王春来[1]2000年在《胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素特性鉴定及免疫原性研究》文中研究说明我国流行的猪的传染性胸膜肺炎主要是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）血清型7型引起的。我们对该型菌株深8株分泌的溶血素进行了分析和研究。通过温度敏感试验，我们发现存在着两种溶血素，一种为热稳定的溶血素，经过60℃ 30分钟及121℃ 1小时的加热处理后仍有溶血活性，并且能够耐受甲醛和蛋白酶的处理，估计其性质可能是一种碳水化合物；另一种为热不稳定的溶血素，60℃ 30分钟或100℃ 3分钟就可以使其溶血活性彻底丧失，经过硫酸铵沉淀盐析及凝胶过滤层析提纯后，进行SDS-PAGE电泳，表明该溶血素为分子量65KDa的蛋白，对蛋白酶K敏感，其活性可被蛋白酶K所抑制，但却对甲醛不敏感。 我们用纯化的65KDa的溶血素蛋白与APP所有血清型的阳性血清做交叉中和实验和琼脂扩散实验。交叉中和实验中血清型1和4表现出很高滴度的中和抗体，表明与血清型7关系较近，而在琼脂扩散实验中，除了同源血清型7外，其它血清型如1、4、5、9的样品孔与溶血素抗原孔之间也出现了沉淀带。以上结果表明溶血素抗体的抗原结合位点可能有很多，但起中和作用的位点可能很少，只存在于几个血清型之间。由于自然感染APP某个血清型的猪的血清中存在着抗溶血素的中和抗体，故推测溶血素可能具有一定的免疫原性并参与免疫保护，于是我们把65KDa的溶血素蛋白用做抗原免疫兔子，然后进行攻毒，实验表明溶血素对同源菌株的攻击能够提供一定的免疫保护。
王春来, 杨旭夫, 刘杰[2]2001年在《胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素特性鉴定及免疫原性研究》文中研究表明本文报道了胸膜肺炎防线杆菌 (APP)血清型 7型菌株深_8株分泌的溶血素。研究证明该菌株至少可分泌两种溶血素 ,一种为热稳定的溶血素 ,另一种为热不稳定的溶血素。本研究没有对热稳定的溶血素进行提纯分析 ,而对热不稳定的溶血素经过盐析及凝胶过滤层析提纯后 ,进行SDS_PAGE分析 ,表明该溶血素为分子量 6 5kDa的蛋白。本研究利用纯化的6 5kDa的溶血素蛋白与APP所有血清型的阳性血清做交叉中和实验和琼脂扩散实验及动物实验 ,证明该溶血素蛋白具有一定的免疫原性及保护力 ,但其诱导的免疫反应对同源菌株的攻击只能提供部分保护。
周洋[3]2013年在《胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛结构蛋白ApfA功能及免疫原性研究》文中研究指明猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种高度传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。APP通过飞沫传播或感染动物接触传播,定植于猪下呼吸道表皮细胞。APP血清型众多,根据表面多糖抗原性差异可将该病原分为15个血清型。胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区的流行情况具有一定差异,我国已分离到APP血清1、2、3、4、5、7和8型菌株,其中以7型最多,其次为1型、2型和3型。APP致病过程涉及众多毒力因子,目前围绕其致病机制开展了大量研究工作,然而APP早期定植感染的致病机理尚不明确。Ⅳ型菌毛在多种病原菌致病过程中发挥重要作用,其中包括介导粘附定植、突破免疫屏障、影响生物被膜形成、颤搐运动、DNA摄取等。为了更好地控制和预防APP导致的疾病,研究APP致病机理,尤其是APP早期粘附定植的作用机制具有重要意义。本课题对APPⅣ型菌毛的功能和在致病过程发挥的作用进行探讨,并对Ⅳ型菌毛结构蛋白白ApfA的免疫原性与免疫保护力进行了研究。1.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛介导粘附和定植粘附是细菌建立感染的第一步,在致病过程中起着决定性作用。因此本课题对APPⅣ型菌毛是否参与APP宿主粘附定植过程进行研究,研究结果如下：首先,通过荧光定量PCR的方法对APP与猪肺上皮细胞(SJPLC)互作后Ⅳ型菌毛操纵子基因表达水平进行检测,发现与细胞互作后apf操纵子整体表达水平显著上升。其次,本研究构建了Ⅳ型菌毛结构蛋白基因缺失突变株4074△apfA,以及互补菌株C40740△apfA。以猪髋动脉内皮细胞(PIEC)和SJPLC为粘附模型,通过粘附和粘附抑制实验共同证明Ⅳ型菌毛在APP粘附宿主细胞的过程中发挥作用。同时,通过共聚焦显微镜对粘附结果进行观察,发现4074ΔapfA基因缺失突变株粘附能力显著减弱,而互补菌株与野生株粘附能力相当,再次证明Ⅳ型菌毛参与粘附过程。