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学等相关学科的迅速发展，肿瘤的免疫治疗已成为继传统治疗方法如手术、放疗和化疗后的一种新的治疗方法。为了发挥肿瘤免疫治疗的最佳疗效，人们有必要对影响免疫治疗效果的肿瘤免疫耐受机制有一个清楚而全面的认识。研究表明吲哚胺2，3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,IDO1)介导的肿瘤免疫耐受已成为研究热点。在多种肿瘤组织中有高表达，通过降低肿瘤微环境中色氨酸浓度来抑制淋巴细胞的增殖。而吲哚胺2，3-双加氧酶2(indoleamine2,3-dioxygenase2,IDO2)，为最近研究发现的一种与IDO1结构相似的蛋白，推测其在肿瘤免疫耐受形成中也起着重要的作用。那么IDO1和IDO2在胆囊癌组织中表达情况如何？在免疫耐受形成中各起什么作用？目前尚未有文献报道，本课题进行了以下两方面的研究：一、IDO1与叉状头转录因子3(Forkhead box P3，FOXP3)在胆囊癌组织中的表达情况及临床意义探讨；二、IDO1，IDO2在胆囊癌细胞中的表达及在免疫耐受中作用的机制研究。论文一IDO1和FOXP3在胆囊癌组织中的表达及临床意义探讨IDO1是一种细胞内含亚铁血红素的酶,通过催化氧化裂解色氨酸分子中的吲哚环,从而使色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢，IDO1在肿瘤免疫耐受中起到重要作用。当肿瘤抗原刺激巨噬细胞和树突状细胞后,就会通过产生IDO1来改变微环境内色氨酸及其代谢产物的局部浓度来抑制淋巴细胞的肿瘤抗原特异性克隆增殖,而肿瘤细胞在IFN-γ刺激下产生的IDO1也能够使其免受机体的免疫系统攻击。FOXP3被认为是调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的特异性标志，Tregs能以自分泌的形式分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子，抑制抗原特异性的CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞和自然杀伤细胞的功能。IDO1和Tregs之间存在着调节环路。可相互作用促进彼此的表达，在多种肿瘤中有高表达，推测其两者在胆囊癌组织中也呈高表达。目的研究IDO1、FOXP3在原发性胆囊癌组织中的表达情况及临床意义的探讨方法采用免疫组化SP法检测51例原发性胆囊癌组织、90例慢性胆囊炎组织和20例正常胆囊组织中IDO1和FOXP3的表达情况。结果1. IDO1在胆囊癌、胆囊炎、胆囊结石组和正常对照组胆囊粘膜中的表达率分别为72.5%(37/51)、11.1%(10/90)和5.0%(1/20),淋巴细胞中FOXP3的表达率分别为60.8%(31/51)、32.2%(29/90)和20.0%(4/20),IDO1和FOXP3在胆囊癌与慢性胆囊炎、胆囊结石组、正常对照组中的阳性率比较,差异均有统计学意义(IDO1:X2=65.44,P<0.01;FOXP3: X2=14.81,P<0.01)；2.胆囊癌在Nevin不同分期、有无淋巴结或远处转移、有无伴发胆囊结石组间的IDO1和FOXP3的阳性率表达差异均有统计学意义(P均<0.05),而不同性别、年龄、组织学分化程度间IDO1和FOXP3的阳性率表达差异均无统计学意义(P均>0.05)；3.胆囊癌组织中IDO1阳性表达率69.8%与FOXP3阳性表达率58.1%之间存在显着正相关(r=0.406,P=0.003)。结论IDO1和FOXP3二者可能以协同作用形式参与了胆囊癌免疫耐受的形成，IDO1可能成为胆囊癌免疫治疗的新靶点。论文二IDO1和IDO2在胆囊癌细胞免疫耐受形成中的作用机制研究IDO1是一种细胞内含亚铁血红素的酶通过催化氧化裂解色氨酸分子中的吲哚环,从而使色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢。IDO1在肿瘤免疫逃逸中起到重要作用，因此,目前认为IDO1的高表达是导致机体对肿瘤产生免疫耐受的重要因素之一。最近研究发现,有一种在编码基因序列、分子结构及生物活性上与IDO1十分相似的物质，它被命名为IDO2，发现抑制IDO2比抑制IDO1在抑制肿瘤生长方面更有效果。推测其在免疫耐受中也起到重要作用。因IDO2为近几年才发现的色氨酸分解酶，所以前期研究的IDO现在被称为IDO1.目的探讨IDO1、IDO2在胆囊癌细胞株SGC-996中的表达及在免疫耐受形成中的作用方法1.用免疫印记法及免疫荧光检测不同浓度IFN-γ刺激人胆囊癌细胞SCG-996后IDO1、IDO2的表达情况；2.用RNA干扰分别沉默胆囊癌细胞株SGC-996中IDO1、IDO2蛋白的表达，用免疫印记法检测沉默效果；3.高效液相色谱法（HPLC）检测分别干扰IDO1、IDO2后培养基中犬尿酸的变化，进而评估IDO酶活性的变化。4.用人外周血淋巴细胞与SGC-996分别干扰IDO1、IDO2培养基共培养24h后，收集外周血淋巴细胞，Annexin V/PI双标记检测人外周血淋巴细胞凋亡。