唐可[1]2003年在《可溶性CD40-IgG1 Fc融合基因重组腺病毒载体的构建与抑制粥样硬化斑块重构的体外研究》文中研究指明动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)不稳定斑块破裂和继发血栓形成是导致急性心血管事件(如急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、猝死型冠心病以及缺血性中风)发生的病理基础。其中斑块局部的炎症细胞(主要是巨噬细胞和T淋巴细胞)与炎症介质所介导的炎症／免疫反应在斑块破裂及促血栓形成所继发的急性冠脉综合征中起至关重要的作用。 近年来CD40和CD40配体(CD40 ligand,CD40L)在AS发生和斑块稳定性中的作用日益引起人们的重视。CD40是一种膜受体蛋白，几乎可在人AS病变中所有的细胞类型(如巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞)中表达；CD40L主要存在于T细胞及激活的血小板表面。CD40通过与CD40L结合可导致一系列的炎症反应。临床研究发现，与对照组及稳定性心绞痛组相比，不稳定性心绞痛患者血清sCD40水平、T细胞与血小板表面CD40L均显着升高。可溶性的CD40L与女性心血管危险相关。基础平均sCD40浓度明显升高者后继发生了心肌梗死，中风或心血管死亡，而对照组没有心血管疾病。病理研究进一步证实无论早期，还是晚期复杂AS病变中都有CD40和CD40L的表达，尤其在斑块易破裂的肩部及破裂的斑块中更为显着；采用高分辨MRI发现，可溶性的CD40配体水平能够反映粥样硬化斑块的脂质积聚。体外研究发现，CD40L可促进AS相关细胞(如巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞)分泌表达趋化因子、粘附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶及促凝因子。通过CD40能够诱导斑块相关细胞表达基质金属蛋白酶与TF表达参与了诱发急性冠脉事件。CD40参与TF表达，在致AS与血管损伤的炎症反应中增强了斑块的致血栓形成作用。sCD40L反映了高胆固醇血症和促凝状态之间的分子联系，而他汀类药物治疗能够显着降低sCD40L与促凝状态。另外，体内sCD40L与血小板激活标志及促凝状态标志呈正相关，CD40信号可以促进血栓的形成，CD40L可诱导内皮细胞组织因子的分泌表达，形成稳定的血栓。激活的T细胞与血小板CD40L能够激活MMP，从而促进粥样硬化斑块破裂。这些证据俱支持CD40信号触发的炎症反应可诱导斑块破裂及血栓形成。CD40L通过增加内皮反应性氧自由基抑制内皮细胞迁移。通过CD40阻断EC迁移可能严重影响斑块糜烂后内皮的再生，从而导致循环血中CD40L升高患者急性冠脉事件发生的危二壑巴些坐里塑翌遇旦塑堕痘参载述的鲍建与抑制粥祥硬些斑块重构的体外研究.一二l.二押琴险性增加。 他汀类药物与GP 11 b/llla拮抗剂能够分别抑制CD40与CD40L的表达。抑制CD4O不仅限制了小鼠AS的进展〔14，‘5，，还改变了粥样硬化斑块的组成，形成了能够促进斑块稳定的形态。并且早期与延迟的抗CD4OL抗体治疗均能够诱导稳定的斑块形态。CD4O有可能成为预防粥样硬化斑块不稳定与破裂的特殊治疗途径。 通过可溶性的CD4O一工g融合蛋白来阻断CD40与CD4OL间的作用，在小鼠移植物抗宿主疾病的治疗中取得了良好的效果〔‘6」，Nom盯a用腺病毒介导CD4o一工gG也成功抑制了大鼠肝移植后的免疫排斥〔‘7，。但至今未见CD40一工g融合蛋白应用于稳定AS斑块的报道。我们拟从阻断cD4o信号着手，寻找治疗AS斑块这一特殊类型炎症的有效办法。 可溶性CD4O蛋白(soluble CD4O，sCD40)由CD4O的胞外区构成，能够与膜表面CD4O竞争性结合CD40L的功能区域，可阻断膜表面CD40与CD4OL的相互作用。受此启发本研究拟构建可溶性CD4O/I gGIF。融合基因重组腺病毒，感染内皮细胞，表达可溶性CD40，竞争性结合rCD4OL，从而阻断由细胞膜表面CD40所介导的动脉粥样硬化斑块重构。从而达到稳定斑块的目的，从发病机理的角度探讨可溶性CD40稳定斑块的可能性。 本研究通过对承载可溶性CD40/工gGFc融合基因的质粒pCD4O插入片断进行测序，构建并合成引物，采用PCR方法获得目的基因，从而应用亚克隆的方法逐步构建重组穿梭质粒与重组腺病毒基因组质粒，经线性化后以脂质体方法转染293细胞，冻融后获得原代病毒，经过293细胞的扩增，以终点稀释试验的方法检测病毒滴度。