佛山市禅城区粮油检测中心 广东 佛山 528000
【摘要】：真菌是引发农作物病害的危险性病源，其造成的危害一般都是大范围性的，尤其是稻瘟病病原菌和水稻纹枯病病原菌引起的病害，对靠种植水稻为生的国家更具有毁灭性，但目前能够有效防治真菌病害的生物农药却极为稀少。本文旨在通过研究一种产抗真菌素的菌种，探讨将其开发成生物农药用来防治农作物病原真菌的可能性。
关键词：PSO4菌株 抗真菌素 生物活性
【作者简介】袁峰，1986年2月，男，汉族，广东梅州，佛山市禅城区粮油检测中心，食品工程师，学士，食品工程、食品安全
在所有的植物病害当中，植物病原菌排名比较靠前，也是病毒病害、细菌病害以及真菌病害的首位。比如，在200多种水稻病害当中，有超过90%的病害为真菌病害[1]。我国有上下五千年的文明历史，在历史长河中，对于植物真菌病害的防治也有很多的实践经验，目前主要是使用化学农药，虽然有比较好的效果，但依然存在以下几点问题。第一点，不断积累的有毒物质，对环境造成的污染，使人类的健康受到很大的威胁；第二点，病原真菌的抗药性持续上升；第三点，对于一些有益生物，有非常强的破坏作用，使植物体内的平衡被打破，导致病原真菌大爆发。随着人们环保意识的提高，对于化学农药的毒副作用也越来越受到人们的关注，目前正在大力提倡“无公害食品”、“绿色食品”。这就需要应用较高的技术，使用无公害的农药，这也是目前植物学家迫切需要解决的问题。
1 抗真菌素
1.1 抗真菌素的研究历史
对植物病害进行防治的措施，通过微生物的代谢产物这一方法，最早是在日本、美国等发达国家开始应用，比如灰黄霉素、土霉素、链霉素等，这对防治植物病害有非常好的效果[2]。Dekker等人提出了一些农用抗生素，比如抗生素A、放线菌酮等，属于多烯类型。在上世纪50年代后期的时候，由日本研发出了杀稻瘟菌素-S，之后逐渐应用防治稻瘟病，将有机汞制剂基本取代。随着杀稻瘟菌素-S的深入应用，农用抗生素也进入了高速的发展阶段，又相继出现了多康霉素、春雷霉素等抗真菌农药品种，优势具有高效、低毒。
因为新中国成立的时间比较短，对于先进的新技术比较缺乏，尤其是对于农用抗生素方面的研究非常少。在上世纪60年代，我国才成功研发了灭瘟素、放线酮等；到70年代的时候，成功研发了多抗霉素、井冈霉素、庆丰霉素等。经过十年的发展，到80年代的时候成功研制了多效霉素、公主岭霉素等抗真菌农用抗生素。这些年我国对于农用抗生素的研究一直在努力，也取得了非常显著的成果，更多的农用抗生素应用到了实践当中[3]。
1.2 农用抗生素作用机制
随着科学技术的进步，农用抗生素的应用范围也越来越广泛，相关领域的学者专家开展对医用抗生素进行了深入的研究，这也在一定程度上促进了农用抗生素作用机制的发展。目前，国内的学者对于农用抗生素方面的主要，主要是针对病原菌的作用，涵盖了分子、生理生化以及形态等方面。下面简单阐述一下农用抗生素的作用机制：第一点，作用于真菌细胞壁。细胞壁的作用主要是降低周边环境对保护真菌的影响，比如渗透压以及机械损伤不会对其造成很大的影响。抗生素可以使真菌细胞壁合成有效抑制，一番细胞膜暴露，主要是因为使细胞壁变逐渐失去完整性，最后就会引发原生质渗漏[4]。这一类型的抗生素，出现的扩大了菌丝尖端和菌丝芽管；第二点，可以作用于菌体细胞膜。细胞膜属于一种半透性膜，部分抗生素作用在细胞膜上，使其屏蔽功能失效；第三点，作用在蛋白质合成体系。细胞生长最为基本的活动就是合成蛋白质，但是合成的过程中受到一定的抑制，这就会对微生物的生长产生一定的影响；第四点，作用在能量代谢系统。有些抗真菌素是通过抑制菌体内酶活性，从而对菌丝体的生长和发育造成抑制效果，从而实现抑菌的目的。第五点，抑制核酸合成。核酸是绝大多数生物体的遗传物质，在生物体的生长发育中起着极其重要的作用，一旦核酸不能顺利合成，那么生物体就必然受到毁灭性的打击。灰黄霉素等一些抗真菌素就是通过抑制或者改变微生物核酸的正常合成来起到抑菌作用的。最后一点，通过提高植物的抗病力而防治病害。