结果1. Western blot检测结果显示，随着IFN-γ加入浓度由低到高，胆囊癌细胞株SGC-996中IDO1表达与IFN-γ成剂量依赖的关系；在无IFN-γ刺激下无表达，随着IFN-γ浓度的增加表达也增多。IDO2无论在有无IFN-γ，或IFN-γ浓度高低，呈都恒定表达。2.共聚焦显微镜在检测IDO1时，无IFN-γ时，IDO1含量很低，在有IFN-γ刺激时，IDO1表达增加，IDO1定位于细胞浆中。而IDO2却恒定表达，不受IFN-γ的影响，定位于胞浆和细胞核内。3. HPLC发现无IFN-γ刺激和沉默IDO1时，培养基中犬尿氨酸浓度几乎为零，而在沉默IDO2、CTL、Mock组中犬尿酸的浓度明显增加。沉默IDO1组和沉默IDO2、CTL、Mock组之间差异有统计学意义（p＜0.01），表明IDO1和IDO2同时在IDO酶催化色氨酸分解为犬尿氨酸的过程中，IDO1起主要作用。4.流式细胞仪分析不同的条件培养基与人外周血淋巴细胞培养1天后，在阴性组、IDO1沉默组、IDO2沉默组死亡率分别为0.8%、1.1%、1.9%，而在阳性对照组中晚期凋亡及死亡细胞增多，分别为15.4%、12.4%、13.6%。IDO1沉默组、IDO2沉默组与阳性对照组差异有统计学意义。结论：IDO1在IDO酶催化活性中起主要作用，抑制胆囊癌细胞中IDO1或IDO2的活性可减少淋巴细胞死亡，为研究IDO1、IDO2在免疫耐受形成中的作用提供依据。
胡贵方[3]2003年在《表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究》文中研究指明乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的严重威胁人类健康的传染性疾病，目前全球范围内大约有超过3.5亿人受到HBV危害。大约有15～40％的HBV感染者最终会发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝硬化和肝衰竭。我国是乙型肝炎主要的流行区，现患慢性乙型肝炎的病人已突破1000万。迄今为止，慢性乙型肝炎的治疗仍无良策，因此，研制新型HBV疫苗和寻求有效的治疗乙型肝炎的手段迫在眉睫。2型重组腺相关病毒(adeno-associated vires type 2，rAAV-2)作为一种大有希望的基因转移载体，因能有效转导多种组织和细胞而引起了人们的高度重视。为此，本研究以研制新型HBV疫苗为目的，构建了表达HBV外膜主蛋白、大蛋白基因的rAAV-2，初步研究了其免疫原性，并探讨了表达HBV抗原基因的rAAV-2用于以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。 采用PCR法从PTHBV—1质粒中扩增HBV(ayw亚型)外膜主蛋白(HBsAg)、大蛋白(LHBsAg)基因；将PCR扩增产物插入rAAV-2表达质粒pSNAV中，构建重组质粒pSNAV-HBsAg和pSNAV-LHBsAg；用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK—21细胞中，G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因细胞系BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg；用具有rAAV包装功能的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc/ΔUL2)感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg，纯化后得到rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg；用高效液相色谱仪(HPLC)检测和SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测了rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg的纯度；以点杂交方法检测重组病毒的物理滴度；ELISA检测混合细胞系博士论文:，、HB、，卜膜主蛋。、、蛋。、重组腺，关病毒的构减巍免。性研究BHK一HBsAg和BHK~LHBsAg中表面抗原(HBsAg)的表达，rAA认HBsAg和rA戌认LHBsAg在BHK一21细胞和293细胞中的表达。结果表明，H卫LC分析显示主峰为总面积大于99%;SDS一PAGE电泳结果显示3条特征性条带，其间的杂蛋白量非常少;点杂交检测rA戌瞬2一HBsAg和rAA认2.LHBsAg的物理滴度分别为sxlo，‘和ZxlolZ virusp耐cles/nil(vp翔吐);混合细胞株BHK一HBsAg中HBsAg的表达量为28.6士6.7ng乃x ro6eells，BHK~LHBsAg中HBsAg的表达量为15.4士5.5 ng zsxl06eeus;rA戌认2~HBs^g和rAAv-2~LHBsAg感染BHK一21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达，表达量随感染复数(伽ltiplicityofinfection，MOI)的增加而升高。