广州医学院第一附属医院 广东广州 510000
【摘 要】目的：探讨天龙咳喘灵对缺氧性肺动脉高压大鼠一氧化氮合酶（NOS）及其基因表达的影响。方法：以45只SD大鼠为研究对象，随机均分为三组：A组正常饲养，做健康对照；B组置入常压低氧舱，10h/d，持续4周，做疾病对照；C组同种方案置入常压低氧舱，并予天龙咳喘灵灌胃。4周后测定大鼠肺动脉压（mPAP）、动脉血NO水平、肺动脉cNOS及iNOS活性、肺动脉cNOSmRNA及iNOSmRNA表达。结果：mPAP对比，B组明显高于A、C组（P＜0.05），C组略高于A组，但差异不显著（P＞0.05）；动脉血NO水平对比，B组均明显低于A、C组（P＜0.05），C组略低于A组，但差异不显著（P＞0.05）；iNOS及其mRNA对比，均呈现C组高于B组高于A组趋势，两组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；cNOS及其mRNA对比，均呈现C组高于A组高于B组趋势，两组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：天龙咳喘灵有助于降低缺氧性肺动脉高压大鼠平均肺动脉压、提升其动脉血NO水平，这可能与其能够显著提升大鼠NOS及其基因的表达水平有关。
【关键词】天龙咳喘灵；缺氧性肺动脉高压；一氧化氮；一氧化氮合酶；大鼠
【中图分类号】R972+.6 【文献标识码】B 【文章编号】1764-8999（2015）7-0573-02
【Abstract】Objective：To investigate the Denon Kechuan Ling on hypoxic pulmonary hypertension rats, nitric oxide synthase (NOS) gene expression and its influence. Methods 45 SD rats as the research object, randomly divided into three groups: A group with normal feed, do healthy controls; B group was implanted with low oxygen chamber at atmospheric pressure, 10h/d, for 4 weeks, as disease control; group C the same scheme of atmospheric low oxygen chamber implantation, and to Denon Kechuanling gastric lavage. Rat pulmonary artery pressure were measured after 4 weeks (mPAP), the expression level of arterial blood NO, cNOS and iNOS activity in pulmonary artery, pulmonary artery cNOSmRNA and iNOSmRNA. Results：mPAP comparison, B group was significantly higher than that in A, C group (P < 0.05), C group was slightly higher than that of A group, but the difference was not significant (P > 0.05); the contrast level of arterial blood NO, A, B were significantly lower than those in C group (P < 0.05), C group was slightly lower than that of group A, but the difference was not significant (P > 0.05); iNOS and mRNA contrast, showed a C group than in B group than in A group trends, differences between the two groups was statistically significant (P < 0.05); cNOS and mRNA contrast, showed a C group than in A group than in B group trends, differences between the two groups was statistically significant (P < 0.05). Conclusion：Denon Kechuanling helps to reduce the mean pulmonary artery in rats with hypoxic pulmonary artery hypertension pressure, enhance its arterial blood NO levels, which may be related to significantly enhance the expression level of NOS and its related genes in rats.
【keyword】 Denon Kechuanling; hypoxic pulmonary hypertension; nitric oxide; nitric oxide synthase; rat