得到重组腺病毒滴度达到1.3X10sPFU。通过EL工SA与Western blot七ing方法检测目的蛋白可溶性CD4O表达，通过PCR方法验证目的基因。 本研究以脂质体方法将可溶性CD40/IgGIFc重组pcDNA3.1转染血管内皮细胞ECV一304，通过200 pg/m1G一418抗性筛选转染克隆，或以重组腺病毒按10一100pfu/细胞感染上述细胞，并采用EL工SA与Western blotting方法检测可溶性CD4O表达。研究发现，腺病毒感染的内皮细胞ECV一304表达目的蛋白水平显着高于以重组质粒稳定转染的内皮细胞株。本研究通过流式细胞术的方法，验证了内皮细胞株ECv一304膜表面存在cD4O高表达，从而为可溶性CD4O的功能研究奠定了实验基础。 本实验研究观察了体外可溶性CD4O表达载体阻断CD4O~CD4OL结合的抗重构效果。以正常血管内皮细胞为空白对照，并同时设立抗CD4O抗体阴性对照。首先将抗CD4O抗体与正常内皮细胞孵育10分钟，再分别加入重组人CD40L，培养24小时，分别于O，2，6，12，24小时收集上清液，并通过EL工SA方法定量检测可溶性CD4O与基质金属蛋白酶二丝些竺些巴竺
沈笑春[2]2007年在《血小板源性CD40、CD40配体在肺癌患者中的表达及其意义》文中指出目的:通过测定肺癌患者血小板源性CD40、CD40配体(CD40L)的表达水平和血清中可溶性CD40(sCD40)、可溶性CD40L(sCD40L)、血浆CD62P的含量,探讨血小板源性CD40/CD40L在肺癌外周血中的表达及其临床意义。同时测定了血浆抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的活性水平,以探讨凝血系统在CD40/CD40L途径中发挥的作用。方法:体外分离85例肺癌患者和25例健康志愿者(对照组)的血小板、血清和血浆。血小板在用二磷酸腺苷(ADP)体外诱导前后采用流式细胞仪对其表面表达的CD40、CD40L、血小板P选择素(CD62P)进行测定,同时用ADP对各实验组部分受试者的血小板进行体外诱导,观测血小板源性CD40、CD40L、CD62P的体外表达变化过程;用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对血清sCD40、sCD40L、血浆CD62P的含量进行测定;并用全自动凝血分析仪测定血浆AT-Ⅲ的活性水平。结果:(1)ADP诱导前,肺癌组血小板源性CD40、CD40L、CD62P表达水平明显高于对照组(P均<0.01)。ADP诱导后,肺癌组血小板源性CD40、CD62P表达水平明显高于对照组(P均<0.01),而血小板源性CD40L与对照组相比差别无统计学意义(P>0.05)。(2)ADP诱导前后,不同病理类型肺癌患者血小板源性CD40、CD40L、CD62P表达水平的差别均无统计学意义(P均>0.05)。(3)ADP诱导前后,肺癌患者血小板源性CD40L、CD62P表达水平随临床分期的进展而呈增高趋势。不同期别肺癌患者血小板源性CD40表达水平差别无统计学意义(P均>0.05)。(4)ADP诱导前后,有远处转移患者血小板源性CD40L、CD62P表达水平明显高于无远处转移患者(P<0.05)。(5)肺癌组血小板在用ADP体外诱导的过程中(120min),其CD40L和CD62P表达水平呈正相关(r=0.521, P<0.01)。(6)肺癌组血清sCD40、sCD40L、血浆CD62P含量明显高于健康对照组(P均<0.01)。(7)不同病理类型肺癌患者血清sCD40、sCD40L含量、血浆CD62P含量差别均无统计学意义(P均>0.05)。(8)肺癌患者sCD40、sCD40L、CD62P的含量随临床分期的进展而呈升高趋势。(9)有远处转移肺癌患者sCD40、sCD40L、CD62P的含量明显高于无远处转移患者(P均<0.05)(10)肺癌患者术后两周时血浆CD62P、血清sCD40L的含量均较术前下降,但血清sCD40含量与术前相比无明显统计学差异。且其CD62P、sCD40L的表达水平成正相关关系(r=0.300,P<0.05)。(11)肺癌患者血浆AT-Ⅲ活性水平明显低于正常人(P<0.01),但其血小板计数与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05)。(12)肺癌患者血清sCD40L的含量与血浆CD62P含量(Pearson相关系数r=0.388,P<0.05)、血浆AT-Ⅲ活性水平(Pearson相关系数r=-0.421,P<0.01)均有相关关系。