提示我们已经获得了高滴度、高纯度、在体外能有效地感染培养细胞的rAAV-2一HBsAg和rAAv-2.LHBSAg，为下一步工作奠定了基础。 本文首次报道了rA戌认2载体介导HBV抗原基因用于HBV疫苗的研究。通过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲给药途径，我们观察了rA入v-2~HBsAg和rAA认2.LHBsAg在小鼠体内的转导效率和诱导小鼠产生HBv抗原特异性的体液和细胞免疫反应的能力。结果显示，rAAv-2~HBsAg和rAAv-2.LHBsAg通过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲途径进入小鼠体内后能有效表达HBsAg，同一给药途径，rA戌瞬2.HBsAg和rA入叭2~LHBsAg在小鼠体内HBsAg的表达水平无明显差异(p>0 .05);同一重组病毒(rA戌认2一HBsAg或rAAV一2一LHBsAg)不同给药途径之间HBsAg的表达水平亦无明显差异(p>0 .05)。重组病毒通过不同途径在小鼠体内表达的同时，可在较长时间(80天)诱导小鼠产生HBV抗原特异性的体液和细胞免疫反应:不同给药途径之间的免疫效果比较发现，肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲都能诱发机体产生HBV保护性抗体和激发CTL产生，但以尾静脉注射效果最好，腹腔注射、肌肉注射和胃饲叁者之间差别不大 (p>0 .05);在各种给药途径中，免疫反应能否出现、以及免疫反应的强度与剂量(给予的重组病毒颗粒数)有关。结果提示，基于rAAV载体的HBV疫苗，对于防止HBV感染，尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗和应用于对现有HBV疫苗无反应的患者无疑具有潜在的应用价值，值得做进一步的系统研究。 近年来，以DC为基础的免疫治疗已成为抗肿瘤和抗感染等研究的热点，本文也探讨了表达HBV抗原基因的rAA认2载体用于DC为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。首先，我们用表达报告基因一绿色荧光蛋白(GFP)基因和荧光素酶(luciferase，Luc)的rA月认2(分别简称为rAA认GFP和rAAV-Luc)感染了人外周血单核细胞来源DC以观测感染效能，在激光共聚焦显微镜观察了F仃C博士论文:表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究(fluorescein 150而Ocyanate，FITC，异硫氰酸荧光素)标记的rAA认2进入Dc的动态过程;结果显示，激光共聚焦显微镜下观察到了rAAV-2能进入DC;只有当Mol(multiplicity of infeetion，感染复数)大于1 X losvp/c ell时，乙AAV-2一lue和rA戌认2一GFP才能有效感染DC，需较高的MOI值的重组病毒才能有效感染Dc，报告基因的表达水平在MOI值为1 X 105一5 x 106vPlcell之间呈剂量依赖趋势，此后再提高MOI值并不能明显提高表达水平，感染后的DC表达水平不高。表明rAA认2可以有效感染DC，但转导效率?
王一芳[4]2004年在《CTLA4Ig局部转基因治疗大鼠小肠移植急性排斥实验研究》文中研究表明一、大鼠同种异体在体异位节段小肠移植模型的建立 目的 为研究抗小肠移植排斥治疗提供良好的动物实验模型。 方法 选用大鼠进行同种异体异位节段性小肠移植。重建供肠血管采用腹主动脉-肾下腹主动脉吻合以及门静脉-肾下下腔静脉吻合。 结果 共施行96例移植手术，模型稳定后的56例小肠移植5天成活率为85.71％。 结论 本模型制作成功率较高、适合小肠移植排斥研究。 二、大鼠移植肠局部CTLA4Ig基因转染的可行性研究 目的：探讨CTLA4Ig基因能否在移植小肠局部转染表达。 方法：移植前经肠系膜上动脉给供肠灌注脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA重组质粒，应用免疫组织学及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)观察移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达。 结果：免疫组织学及RT-PCR结果显示在移植后48h移植小肠中有大量CTLA4Ig转基因产物的表达。 结论：经肠系膜上动脉体外灌注脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA重组质粒可有效转染移植小肠。 叁、CTLA4Ig局部转基因对小肠移植急性排斥的治疗作用 目的：研究CTLA4Ig基因在移植小肠局部表达及其表达产物对急性排斥反应的治疗作用。 方法：建立SD→Wistar的大鼠异位小肠移植模型，并随机分为实验 南京医科大学博士学位论文组(CTLA4工g转基因组)和对照组(非转基因组)。