最后,在小鼠活体感染模型中证明Ⅳ型菌毛在APP肺部定植过程中发挥重要作用,并影响APP致病力。以上结果表明APPⅣ型菌毛是细胞接触诱导表达型,参与了APP定植感染过程,在致病过程中发挥重要作用。2.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛负调控生物被膜的形成Ⅳ型菌毛参与粘附外的多种致病机制,本研究对APPⅣ型菌毛可能参与的其他致病机制进行探讨。为了研究Ⅳ型菌毛是否与APP生物被膜形成调控相关,我们通过结晶紫染色方法对野生菌株和4074ΔapfA基因缺失突变株的生物被膜形成能力进行定量比较,结果发现4074ΔapfA基因缺失突变株生物被膜形成能力显著增强。该结果表明Ⅳ型菌毛负调控APP生物被膜的形成,我们推测Ⅳ型菌毛可能参与了群体感应调节因子LuxS对于生物被膜形成的负调控过程。此外,我们还对比了野生菌株和4074ΔapfA基因缺失突变株溶血活性和细胞毒性的差异,结果发现Ⅳ型菌毛的缺失不影响APP溶血毒素和细胞毒素的分泌。3.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛潜在受体的寻找以上研究证明了Ⅳ型菌毛主要是通过介导细胞粘附在APP早期感染过程中发挥重要作用。在奈瑟球菌属中,Ⅳ型菌毛的已知细胞粘附受体是CD46分子,为了验证CD46分子是否为APP Ⅳ型菌毛的特异性受体,我们进行了以下研究：首先,构建pcDNA-CD46真核表达质粒并转染幼仓鼠肾传代细胞(BHK)(CD46分子阴性细胞),通过流式细胞术检测转染效率,证明CD46分子在BHK细胞中表达。通过粘附实验发现,CD46分子的表达并没有显著提高APP对细胞的粘附效率。其次,用CD46抗体处理SJPLC和PIEC细胞(CD46分子阳性细胞),进行粘附抑制实验,结果显示CD46分子抗体封闭不影响APP对细胞的粘附作用。因此,上述结果证明CD46并非APP特异性粘附受体。为了进一步寻找Ⅳ型菌毛的可能性受体,我们通过酵母双杂交的方法来进行研究：构建pGBKT7-apfA作为诱饵载体,转化酵母Y187菌株后与猪肺部cDNA酵母文库进行杂交,经过三轮筛选获得4个阳性克隆。对阳性克隆进行测序并分析,结果发现其中一个可能是Ⅳ型菌毛互作受体蛋白。该蛋白与猪Talinl蛋白同源,是一种细胞骨架蛋白,其与APPIV型菌毛的互作关系还有待进一步的验证。4.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA是良好的保护性抗原本研究对Ⅳ型菌毛基因簇在APP13个血清型中的分布情况和同源性进行比较分析,结果发现编码ap/A基因的结构蛋白在12个血清型中高度保守；Ⅳ型菌毛基因簇在11个血清型中高度保守。为了检测Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA的免疫原性,我们首先表达纯化了重组ApfA (rApfA)蛋白,然后用纯化的rApfA免疫小鼠,发现能够诱发小鼠产生免疫应答,产生较高抗体水平。其次,我们用rApfA-ELISA对猪APP感染血清和阴性血清中anti-ApfA抗体水平进行检测,发现感染血清中的抗体水平显著高于阴性血清。以上结果说明Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA不仅存在于所有血清型中,序列高度保守,并且具有很强的免疫原性。以上研究发现APP IV型菌毛结构蛋白ApfA具有较好的免疫原性并且高度保守,有可能发展成为是良好的保护性抗原。因此,我们接下来对菌毛结构蛋白ApfA能否提供有效的免疫保护力进行评估。首先,通过rApfA主动免疫小鼠后感染致死剂量APP,发现该抗原能够对APP血清1型4074菌株感染提供90%的保护,对APP血清7型WF83菌株感染提供80%的保护。其次,对免疫血清中anti-rApfA抗体进行分型,发现rApfA能够诱导Th2型主导的免疫反应。用rApfA免疫血清通过静脉注射被动免疫小鼠,发现该免疫血清能够对APP血清1型4074菌株感染提供40%的保护,对APP血清7型WF83菌株感染提供60%的保护。以上结果表明Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA不仅是一种高效的保护性抗原,能够激发小鼠产生Th2型为主导的免疫应答,对于中国流行血清型1型和7型APP感染提供有效保护,而且ApfA诱导的抗体也具有被动免疫保护力,对于APP不同血清型的感染能够提供一定保护。