1.1.3 我国抗真菌素的未来的研究开发趋势
我国是在上世纪50年代开始研制农用抗生素，经过这些年的发展已经形成了一批具有特色的科研机构。但是，受到地税品重复问题的影响，在目前的抗真菌农用抗生素的研究项目中，实际可以应用的只有十多种。现阶段，在我国的农药市场当中，只有9%的农用抗生素份额[5]。从这一数据就可以看出，后续我国还需要重点研究抗真菌的农用抗生素，让研究成果转化为实践，筛选出更多的农用抗生素品种，为我国的农业发展奠定坚实的基础。
抗菌素对于植物并还需要很高的纯度，为了对抗菌素的活性情况进行观察，需要在植株上直接喷洒萍培养滤液。但是，有的时候使用抗菌素培养液或是抗菌素，实际的应用效果不尽人意，很多抗菌素受到外界影响因素比较严重，如果是在野外有很多的不确定性。就算是采用粗品，抗菌素的实际价格也相对高很多，因此应用范围受到很大的制约。为了在农业中更广泛地利用抗菌素，我国目前在农用抗生素产品的产业化研究方面，内容主要涵盖了以下几点。首先，深入研究关键工程化技术，尽可能减少生产成本，使生产工艺得到优化。其次，还需要对防治对象深入进行研究，扩展应用范围，针对市场进行调研，了解市场的实际需要，研制满足市场需要的品种
1.3 研究目的与内容
1.3.1 研究目的
本课题旨在通过对PS04菌株所产生的生物活性物质的抑菌效果的研究，探讨其在农业上的应用领域。
1.3.2 研究内容
本课题主要从以下几个方面进行了研究：PS04菌株形态的初步鉴定；PS04菌株所产生物活性物质的提取；PS04菌株抑真菌活性的研究等。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌种及其来源
供试病原菌：白菜黑斑病、稻瘟病、荔枝霜疫病、西瓜枯萎病、小麦根腐病、黄瓜疫病、棉花枯萎病、葱紫斑病、玉米大斑病等等（上述的菌种，均由华南农业大学国家教育部重点实验室昆虫毒理实验室提供）。
2.1.2 培养基
马铃薯培养基：20％马铃薯浸汁1000mL，蔗糖 20g，固体培养基中添加2％琼脂。
2.1.3 菌体培养
（1）细菌的斜面培养：用马铃薯固体培养基（PDA）做斜面，将细菌划线接入，放在培养箱（30°C）中培养，细菌长满斜面后，转移到4°C冰箱中保存。
（2）种子培养：用接种环取一环细菌接入装有马铃薯液体培养基的三角瓶中，放在摇床上37°C，126rmin的条件下振荡培养，备用。
（3）摇瓶发酵培养：将种子培养基按5％-10％的接种量接入摇瓶发酵，放在摇床上37°C，126rmin的条件下振荡培养约4d-6d。
2.2 试验方法
2.2.1 PS04菌株形态及培养特征的观察
使用PDA培养基，在30°C条件下培养3d-5d后，观察并记录结果[11]。
2.2.2 生物活性物质的提取
按照2.1.3的培养方法培养后，用95％的乙醇按倍比稀释法（1体积中加入3体积的乙醇）稀释，4°C冰箱中静置沉淀，然后低温，5000r／min的条件下离心20min，取上清液浓缩除去乙醇（如多糖含量较高，可多次重复此步骤），得抗菌活性物质。
2.2.3 PS04抑菌活性测定的方法（菌落生长直径测定法）
定量量取上清液添加到固体培养基中，制成测定用平板培养基，之后在通过点种测定的方式开展病原菌菌饼。经过3-5天的保温培养，一般放置在28℃±1℃的培养箱中。对菌落直径进行详细的记录测量，从而对其抑制率进行计算。