实验组供肠移植前经肠系膜上动脉注入脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA重组质粒，术后应用免疫组织学检查移植小肠中CTLA4工g转基因产物的表达。移植术后3，7，10d分别获取各组的移植小肠进行组织学检查及细胞凋亡测定。结果:经CTL人4 19 cDNA处理的小肠在移植术后可见大量的CTL人419表达。对照组移植肠在术后7，10d分别出现I，11度急性排斥反应，同时凋亡细胞数量显着增加。实验组移植肠术后未见排斥反应的病理学证据，凋亡细胞偶见。结论:CTLA4 19基因可在移植小肠局部转染表达，其表达产物可防止移植术后急性排斥反应的发生。四、移植肠局部C TLA4Ig转基因对受体免疚排斥反应的影响目的:研究CTLA4Ig基因在小肠局部转染表达及其表达产物对受体免疚排斥反应的影响。方法:移植前经肠系膜上动脉给供肠灌注脂质体包裹的CTLA4 Igc洲A重组质粒，应用免疫组织学及逆转录多聚酶链反应检测移植小肠中CT以4 19转基因产物的表达，并观察受体对供肠及供者同系鼠皮肤移植的排斥反应。结果:移植术后至少28d内移植小肠中有CTLA 419转基因产物的表达，18例移植小肠中的11例在受体内的存活时间超过90d，但移植肠长期存活的受体排斥供者同系鼠皮肤移植，皮肤移植排斥同时激发受体对移植小肠的排斥‘结论:经肠系膜‘_L动脉依“!、灌注脂质体包裹的CT工，刊烤巾狱可有效南京医科大学博士学位论文转染移植小肠，并诱导受体对移植小肠的免疫耐受，但移植肠局部cTLA4 19基因转染不能诱导出供者特异的外周耐受状态。
孙培龙[5]2013年在《携带HLA-G慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究》文中指出目的：人类白细胞抗原G(HLA-G)因为在母体胎儿之间的免疫耐受中发挥了关键性作用而被注意,提示它可能应用于器官移植。HLA-G在体外诱导表达已被证实有诱导免疫耐受的特性,移植术后患者体内HLA-G的表达已被证实与移植术后急性和慢性排斥反应发生率降低有关。我们使用转染携带人HLA-G基因的慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及大鼠移植肝脏,在体外及在体条件下探讨HLA-G的表达是否有直接保护移植肝脏免受排斥反应损伤的效果。方法：1、取260只健康雄性SD大鼠,分叁个阶段进行,先建立大鼠原位肝移植模型的手术训练和探索。手术熟练后,取40只SD大鼠和40只Wistar大鼠,建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、建立携带HLA-G的慢病毒表达体系。3、进行SD大鼠肝细胞原代培养。4、将携带人HLA-G的慢病毒转染SD大鼠原代培养肝细胞,转染后7天,通过免疫荧光、RT-PCR和Western Blot实验进行检测,分别从病毒转染、mRNA水平和蛋白水平全面评价HLA-G慢病毒转染的效果。5、采用kamada二套管法建立SD和Wistar大鼠的原位肝移植模型45例,随机分为叁组,每组15例。实验组在SD大鼠的供体肝脏取下后,从门静脉输注2ml包含有107TU/ml携带HLA-G基因的慢病毒,将携带人HLA-G的慢病毒转染大鼠供肝,与不加任何处理的对照组和术后规律使用FK506的对照组进行对比,对比术后叁组肝组织中的HLA-G的表达水平、术后第7天、第14天和第56天的AST和BIL值以及病理切片、术后生存天数。探讨携带HLA-G基因的慢病毒转染供肝,是否可对抗大鼠急性肝移植排斥反应。结果：1、经训练,成功建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、携带人HLA-G的慢病毒可成功转染SD大鼠原代培养肝细胞。3、转染携带有HLA-G'慢病毒的实验组术后7天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显着性(P<0.05),与术后不加处理的对照组差别有极显着性(P<0.01)。转染携带有HLA-G慢病毒的实验组术后12天、56天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显着性(P<0.01)；转染携带有HLA-G的实验组的AST和BIL值,与术后不加处理的对照组差别有极显着性(P<0.01)。对照组中位生存时间12.00天,FK506组中位生存时间70.50天,HLA-G组中位生存时间91.50天,各组之间差别有显着性(P<0.01)。提示这种治疗可延长受体大鼠的存活期。病理切片结果显示,转染携带有HLA-G慢病毒的实验组和术后使用FK506的阳性对照组,术后7天病理切片仅有轻度排斥反应,而术后不加任何处理的阴性对照组则显示为重度排斥反应。术后56天,FK506组病理切片显示存在轻度排斥反应,而HLA-G组无排斥反应。结论：1、转染携带有HLA-G慢病毒作为治疗性的手段用于大鼠肝移植急性排斥反应模型,能有效保护大鼠移植肝的功能和延长存活期。2、体外实验及动物实验均表明,肝细胞对慢病毒介导的基因转移易感,表明慢病毒对肝细胞有很高的转导效率,且转入的外源基因可长期表达。图16幅,表9个,参考文献316篇
