张璐 杨红霞
(浙江省湖州市食品药品检验研究院 浙江 湖州 313000)
【摘要】 目的：建立西洋参免煎中药颗粒的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法的要求对西洋参免煎中药颗粒微生物限度检查进行了方法研究，采用常规法和培养基稀释法对西洋参免煎中药颗粒的微生物限度检查方法验证，采用直接接种法进行控制菌方法验证。结果：西洋参免煎中药颗粒采用培养基稀释法（0.2ml/皿）测定细菌数、霉菌及酵母菌数，5种试验菌株回收率均高于70%；控制菌检查方法验证，可采用直接接种法进行大肠埃希菌和大肠菌群检查。结论：建立了西洋参免煎中药颗粒的微生物限度检查方法以及控制菌检查方法。
【关键词】 西洋参免煎中药饮片；微生物限度检查；方法验证
【中图分类号】R286 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2015）27-0330-02
西洋参免煎中药颗粒由于使用方便已被广大医院应用，但在对西洋参免煎颗粒进行微生物限度检查中发现1：10的供试液随着放置时间延长，供试液会发生粘稠膨胀影响菌落生长和菌落的计数。为了消除供试品对微生物限度检查结果的影响，对西洋参免煎中药颗粒进行适宜的微生物限度检查法研究。本文依据《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法采用不同方法对西洋参免煎中药颗粒进行微生物限度及控制菌方法学研究。为该类药品制定微生物限度检查标准提供科学依据。
1.仪器与材料
1.1仪器
隔水式电热恒温培养箱（型号：GSP－9160，上海精宏实验设备有限公司）；霉菌培养箱（型号：MJP-250，上海精宏实验设备有限公司）；生化培养箱（型号：LHR-150，广东医疗器械厂）；生物安全柜（型号：SW-II-A/B3，上海上净净化设备有限公司）。
1.2 试药
供试品：西洋参免煎中药颗粒，规格：每袋装1ｇ。
培养基：营养琼脂培养基(批号:140805)，玫瑰红钠培养基(批号:1404102)，胆盐乳糖培养基（ＢＬ）(批号:140312)，乳糖胆盐发酵培养基(批号:1402272)，ＭＵＧ培养基(批号:150105)，曙红亚甲蓝琼脂培养基（ＥＭＢ）(批号:130516)。
稀释液：ｐＨ7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(批号:130311)。
上述除供试品外均由北京三药科技开发公司生产，适应性检查均符合2010年版《中国药典》一部附录要求，可用于微生物限度检查。
1.3 菌株
大肠埃希菌Escherichia coli〔CMCC(B)44 102〕；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus〔CMCC(B)26 003〕；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis〔CMCC(B)63 501〕；白色念珠菌Candida albicans〔CMCC(F)98 001〕；黑曲霉Aspergillus niger〔CMCC(F)98 003〕。
上述标准菌株均购自浙江省食品药品检验所，验证实验所用的菌株均为第3代。
2.方法与结果
2.1 菌液制备
按照2010年版《中国药典》一部附录要求，采用10倍稀释法将大肠埃希菌［CMCC(B)44 102］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63 501］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98 003］分别稀释至50～100cfu/ml。
2.2 供试液制备
取10ｇ供试品，将其加入100mlｐＨ7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，充分振荡制成1:10供试液。
2.3 微生物限度方法验证
2.3.1常规法 取供试液1ml，分别加入上述５种实验菌株1ml，立即倾注15～20ml适宜培养基平行制备２个平皿，待凝固后置规定温度培养，细菌培养3ｄ，霉菌及酵母菌培养5ｄ，观察结果，记录菌落数，作为实验组。同法测定相应加入的实验菌菌落数，作为菌液组。测定供试品本底菌菌落数，作为供试品对照组。根据下式计算回收率，结果见表1。