血浆NO主要参与调解血管张力，可能参与肺动脉高压的形成，而缺氧性肺动脉高压则是慢性阻塞性肺疾病的主要病理生理学基础之一[1]。近期研究显示天龙咳喘灵胶囊对治疗多种慢性咳喘症有一定临床价值，可显著提升患者最大呼气流量[2]，但针对性分析其对患者血浆一氧化氮水平的影响、意义及相关机制的研究尚不多见。本研究则旨在通过动物实验探明上述问题，报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料 二级雄性SD大鼠共45只，均购自华中科技大学同济医学院，体重180～220g，行随机数字表法均分为A、B、C三组。
1.2 仪器与试剂 生物机能实验系统（BL-420，成都泰盟科技）、常压低氧舱（自制）、兔抗鼠cNOS和iNOS试剂盒（美国Santa Crus）、cNOS和iNOS多项寡核苷酸探针（武汉博士德）、天龙咳喘灵胶囊（广州医科大学附属第一医院）等。
1.3 造模方法A组大鼠正常饲养，不做任何处理；B组大鼠置入常压低氧舱，设置舱内氧体积分数（10±0.5）%，并放入适量钠石灰、无水氯化钙，每日8h，持续4周，在置入前予生理盐水灌胃，剂量0.5g/kg；C组大鼠参考B组方案，置入常压低氧舱，在置入前每日予天龙咳喘灵胶囊灌胃，剂量0.5g/kg。
1.4 观察指标 于实验开始4周后，取大鼠检测平均肺动脉压力（mPAP）、动脉血浆NO水平、肺动脉原生型一氧化氮合酶（cNOS）及其mRNA表达水平、肺动脉诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其mRNA表达水平。其中mPAP以生物机能实验系统测定、血浆NO以硝酸还原酶法测定、cNOS和iNOS活性以免疫组化法测定、cNOSmRNA及iNOSmRNA表达以多项寡核苷酸探针测定。实验操作均严格参考试剂盒及仪器说明书。
1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计学软件处理数据，计量资料按（±s）表示，多组间对比行F检验及SNK-q检验，以P＜0.05为差异具备统计学意义。
2 结果
2.1 三组mPAP及血浆NO水平对比
F检验指出，三组间mPAP及血浆NO存在明显差异（P＜0.05），见表1。续行两组间对比指出B组mPAP明显高于A、C两组，B组血浆NO水平明显低于A、C两组，组间差异具备统计学意义（P＜0.05）。
3.2 NOS表达水平对比
F检验指出，三组间肺动脉iNOS及cNOS水平均呈明显差异（P＜0.05），见表2。续行两组间对比，指出C组iNOS水平明显高于B组，B组iNOS水平明显高于A组；C组cNOS水平明显高于A组，A组cNOS水平明显高于B组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05）。
3.3 NOSmRNA表达水平对比
F检验指出，三组间肺动脉iNOSmRNA及cNOSmRNA水平均呈明显差异（P＜0.05），见表3。续行两组间对比，指出C组iNOSmRNA水平明显高于B组，B组iNOSmRNA水平明显高于A组；C组cNOSmRNA水平明显高于A组，A组cNOSmRNA水平明显高于B组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论
天龙咳喘灵根据广州医科大学附属第一医院专家所提出的经验方制备而成，主含青天葵、五味子、熟附子、法半夏、款冬花等，对肺动脉高压、阻塞性肺疾病等有较为确切的治疗效果。考虑到血浆NO体系调控与长期缺氧下肺动脉反应性增强及肺动脉结构改建直接相关，我们推测天龙咳喘灵的作用机制可能与直接或间接影响血浆NO水平有关，本研究则能证实，该药物确有促进iNOS及cNOS活性及基因表达的作用，具体分析如下：
首先，本研究可证实持续4周的低氧环境饲养可导致大鼠mPAP明显升高，但C组mPAP明显低于B组，而接近与A组，这说明慢性缺氧将导致大鼠出现肺动脉高压，而天龙咳喘灵有助于降低肺动脉压，进而预防阻塞性肺疾病。对比大鼠血浆NO水平，则显示随mPAP的提升，大鼠血浆NO水平明显降低，而天龙咳喘灵则有助于抑制血浆NO的异常降低，这提示血浆NO水平可能直接与肺动脉高压的发生及发展有关，在既往研究中已有证实[3-4]。
其次，受持续性低氧环境的影响，大鼠cNOS呈下降趋势，但C组在天龙咳喘灵的作用下，cNOS显著提升，甚至超过了A组的基线水平，这说明：第一，低氧环境导致cNOS转录受到抑制，合成减少、活性降低，从而使NO的生成量降低，导致肺动脉高压；第二，天龙咳喘灵可明显提升cNOS基因的表达量，进而增加NO水平，这可能与法半夏等对血管内皮细胞的保护作用有关，张炳填等人的研究已证实法半夏具备此方面的功能[5]。
最后，持续性低氧环境将导致大鼠血浆iNOS水平显著上升，这是机体为抵抗NO水平下降而出现的正常应激反应，机制可能与诱发低氧诱导因子的表达有关[6]，该因子可能充当转录因子结合iNOS基因相关位点，增强iNOSmRNA的表达[7]。而加用天龙咳喘灵后，此机制被进一步增强，C组大鼠iNOS活性及其基因表达更高。这与既往关于天龙咳喘灵主要成分的其它研究结果类似，如焦杨等人证实青天葵提取物可能影响血浆NO水平[8]，而樊林花、刘颖等人还证实五味子、熟附子可能有助于提升iNOS水平[9-10]。
上述结论提示：缺氧性肺动脉高压的出现可能与cNOS及其mRNA的表达下降，进而导致NO水平下降有关，而天龙咳喘灵胶囊将同时提升iNOS及cNOS基因表达及活性，从而明显提升NO水平，进而抑制肺动脉高压的进一步发展。但受研究条件限制，本研究结果尚不能直接反应血浆NO与肺动脉高压发展的相关性，还有待后续研究补充。
参考文献
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[10] 刘颖,吴伟康,赵明奇等.四逆汤预处理诱导大鼠心肌延迟预适应的一氧化氮机制[J].中成药,2005,27(2):187-190.
论文作者:王文
论文发表刊物:《中医学报》2015年7月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/19
标签：肺动脉论文; 咳喘论文; 水平论文; 大鼠论文; 氧化氮论文; 血浆论文; 高于论文; 《中医学报》2015年7月第30卷供稿论文;