张传永[6]2004年在《Fas Ligand 基因修饰的骨髓树突状细胞在同种移植中的作用》文中指出[背景] 器官移植的成功往往依赖于毒性、非特异性免疫抑制剂的应用。而这类药物常常导致机会感染、恶性肿瘤等并发症的发生，根本的解决出路之一就是寻找诱导抗原特异性耐受或实现抗原特异性抑制的治疗方法和策略。器官移植物的基因治疗和基因修饰的耐受性树突状细胞(dendritic cell，DC)诱导免疫耐受的相关进展为临床器官移植提供了极具潜力的治疗方法。尝试应用免疫抑制性调节分子基因修饰移植器官进行局部免疫调控或基因修饰树突状细胞诱导免疫耐受已成为移植研究领域的热点。 树突状细胞(dendritic cells，DC)作为一类具有最强抗原提呈功能的细胞群体，在识别和递呈抗原启动免疫应答、诱导移植排斥中起重要的作用。近年来的研究表明，DC是一类异质性细胞群体，具有不同的亚群和不同的功能状态，不但在增强免疫反应上具有特别重要的作用，也具有诱导特异性免疫耐受的作用。DC提呈抗原方式的免疫性或耐受性决定了DC既可以启动免疫反应也可以诱导中枢性或外周性免疫耐受。目前已有研究表明通过免疫抑制分子的基因如vIL-10、TGF-β、和CTLA4-Ig等基因修饰可能会使得DC潜在的耐受原性得以放大和增强，因此，DC在诱导免疫耐受中具有相当重要的作用及潜在的应用价值。 Fas／FasL是介导细胞凋亡的重要的免疫活性分子，它不仅参与了胸腺选择、免疫豁免(immune-privilege)协调平衡免疫反应等许多重要的生理过程，而且与一些肿瘤的发生发展、器官移植耐受和排斥反应、自身免疫性疾病的产生以及感染、炎症等许多病理生理反应密切相关。研究发现FasL在睾丸、Sterotil细胞Fas Ligand基因修饰的骨做树突状细胞在同种移植中的作用第二军医大学博士论文和眼前房等免疫特赦器官上有较高表达，其免疫特赦的机制就是FasL与Fas结合通过Fas邝asL途径诱导Fas+的淋巴细胞凋亡从而免遭排斥。因此，如果提高移植物FasL的表达，则有可能会导致排斥反应的主要效应细胞T淋巴细胞的凋亡，从而达到抗移植排斥作用。Lau创造性将异源胰岛细胞和人工构建的由FasL基因转染的同源成肌细胞混合植于小鼠肾包囊中，其存活时间较单纯胰岛细胞移植明显延长，证实FasL基因治疗能给移植的胰岛细胞提供特异性免疫保护作用。Zhang等用表达FasL的H一Zb APC治疗H-ZK小鼠，成功地诱导同种异基因间的抗原特异性T细胞的低反应性。既往研究表明，靶组织表达FasL能诱导浸润的淋巴细胞凋亡，从而保护靶组织免受攻击。鉴于DC在移植免疫中的重要作用，我们可以推测，通过FasL基因修饰的DC进一步认识FaS/F asL在同种异体移植中的凋亡作用和机制，将有可能寻求一种移植物免疫耐受的途径，这种途径能通过凋亡机制特异性地清除移植物中同种异体抗原激活的淋巴细胞，使移植物免遭排斥。 本研究利用小鼠血管化的心脏异位移植模型和基因转移技术，通过FasL基因的腺病毒载体转染·DC，分析FasL基因修饰对DC及同种效应T淋巴细胞功能、活性的影响，观察其在小鼠心脏移植排斥反应中的效果，并对其发生的机制进行探讨第一部分AdFasL基因修饰对Dc、T淋巴细胞功能的影响 采用rmGM一CSF与去除淋巴细胞的骨髓细胞体外培养的方法，可获得纯度较高的骨髓来源的DC。观察DC发育过程中的形态变化，发现培养第叁天即可见细胞成簇生长，可见到少量细胞呈现出粗短的枝状突起，培养完成时细胞密集成团，枝状突起仍不多见。经IO0ng/ml LPS刺激18小时后，细胞表面伸出很多突起，宛如蟹足。第7天用光镜观察及流式细胞术(FACs)鉴定都肯定所培养的细胞具有成熟DC的性质一细胞表面较高表达MHCn类分子及共刺激分子(eD40、CDso、CDs6等)。 腺病毒是一种高效的基因转移载体，实验中，我们设定不同的Mol值对其进行转染。培养至第7天的DC更换无血清RPMll640培养基，按MOI二1:10，1:40，1:80，1:120分别加入腺病毒基因载体。在37℃、5%COZ孵箱中培养2小时Fas Ligand墓因修饰的骨做树突状细胞在同种移植中的作用第二军医大学博士论文后再加入小牛血清和GM一CSF并使之达到规定浓度。继续在37℃、5%C伍孵箱中培养18一20小时后收获细胞。为了解AdFasL对DC的转染效率以及转染后基因的表达情况，我们进行了FAcs分析发现，AdFasL按MOI二1:80，在转染20小时后具有较高的FasL表达。因此我们认为1:80已经达到或者至少接近了最适Mol值，在以后的实验中，均采用1:80为默认的重复转染率。 为明确AdFasL基因转染对DC成熟表型及抗原递呈功能的影响，我们对基因修饰的DC进行了队CS分析。发现FasL基因转染并未使细胞特征发生大的变化。转染后DC表面分子CD80(B7一l)CD86(B7·2)和CD40等表达没有明显的改变，同时用ELISA检测了IL一2水平，结果显示AdFasL基因的转染对DC的抗原递呈功能没有明显影响，这说明FasL基因转染DC这种应用方式是可行的。有报道认为DC转染FasL基因后可能会导致DC自身的凋亡，我们在实验中用FACS分析了转染后DC的凋亡情况，和对照相比并未发现明显DC自身的凋亡。 实验中，我们将C57BL/6小鼠FasL一DC与异基因BALB/C小鼠脾脏T淋巴细胞共培养48小时后，通过流式细?