马艳芳[4]2009年在《猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的提取纯化及对小鼠致病性和免疫原性研究》文中指出猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种传染性呼吸道疾病。该病在各年龄阶段猪均有发生。临床症状以病猪呼吸困难为特征,病理变化主要是肺部不同程度的充血、出血和纤维素性肺炎,该病的发病率和死亡率常在20%以上,在我国的发生呈现上升趋势,给我国养猪业造成了严重的经济损失。APP的致病因子较多,包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白及溶血毒素(Apx)等,其中溶血毒素是最重要的致病因子,同时研究证实溶血毒素也是重要的免疫原性因子。本试验对毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ进行提纯,并进行三种毒素对小鼠致病性及免疫保护性的研究,为研制有效的多组分亚单位疫苗提供理论依据,对有效预防和控制猪传染性胸膜肺炎,保护和促进养猪业的健康发展具有重要意义。本研究内容分两个部分:第一部分:猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的提取与纯化。根据猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型只分泌ApxI、血清7型APP只分泌ApxⅡ和血清3型主要分泌ApxⅢ的特点,分别对血清10、7、3型APP进行培养,对毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ进行提取并对其纯化。将血清10、7、3型APP山东分离株分别接种于含0.02%NAD的LB液体培养基中,并对毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ最适分泌条件进行优化。在毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ最适分泌条件下培养血清10、7、3型APP,将培养液4℃5000 r/min离心20 min,取上清液,经硫酸铵盐析、透析、浓缩、葡聚糖凝胶分子筛层析,分别从血清10、7、3型APP培养上清液中分离纯化毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ。纯化的毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ经SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ最适分泌时间分别为12 h、12 h和24 h,最适硫酸铵饱和度均为60%。纯化的毒素SDS-PAGE结果显示,ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ大小分别为105 kD、103 kD、120 kD。在Western-blot中,三种毒素分别在相应的分子量大小处出现特异性条带,表明获得的三种毒素具有良好的反应原性。第二部分:溶血毒素对小鼠致病性与免疫保护性的研究。将纯化的三种毒素分别进行致病性与免疫原性研究。致病性试验中为验证毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ的毒性,将纯化的三种毒素进行半数致死量测定,同时将试验分为对照、ApxI、ApxⅡ和ApxⅢ四组,试验组以400μg/只的剂量腹腔注射小鼠,分别于1 d、7 d、14 d后眼眶放血致死,进行血常规及血液生化相关指标检测,同时对体重变化进行全程记录。结果毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ的半数致死量分别为80.9 mg/kg、108.6 mg/kg、128.8 mg/kg;毒素ApxI对小鼠的生长、血常规和血液生化指标影响最大,其次为ApxⅡ、ApxⅢ。免疫保护试验中,测定毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ的最佳免疫剂量分别为40μg、50μg、80μg。按最佳免疫剂量进行不同组合,制备4种亚单位疫苗(ApxⅠ+ApxⅡ、ApxⅡ+ApxⅢ、ApxⅠ+ApxⅢ、ApxⅠ+ApxⅡ+ApxⅢ),并分别于30日龄和40日龄免疫小鼠,60日龄时用血清1、3、5、7、10型APP攻毒。制备的4种亚单位疫苗免疫小鼠后,对血清1、3、5、7、10型APP攻击的平均保护率分别为87.5%、80%、84.1%、97.5%,表明含三种溶血毒素的亚单位疫苗的免疫保护作用明显优于其它含有两种溶血毒素的疫苗。研究表明毒素ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ在猪传染性胸膜肺炎的免疫保护过程中具有一定作用,该研究为研制新型高效的猪传染性胸膜肺炎疫苗提供了理论基础。
