杨洪元[1]2003年在《一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒的构建》文中指出将板栗疫病菌整合性质粒pCPXHY2上的由Trpc启动子控制的潮霉素基因片段克隆到农杆菌转化载体质粒pCambia1301—35SN外源基因克隆位点上，构建成一个新的质粒pGXH1130。用pGXH1130转化板栗疫病菌EP713原生质体，其转化效率是pCPXHY2的6倍以上，达到60～70个转化子／μg。挑取的5868个转化子没有一个发生表型突变，其生长速度、菌体颜色、菌落形态均与EP713相似。通过对转化子总DNA进行Southern杂交分析，pGXH1130转化板栗疫病菌后并未插入染色体基因组中，而是游离于板栗疫病菌染色体外，以一个自主复制的质粒形式存在。将转化子总DNA转化E．coli，回收到与pGXH1130大小一致的质粒。经RFLP(EcoRI、XbaI、SalI)分析，pGXH1130转入EP713后未经任何修饰或剪切。对转化子潮霉素抗性表型稳定性检测表明，在没有潮霉素选择压力下，经过6次转接,90％的菌体中pGXH1130会丢失。能自主复制的pGXH1130穿梭质粒的成功构建，为板栗疫病菌的遗传操作提供了一个强大的新的工具。
蓝瑛[2]2006年在《板栗疫病菌RNA干扰系统的建立》文中认为对本实验室前期构建的一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒pFC9进行优化，通过改造多克隆位点和增加内含子序列，得到一个由板栗疫病菌gpd启动子与终止子控制的、多克隆位点之间带有内含子序列的RNA干扰表达载体pFCNH-intron。用该载体构建板栗疫病菌漆酶基因(lac-1)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的RNA干扰质粒，并进行RNA干扰效率测定。荧光定量PCR分析表明，50％的lac-1 RNA干扰株中目的基因表达量明显降低，最高的干扰程度达到了80％；60％的GFP RNA干扰株目的基因表达量明显降低，最高干扰程度达到60％。板栗疫病菌RNA干扰系统的建立为板栗疫病菌基因功能研究奠定了基础。
冯友军[3]2004年在《一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭表达载体》文中进行了进一步梳理本实验室2003年首次构建了可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒pGXH1130。本研究通过双酶切pGXH1130，用酶切产物自连后获得的变小的质粒转化板栗疫病菌EP713原生质体，并进行Southern杂交进一步鉴定变小的质粒是否依然具有穿梭以及自主复制的功能，逐步去除了pGXH1130上与自主复制以及穿梭无关的多余片段。将最终获得的不能继续缩小的质粒上的Trpc启动子和终止子置换为板栗疫病菌gpd启动子与终止子，并在gpd启动子与终止子之间添加了多克隆位点，将大小约为15.6kbp的pGXH1130优化为约8.9kbp大小的能在板栗疫病菌中自主复制的穿梭表达载体pFC9。pFC9以潮霉素抗性作为进行板栗疫病菌遗传转化的选择标记。Southern杂交分析表明pFC9可在板栗疫病菌细胞内自主复制。携带漆酶基因LAC-1 cDNA和基因组DNA的pFC9重组质粒都可以在板栗疫病菌低毒菌株EP713中高效表达出漆酶活性，表明pFC9可以在真菌宿主板栗疫病菌中高效表达目的基因。携带有pFC9的转化株EP713／pFC9-Lac1可以通过菌丝融合方式将潮霉素抗性传播给对潮霉素敏感的板栗疫病菌菌株EP155，表明该载体具有类似低毒病毒CHV1-EP713的在板栗疫病菌细胞质内运动的能力。穿梭表达载体pFC9的成功构建为板栗疫病菌的基因功能研究提供了一个崭新的工具。
参考文献：
[1]. 一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒的构建[D]. 杨洪元. 广西大学. 2003
[2]. 板栗疫病菌RNA干扰系统的建立[D]. 蓝瑛. 广西大学. 2006
[3]. 一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭表达载体[D]. 冯友军. 广西大学. 2004