佚名[7]2002年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2002年度资助自由申请科学基金项目一览表》文中指出项 目 名称1 微生物学学科(80项)木本豆科植物根瘤菌分类和系统发育研究放线菌种分类单元及种内菌株的分子分类指征的评价我国酸性土壤中链霉菌的选择分离与快速鉴定稀有放线菌的系统分类中国西部荒漠地衣及其固沙生物学研究中国灵芝属分子系统学研究隔指孢属(D0c
辛海明[8]2009年在《CCR7基因转染小鼠未成熟树突状细胞诱导皮肤移植免疫耐受的研究》文中提出研究背景及研究目的临床上同种异体皮肤移植是目前大面积深度烧伤患者早期创面覆盖最直接、最有效的治疗方法,但是由于皮肤的强烈抗原特性,导致移植后3周左右外源皮肤就会发生不可逆的排斥反应,极大地限制了自体微粒皮混合大张异体皮移植效果。如何成功诱导出皮肤移植后的免疫耐受,临床上至今未发现非常有效的措施。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前已知的功能最强大的专职抗原提呈细胞,在免疫反应中发挥了极其重要的作用。DCs的分化发育过程伴随着DCs由未成熟的前体细胞分化发育为成熟细胞,细胞的形态、表面标志以及生物学功能等都发生了相应变化。未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs)因为其功能上最显着的特点就是可以诱导T淋巴细胞的特异性低应答而成为当前研究免疫耐受策略的热点,这也在我们前一个国家自然科学基金项目(No.30271341)中得到证实。利用imDCs或者基因修饰DCs进行的联合移植实验已经在肾、肝、心脏、胰腺和小肠等器官中取得了令人较为满意的效果,这为皮肤移植实验提供了非常有利的依据。DCs的发育成熟过程伴随着其表型的变化,包括摄取能力的减弱和MHC类分子、共刺激分子的表达上调,最终变成强大的抗原提呈细胞。研究发现imDCs在炎性介质作用下逐渐迁移成熟的过程中,其表面趋化因子受体-7(Chemokine receptor-7,CCR7)表达上调。通过CCR7与其配体MIP3β(即CCL19)和SLC(即CCL21)的相互作用,引导DCs趋化迁移至淋巴结,由此CCR7被认为是成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs)迁移归巢完成抗原递呈从而激活初始T细胞的主要受体之一。目前CCR7趋化迁移的能力在部分恶性肿瘤的转移中得到证实,研究表明CCR7严格调控了肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞这种非随机的、有组织器官选择性的转移过程类似于免疫刺激过程中DCs的定向迁移。基于CCR7具有非常重要的趋化迁移功能,若DCs成熟度越高,CCR7表达更强,则免疫系统呈现更为强劲的免疫应答,反之则诱导免疫耐受。然而,由于imDCs缺乏CCR7的表达,向淋巴结的趋化迁移能力较弱,长时间处于非T细胞区易受各种炎症因子或者外来抗原的刺激而发育为mDCs,严重影响其诱导免疫耐受的效果。基于以上分析,本研究拟通过构建含有小鼠CCR7的重组腺病毒,尝试在imDCs上建立CCR7的表达,使imDCs获得原本mDCs才具有的高效迁移能力,避免imDCs在外周组织向成熟状态的分化,有效地确保其诱导免疫耐受功能的发挥,为临床上大面积深度烧伤患者早期创面覆盖引起的免疫排斥提供新的解决方法和思路。研究方法1、小鼠骨髓源树突状细胞的培养及鉴定小剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合体外诱导培养BALB/c小鼠骨髓来源的imDCs,第5天收获得到一定数量的imDCs,加入rmTNF-α刺激细胞成熟而获得mDCs。通过光学显微镜及扫描电镜观察细胞的形态学变化,应用流式细胞仪检测细胞表面标志分子的表达水平。2、CCR7基因转染小鼠骨髓源未成熟树突状细胞及其功能鉴定采用梯度离心法将Ad空载体和Ad-ccr7腺病毒转染入imDCs,通过光学显微镜和扫描电镜来观察细胞形态学上的变化,应用流式细胞仪检测细胞表面的相应标志物,从而来观察Ad-ccr7腺病毒转染对小鼠骨髓源imDCs的成熟状态及形态的影响。采用Real-time PCR法、细胞免疫荧光法、Western Blot法检测Ad-ccr7腺病毒转染前后小鼠骨髓源树突状细胞CCR7mRNA及蛋白水平的表达变化。通过体外趋化试验和混合淋巴细胞反应比较观察Ad-ccr7腺病毒转染前后小鼠骨髓源DCs的体外迁移能力和体外刺激T淋巴细胞增殖能力。3、CCR7基因转染imDCs对小鼠异基因皮肤移植的影响在小鼠异基因皮肤移植实验中,我们将供者源imDCs、供者源mDCs、供者源imDCs+Ad、供者源imDCs+Ad-ccr7和供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10通过腹腔注射入受体小鼠体内,观察各组细胞对小鼠异基因移植皮片存活状况的影响,并通过组织学检查观察移植皮片的结构改变。实验结果1、小鼠骨髓源DCs的培养及鉴定结果体外培养的DCs经光学显微镜及扫描电镜观察发现:imDCs表面光滑,凹凸不平,毛刺状突起较少,而mDCs表面伸出许多较长的树枝样突起,突起长短不一,形态各异。流式细胞仪检测发现在imDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为24.7%、9.4%、20.5%和20.5%,而在mDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为86.5%、88.4%、76.9%和92.4%。这表明体外培养的DCs符合其典型形态学特征和表面标志水平。2、CCR7基因转染对小鼠骨髓源imDCs的影响2.1采用高速离心法将Ad-ccr7腺病毒转染入小鼠骨髓源imDCs内,其感染效率在MOI达到100时约有70%左右。在扫描电镜中可见imDCs转染腺病毒空载体和Ad-ccr7后,细胞形态不规则,表面粗糙,细胞表面的不规则膜性树枝状突起较未转染imDCs增多,而IL-10组细胞膜表面不规则突起明显减少,这说明IL-10可一定程度地抑制imDCs的成熟。