2.2.4 PS04菌株抑真菌活性的研究
2.2.4.1 PS04产活性物质抗菌谱的测定
药品的稀释：吸1mL的原药，加无菌水稀释至10mL，100℃灭菌30min，然后取1mL加入到50mL的PDA培养基中，摇匀，倒平板。分别点种供试病原菌菌饼，按2.2.3法测定。
2.2.4.2 抑菌活性的研究
（1）抑菌活性初步试验：
将乙醇提取的粗提物配制成合适的浓度水溶液，取一定量的水溶液分别加入到50mL无菌培养基中，使终浓度分别为250ppm、500ppm、1000ppm、2000ppm、4000ppm，按2.2.3 的方法测定抑菌活性。
（2）毒力曲线的制作
按照初步的试验，需要选择30%-80%之间的抑菌率，设置的浓度梯度是100ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm。通过统计学方法，对抑菌活性进行严格的测定，之后就需要制作毒力曲线[6，7]。
2.2.4.3 抑菌素稳定性的研究
（1）热稳定性
将PS04粗提物适当稀释后，要分别设置相对应的温度，经过30分钟的温度处理，测定菌选择水稻纹枯病及稻瘟病病原真菌，按2.2.3方法测定抑菌活性。
（2）酸碱稳定性
将PS04粗提物通过无菌磷酸缓冲液进行稀释，pH值是5.8、6.2 、6.6 、7.0、7.4，再经过24小时的室温放置之后，通过水稻纹枯病病原真菌作为测定用菌种，在结合2.2.3的方法对抑菌活性进行测定。
2.2.4.4 PS04培养时间与抑菌活性的关系
在PS04菌株的培养过程中，跟踪检测培养液的抑真菌活性和菌体密度，记录测定结果。
2.2.4.5 取样量与抑菌活性的关系
取已经培养5d的含菌培养液40mL-50mL，装入100mL的三角瓶中，放入100°C的水浴锅中灭菌30min，然后依次取出2mL，4mL，6mL，8mL，10mL分别倒入装有50mL培养基的三角瓶中混匀，倒平板（小培养皿，除加10mL的倒5个平板外，其余均倒4个平板，包括CK）培养一段时间后调查，记录结果。
2.2.5 细菌生长与抑菌素产生量的关系
用查氏培养基配方培养细菌。
在每个装有200mL查氏培养基的1000mL的三角瓶中接入10mL的查氏种子培养基，然后放在转速为126r/min，温度为37ºC的摇床上进行振荡培养，培养一段时间后取样，测其菌体密度（OD600），记录试验结果。
抑菌性的观察：将前几天每隔一定时间取出的样品2mL经100°C灭菌后，与熔化的50mL培养基混匀，倒平板，然后用稻瘟病病原真菌接种，测量菌落直径，计算抑菌率。
3 结果与分析
3.1 PS04菌株的培养特征
从图1和图2中可以看出，PS04菌株是典型的革兰氏阳性杆状菌，其直径小于2.5μm，单菌落呈圆形凸起，周边光滑。
3.2 PS04抑真菌活性物质研究
3.2.1 PS04产活性物质抑菌谱
用于活性测定的抑菌素的浓度为500ppm。
从表中可以看出，PS04菌株抗菌物质具有一定的抑菌活性，包括所有的病原真菌，并且，对于稻瘟病、小麦根腐病等，有超过80%的抑菌活性。为了方便检测，后续试验中，均以水稻纹枯病病原菌作为检测用真菌。
3.2.2 PS04产活性物质粗提物抑菌效力
3.2.2.1 抑菌活性初步测定
从图4可以看出，当活性物质的浓度在100ppm-500ppm时，它的抑菌率在30％-80％之间。
3.2.2.2 毒力曲线的制作
PS04菌株能够形成很多的多糖，本次研究通过分离的方式，采用抗菌活性测定了去多糖上清液和多糖。最终得出的结果多糖没有抗菌活性。去多糖上清液活性测定结果如图5。
在上面的表达式中，Y代表的是抑制率几率值，X代表的是浓度对数。
按照毒力方程计算，最终得出的浓度是99.3mg/L。