而且血浆CD62P含量与血浆AT-Ⅲ活性水平也存在相关关系(Pearson相关系数r=-0.256,P<0.05)。(13)对血清sCD40L水平与肺癌患者的临床特征如:年龄、性别、肿瘤大小、CD62P含量、AT-Ⅲ活性水平做多元线性回归分析(决定系数r2=0.635, P<0.01),发现肺癌患者血浆CD62P含量对其血清sCD40L水平的影响最大(标准回归系数为0.422, P<0.01),肺癌患者血浆CD62P含量对血清sCD40L水平有显着性影响,而血清sCD40L水平与其年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性(P均>0.05)。结论:(1)肺癌患者血小板源性CD62P、CD40L表达水平增加,血清sCD40、sCD40L、血浆CD62P含量也相应增加,且表达水平与肺癌的进展程度相关,血小板源性CD40/CD40L系统在肺癌的发病中具有重要作用。(2)CD40L与CD62P呈正相关,提示血小板源性CD40L也可作为血小板的活化指标之一,血小板活化对原发肿瘤的进展具有促进作用。(3)肺癌患者体内凝血活性增高,但肺癌患者血清sCD40L水平的升高可能源于血小板的活化而非凝血系统的活化。(4)检测血小板源性CD40L、CD62P表达水平对研究肺癌的临床分期、预后判断有一定的参考价值。(5)抑制血小板活化可能成为治疗肺癌的另一个途径,而血小板源性CD40/CD40L分子可能是重要的靶点之一。
官俏兵, 杨毅, 张晓玲, 郭丽, 韩晨阳[3]2019年在《缺血性卒中合并阿司匹林抵抗患者血小板源性CD40和CD40配体的表达水平和诊断意义》文中认为目的 探讨缺血性卒中合并阿司匹林抵抗患者血小板源性CD40、CD40配体(CD40L)的表达水平及临床意义,为临床中阿司匹林抵抗的诊断提供新思路。方法 选择2017年1月至2018年3月于嘉兴市第二医院神经内科就诊的缺血性卒中患者80例(ASR组),其中阿司匹林抵抗患者35例(AR组),非阿司匹林抵抗患者45例(AS组),选择同期体检中心的25名健康体检者作为对照组。体外分离患者和健康人的血小板、血清以及血浆。血小板采用二磷酸腺苷(ADP)诱导后采用流式细胞术检测表面CD40、CD40L和血小板P选择素(CD62P)的水平。用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中可溶性CD40(s CD40)、可溶性CD40配体(sCD40L)和CD62P的水平,用全自动凝血分析仪测定血浆AT-III活性水平。采用SPSS 11.5软件进行配对t检验、独立样本t检验。结果 ADP诱导前和诱导后,ASR组血小板源性CD40、CD40L和CD62P的水平均显着高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。ADP诱导前和诱导后,AR组患者血小板源性CD40、CD40L和CD62P的水平均显着高于AS组,差异均有统计学意义(P<0.01)。ASR患者sCD40、sCD40L和CD62P的水平显着高于对照组,AR组患者sCD40、sCD40L和CD62P的水平显着高于AS组,差异均有统计学意义(P<0.01)。ASR患者AT-III的活性显着低于对照组,AR组患者AT-III的活性显着高于对照组和AS组,差异均有统计学意义(P<0.01)。血小板源性CD40在ADP诱导前和诱导后作为阿司匹林抵抗诊断的敏感性分别为0.842、0.965,血小板源性CD40L在ADP诱导前和诱导后作为阿司匹林抵抗诊断的敏感性分别为为0.890和0.721,血小板源性CD62P在ADP诱导前和诱导后作为阿司匹林抵抗诊断的敏感性分别为0.961和0.916。结论 血小板源性CD40和CD40L在阿司匹林抵抗的患者中高表达,提示CD40和CD40L是血小板活化的标志之一,对于阿司匹林抵抗的诊断有着参考价值。
参考文献：
[1]. 可溶性CD40-IgG1 Fc融合基因重组腺病毒载体的构建与抑制粥样硬化斑块重构的体外研究[D]. 唐可. 第二军医大学. 2003
[2]. 血小板源性CD40、CD40配体在肺癌患者中的表达及其意义[D]. 沈笑春. 苏州大学. 2007
[3]. 缺血性卒中合并阿司匹林抵抗患者血小板源性CD40和CD40配体的表达水平和诊断意义[J]. 官俏兵, 杨毅, 张晓玲, 郭丽, 韩晨阳. 中国慢性病预防与控制. 2019
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