小鼠骨髓源imDCs经腺病毒转染2天后,流式细胞术检测发现imDCs+Ad组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为40.0%、27.7%、28.5%和37.8%。imDCs+Ad-ccr7组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为37.8%、27.4%、21.3%和37.0%,而imDCs+Ad-ccr7+IL-10组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为20.5%、15.5%、21.6%和32.9%。这表明转染Ad空载体和Ad-ccr7腺病毒可促使imDCs表面标志略微升高,即向成熟方向发展,但加入细胞因子IL-10可略微下调这些表面标志的表达,在一定程度上抑制imDCs的成熟。2.2 Real-time PCR结果显示, imDCs中CCR7mRNA水平较低, mDCs中CCR7mRNA含量是imDCs的1.544倍。imDCs转染Ad空载体后,其CCR7mRNA含量是imDCs的1.115倍,imDCs转染Ad-ccr7腺病毒后,其CCR7mRNA含量是imDCs的2.941倍,而IL-10组中CCR7mRNA含量为imDCs的1.556倍,接近正常mDCs含量。这也说明Ad-ccr7腺病毒转染可以明显增加未成熟树突状细胞CCR7mRNA水平的表达,同时IL-10在一定程度上可以抑制转染过程中imDCs的成熟。2.3细胞免疫荧光结果显示imDCs和imDCs+Ad组细胞不表达CCR7,而mDCs细胞可表达CCR7。imDCs转染Ad-ccr7腺病毒后CCR7的表达增加,说明CCR7基因有效转入imDCs并表达蛋白。Western Blot结果通过Qulitity One软件分析显示:imDCs、imDCs+Ad、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10和mDCs中CCR7蛋白表达的相对含量分别为0.09、0.15、0.96、0.46和0.35。结果表明,imDCs和imDCs+Ad组中CCR7在蛋白水平几乎不表达,而转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明显上升,其蛋白相对含量可以高于正常mDCs的含量。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向转化,但是其CCR7蛋白的表达含量仍可以达到mDCs的水平。2.4体外迁移实验结果表明imDCs细胞的体外趋化迁移率均低于5%,而mDCs、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10组细胞在CCL19作用下体外趋化迁移率均较imDCs组明显上升(aP<0.05)。而CCL19+anti-CCR7mAb组,在CCL19对抗剂anti-CCR7mAb作用下迁移率均有下降(dP <0.05),但仍高于各自的空白组。这表明能够表达CCR7蛋白的转染病毒后imDCs及mDCs可在其配体CCL19的作用下增强体外迁移能力,同时anti-CCR7mAb可以在体外部分的拮抗其配体CCL19的作用。2.5混合淋巴细胞反应结果表明,imDCs以1:5比率与同种异体未致敏T淋巴细胞混合后imDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力较弱,刺激指数为1.6±0.1,而mDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力明显增强,刺激指数为5.6±0.3(aP<0.05)。腺病毒转染后细胞刺激T细胞增殖的能力较imDCs组增强但是弱于mDCs组,刺激指数分别为3.4±0.2和3.1±0.2,但是加入IL10可以明显降低刺激能力,刺激指数为1.8±0.1(bP<0.05)。表明腺病毒转染可部分增强imDCs的刺激增殖能力,但还是弱于mDCs,IL-10可抑制其促增殖能力。3、CCR7基因转染imDCs对小鼠异基因移植皮片的影响3.1通过与对照组(NS)相比较,供者源imDCs、供者源imDCs+Ad-ccr7、供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10组皮肤移植物的MST均明显延长(aP<0.05),而供者源mDCs和imDCs+Ad组MST与对照组相比无显着性差异(P>0.05),说明单纯使用供者源mDCs对移植皮片的存活无明显影响,但供者源未成熟DC的应用可延长皮片的存活时间。同时,供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10组MST较供者源imDCs组显着延长(bP<0.05),而供者源imDCs+Ad-ccr7组MST较供者源imDCs组差异不明显(P>0.05),显示供者源imDCs在转染腺病毒Ad-ccr7后,其诱导免疫耐受的能力较转染前提高,加入IL-10更能够显着提高皮片存活的时间。3.2组织切片活检显示皮肤组织结构较清楚,纤维组织结构排列有序,成纤维细胞多,真皮层内血管腔丰富,结构完整,大小不一,局部有炎性细胞浸润。表明皮片生长情况良好,白细胞的趋化功能正常。结论1、小鼠骨髓来源细胞在应用低剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合刺激诱导后获得具有典型形态特征的imDCs和mDCs。2、Ad-ccr7腺病毒成功转染入小鼠骨髓源imDCs内。转染后小鼠imDCs在形态学及细胞表面标志分子上可向成熟状态分化,但IL-10可一定程度地抑制imDCs的成熟。3、Real-time PCR结果表明Ad-ccr7腺病毒转染可以明显增加未成熟树突状细胞CCR7mRNA水平的表达,同时IL-10在一定程度上可以抑制转染过程中imDCs的成熟。