回收率（％）＝（实验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）／菌液组平均菌落数×100%。
表1 常规法微生物限度方法验证回收率(%)
2.4 控制菌方法验证
根据2010年版《中国药典》一部规定，西洋参免煎中药颗粒为含药材原粉的口服给药制剂，应对大肠埃希菌、大肠菌群进行验证。进行大肠埃希菌与大肠菌群方法验证时，采用实验菌均为大肠埃希菌。
2.4.1大肠埃希菌方法验证
2.4.1.1实验组 取供试液10ml加入100mlBL液中，加入10～100cfu的大肠埃希菌，35～37℃培养24h。取0.2ml培养物接种至5mlMUG培养基，分别培养5h、24h，在366nm紫外光下观察是否发出荧光，沿管壁加入靛基质，观察液面是否呈玫瑰红色，结果见表3。
2.4.1.2阳性对照组 取10～100cfu/ml的大肠埃希菌菌悬液1ml，加入100mlBL液中，依据大肠埃希菌检查法实验，结果见表3。
2.4.1.3阴性对照组 取稀释液10ml加入100mlBL液中，依据大肠埃希菌检查法实验，结果见表3。
表3 直接接种法对大肠埃希菌方法验证结果
注:+代表检出大肠埃希菌;-代表未检出大肠埃希菌。
2.4.2大肠菌群方法验证
2.4.2.1实验组 取1:10供试液1ml和10～100cfu/ml的大肠埃希菌菌悬液1ml，加入10ml乳糖胆盐发酵培养基中35～37℃培养24h。观察乳糖胆盐发酵管中是否产酸产气将可疑管中培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）在EMB平板挑选4～5个疑似菌落镜检并再次接种于10ml乳糖胆盐发酵管中，结果见表4。
2.4.2.2阳性对照组 取10～100cfu/ml的大肠埃希菌菌悬液1ml加入10ml乳糖胆盐发酵培养基中，依据大肠菌群检查法实验，结果见表4。
2.4.2.3阴性对照组 取稀释液1ml加入10ml乳糖胆盐发酵培养基中，依据大肠菌群检查法实验，结果见表4。
3.讨论
中药免煎颗粒由于使用方便不需煎煮，在各大医院已被广泛的应用，在目前的使用率看还不及传统的中药饮片，但其剂量准确、快捷、方便等优势对于传统中药饮片还是一种很好的补充。目前，全国的中药配方颗粒生产企业已成规模，但是由于生产工艺和中药特性不同，中药免煎颗粒剂的质量控制上还存在较大在差异。西洋参免煎中药颗粒在进行微生物限度检查中发现，在菌落计数中发现1：10的供试液随着放置时间延长，供试液会发生粘稠膨胀影响菌落生长和菌落的计数。在西洋参免煎中药颗粒进行微生物方法验证实验时先采用了2010年版《中国药典》一部附录微生物检查法规定的常规法对样品进行验证，发现采用常规法进行验证时，西洋参免煎中药颗粒的黑曲霉、白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均低于70%.采用培养基稀释法再次对样品进行方法验证，实验结果表明，采用培养基稀释法（0.2ml/皿）进行验证时，黑曲霉、白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均高于70%，可采用0.2ml/皿法对该药进行细菌数测定。对西洋参免煎中药颗粒大肠埃希菌进行验证时，采用直接接种法实验组与阳性组中胆盐乳糖培养基均变浑浊，MUG管内培养物呈现荧光，加入数滴靛基质后，液面呈玫瑰红色。采用直接接种法对大肠菌群进行验证时，实验组与阳性对照组乳糖发酵管均产酸产气，EMB平板生长紫红色、圆形或稍凸起菌落，镜检结果为革兰氏阴性无芽孢杆菌，在EMB平板挑选疑似菌落再次接种于10ml乳糖发酵管，均产酸产气。阴性对照组呈阴性反应。因此，可采用直接接种法对西洋参免煎中药饮片进行大肠埃希菌与大肠菌群的控制菌检查。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中国药典2010年版(一部)[S].北京:中国医药科技出版社，2010：附录ⅩⅢC79-88.
论文作者:张璐,杨红霞
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第27期供稿
论文发表时间:2015/11/4
标签：培养基论文; 西洋参论文; 大肠论文; 菌落论文; 微生物论文; 颗粒论文; 中药论文; 《医药前沿》2015年第27期供稿论文;