3.2.3 抑菌素温度稳定性
将粗提物分别置于40℃、60℃、80℃、100℃和120℃条件下处理30min，然后测定其对水稻纹枯病和稻瘟病病原真菌的抑制作用，结果统计如表4。
从表4中可以看出，抑菌素粗提物在100℃以下的温度环境下稳定。超过100℃后，抑菌素的活性将有所降低。
3.2.4 pH值对抑真菌素稳定性影响
pH值对抑真菌素稳定性的影响测定结果统计如图6。
从图6中可以看出，在pH6.2-7.0范围内，抑菌素的抑菌活性基本一致，在pH5.8、pH7.4时抑菌率开始下降，因此该抑菌活性物质在pH6.2-7.0范围内稳定。
3.2.5 PS04菌株培养时间与抑菌活性的关系
在PS04菌株的培养过程中，跟踪检测培养液的抑真菌活性和菌体密度，测定结果统计分别如图7，图8所示。
从图中可以看出，培养后20h左右培养液中开始出现抗菌素，至30h抑菌活性进入快速积累阶段，38h以后活性积累变慢，逐渐进入稳定期，至56h达到最大。抑菌素变化曲线与生长曲线基本一致，因此PS04菌株的抑菌活性物质的产生为生长偶联型。
3.2.6 取样量与抑菌活性的关系
从图9可以看出，随着取样量的增加，抑菌活性也逐渐增加，但是变化不太明显，随着培养时间的增长，活性有所降低。
4 讨论与展望
4.1 讨论
通过跟踪检测发酵培养液中的抑菌活性和菌体密度，发现PS04菌株产抗真菌活性物质的过程为生长偶联型。从测定的活性物质的抑菌谱来看，其具有广谱性，但是，由于抗生素在体外对病原菌的作用方式和效果，与其在植物体内对植物病原菌的作用方式和效果有很大的差别，因此，要客观评价PS04菌株对植物病害的防治效果，还必须从PS04菌株在植物体内对病原菌的作用及其对植物本身的作用等方面进行更深一步的研究。
4.2 展望
PS04菌株所产的抑真菌素不仅具有较广的抗菌谱，尤其是对引起水稻、小麦减产的水稻纹枯病、稻瘟病、小麦根腐病等常见病原菌具有高达80%以上的抑菌效果，而且其对温度、pH等易变因素具有较高的稳定性。目前我国发现并使用的新农用抗生素的品种较少，而且多数农用抗生素产生菌的原始菌株产量很低、质量较差，不能满足工业生产的需要，因此，必须对这些产生菌的某些性状进行改良。研究的主攻方向在于如何提高生产菌株的发酵水平，降低生产成本。本研究为下一步的大量生产奠定了基础，但是活性物质的分离与纯化，菌种的鉴定等有待于进一步的研究。
参 考 文 献
［1］李巧丽，袁月星．抗植物真菌病害基因及其应用．生物学教学．2000，25（12）： 2-4
［2］白新盛，朱昌雄，张木．生物农药的发展现状及前景展望．上海环境科学．2002，21（11）：654-661
［3］孙延忠，李国庆，曾洪梅．抗生素对微生物作用的研究．微生物学杂志．2003，23（3）：44-47
［4］朱昌雄，姬军红，蒋细良等．中生菌素对水稻白叶枯病的防治机制．中国生物防治．2003，19（2）：69-72
［5］Montgomery R．Development of biobased products．Bioresource Technology．2004，91（11）：1-29
［6］陈云，周忆昭，蒋峥等．毒力回归方程b值的毒理学意义及剂量死亡曲线坡度度量的探讨．医学动物防治．2002，18（3）：165-167
［7］曾善玉．用回归分析方法评价线虫毒力．北京农业大学学报．1995，21（4）：432-434
论文作者:袁峰
论文发表刊物:《科学与技术》2019年第03期
论文发表时间:2019/6/21
标签：活性论文; 菌株论文; 抑菌论文; 抗生素论文; 真菌论文; 培养基论文; 病害论文; 《科学与技术》2019年第03期论文;