4、细胞免疫荧光及Western Blot结果表明,转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明显上升。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向分化,但其CCR7蛋白的表达含量仍可以达到mDCs的水平。5、体外迁移实验表明imDCs细胞的体外趋化迁移率均较低,而转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs在CCL19作用下体外趋化迁移率均较imDCs组明显上升。同时anti-CCR7mAb可以在体外部分的拮抗其配体CCL19的作用。6、混合淋巴细胞反应实验显示imDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力较弱,而mDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力明显增强。Ad-ccr7腺病毒转染后其刺激T细胞增殖的能力较imDCs组增强但是弱于mDCs组,加入IL10可以明显降低刺激能力。7、小鼠异基因皮肤移植实验表明,单纯使用供者源mDCs对移植皮片的存活无明显影响,供者源imDCs在转染Ad-ccr7腺病毒后可明显延长皮片的存活时间,加入IL-10更能够显着提高皮片存活的时间。
金海龙[9]2012年在《重组免疫毒素CTLA4-ScFv-Mel的构建、制备及活性研究》文中提出器官移植是治疗终末期器官功能衰竭的有效手段,免疫抑制剂的应用可以减轻移植排斥反应,但化学类免疫抑制剂毒副作用明显,影响了其临床应用。生物制剂类免疫抑制剂尤其是免疫毒素可以通过其特异性的结合作用,清除抗原特异性T细胞,且毒副作用较小,有更好的应用前景。免疫毒素是具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子,在治疗恶性肿瘤、移植排斥等方面有良好的应用前景。CTLA-4是一种仅表达于活化T细胞而静止T细胞不表达的分子,因此CTLA-4的抗原结合分子是一种理想的免疫毒素导向分子,由之产生的免疫毒素只对活化的T细胞或肿瘤细胞有杀伤作用,避免了对正常静息T细胞的非特异性损伤。蜂毒肽(Melittin, Mel)是蜜蜂蜂毒的主要成分,是一种重要的抗菌肽,具有抗菌、抗辐射、抗肿瘤等作用。它由26个氨基酸组成,分子量小,免疫原性低,不易产生过敏反应；具有膜活性,直接对细胞的磷脂膜起溶解作用,抑制细胞发育,是一种较理想毒素片段。本研究以人源化抗CTLA-4单链抗体为靶向片段,特异性结合在表达CTLA-4的活化T细胞表面,以蜂毒肽类似物为毒素片段,特异性杀伤活化T细胞,设计构建出了高效低毒的免疫毒素分子,主要用于抗移植排斥反应。利用重迭延伸PCR技术,通过两步PCR获得了重组免疫毒素全长基因,将其与表达载体pBV220连接,转化大肠杆菌,重组基因在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式表达。包涵体用8M脲变性,采用稀释复性,然后用SP-Sepharose-Fast-Flow阳离子交换柱分离纯化,Sephacryl S-200凝胶排阻层析柱精制,制备得到目的蛋白CTLA4-ScFv-Mel.在体外活性研究中,2μmo1/L的CTLA4-ScFv-Mel分别作用于非活化的T淋巴细胞、阴性对照细胞ECV-304、ConA激活的T淋巴细胞、CTLA-4阳性细胞Raji知Jurkat细胞。结果显示,给药24h后各组细胞存活率下降,其中前两组细胞的存活率分别为78.9%和77.3%；而后叁组分别为31.2%、32.7%和30.8%。说明CTLA4-ScFv-Mel对CTLA-4阳性细胞的杀伤率高于正常细胞,表现出细胞杀伤的选择性和高效率。体内活性研究以BEL-7402肝癌移植瘤模型和S180小鼠移植瘤模型为对象,分低、中、高叁个剂量给药,比较试验组和阴性对照组移植瘤相对体积等药效学指标。结果显示,CTLA4-ScFv-Mel能够发挥促进两个试验组模型中移植瘤的存活和生长的作用,且呈现一定的剂量效应关系。推测该现象的出现与抑制T细胞免疫有关。本研究成功制备了一种全新的免疫毒素融合蛋白,并进行了初步活性研究和药效学评价,为器官移植提供了潜在的选择药物,具有一定的科学价值和开发前景。
参考文献：
[1]. CTLA4-Ig的表达、修饰和肿瘤免疫治疗策略性研究[D]. 于继云. 中国人民解放军军事医学科学院. 2002
[2]. IDO1和IDO2在胆囊癌细胞免疫耐受形成中的作用机制研究[D]. 高剑. 广州医学院. 2012
[3]. 表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究[D]. 胡贵方. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[4]. CTLA4Ig局部转基因治疗大鼠小肠移植急性排斥实验研究[D]. 王一芳. 南京医科大学. 2004
[5]. 携带HLA-G慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究[D]. 孙培龙. 中南大学. 2013
[6]. Fas Ligand 基因修饰的骨髓树突状细胞在同种移植中的作用[D]. 张传永. 第二军医大学. 2004
[7]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2002年度资助自由申请科学基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2002
[8]. CCR7基因转染小鼠未成熟树突状细胞诱导皮肤移植免疫耐受的研究[D]. 辛海明. 第叁军医大学. 2009
[9]. 重组免疫毒素CTLA4-ScFv-Mel的构建、制备及活性研究[D]. 金海龙. 中国人民解放军军医进修学院. 2012
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