刘霞[5]2006年在《猪胸膜肺炎放线杆菌亚单位成分的制备、免疫原性研究及型特异性间接ELISA方法的建立》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎(Porcine Pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae, APP)引起的一种常见的呼吸道传染病,各年龄的猪只均可感染。猪群感染胸膜肺炎放线杆菌后,当遇到气候环境突变,通风不良等应激因素时,猪只抵抗力下降,可诱发本病,主要表现为精神沉郁,体温升高,呼吸困难等临床症状,并出现特征性的出血性肺炎和胸膜炎。本病在世界各养猪国家普遍存在,近年来,流行日趋严重,成为大规模养猪的五大疫病之一。本研究共分为四部分:第一部分:猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白的分型及对小鼠的免疫原性研究制备1-12个血清型胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜蛋白(OMP),通过SDS-PAGE蛋白质电泳,将12个血清型的外膜蛋白分为6个型,以该外膜蛋白免疫小白鼠,进行同源攻毒保护试验,结果OMP在16μg/只的免疫剂量下可对小白鼠产生较强的保护作用,用同血清型菌株对免疫后的小白鼠攻毒,仅表现肺脏轻微出血,无死亡,而对照组未经免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡,肺脏严重出血;小白鼠免疫后第2d就可以检测到抗体,并且抗体水平上升较快,到第6d抗体达到最高水平,之后,抗体水平开始下降,但下降幅度不大,可持续2个月左右;交叉保护试验结果表明血清3型和4型OMP对血清5型APP没有保护作用,免疫后的小白鼠攻毒仍表现多数死亡;其他血清型之间有交叉保护作用,免疫后的小白鼠攻毒无死亡,仅表现肺脏有不同程度的出血。上述结果表明OMP是猪传染性胸膜肺炎病的主要免疫保护性抗原之一,该研究为APP亚单位疫苗的研制及应用提供了理论依据。第二部分:猪胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖的制备及对小鼠的免疫保护作用
张桂华[6]2013年在《猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及六个外膜蛋白的免疫原性研究》文中认为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是属于巴氏杆菌科放线杆菌属的革兰氏阴性球杆菌,能引起猪的传染性胸膜肺炎。该病的临床特征主要表现为肺坏死、出血和胸膜肺炎,具有高度接触传染性和致死性。目前,除了少部分尚未定型的菌株外,APP主要包括15种血清型,预防和控制本病依然主要使用灭活疫苗,由于型之间的交叉保护力不好,导致灭活苗的保护效果十分有限。本试验主要是对胸膜肺炎放线杆菌的omlA、plpA、lolB、omp2、ompAe及plpB六个外膜蛋白进行了克隆及原核表达,并研究了它们的免疫原性。从湖南送检的疑似胸膜肺炎的猪病料中分离到一株APP,并对其做了PCR鉴定、生化试验、药敏试验及动物感染试验,确定该株APP为血清1型。根据GenBank中发表的胸膜肺炎放线杆菌的全基因序列(Accession:CP001091),利用DNAstar软件挑选出6个外膜蛋白基因设计引物,其中ompAe基因引物中设有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点,其它五个蛋白基因均含有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点。以APP全菌为模板对各目的基因进行PCR扩增,经双酶切处理后回收产物,将其连接到已经酶切处理好的pET-28a(+)表达载体中,并将连接产物转入到大肠杆菌DH5a中。经阳性鉴定和质粒的酶切鉴定,再将阳性质粒转入BL21(DE3)进行诱导。SDS-PAGE检测显示六个蛋白均能高效表达,其中omlA、 plpA及lolB为可溶性表达,omp2、ompAe及plpB为包涵体表达。Western Blot检测表明,omlA、omp2及plpA具有较好的免疫反应性用纯化的各蛋白分别对25g左右的昆明雌鼠进行免疫,均使用弗氏佐剂,初次免疫后的14天和28天加强免疫,每次剂量为50μg/只。以7LD50对各组小鼠进行攻毒,攻毒结果如下：plpA、lolB、ompAe、plpB、自家灭活苗及对照组均死亡,omlA及omp2组各存活一只,保护率为17%(1/6)。根据以上的攻毒结果,选择在omlA及omp2两个蛋白序列前均插入LTB序列,免疫组分别设为omlA+omp2、LTB-omp2、LTB-omlA,对照组仍然注射生理盐水,免疫剂量及方法均同上。各组的攻毒剂量均为5LD50,攻毒保护效果为：omlA+omp2组的保护率为33%(2/6),LTB-omp2组为33%(2/6),LTB-omlA组为17%(1/6)。结果显示,omlA及omp2这两个蛋白联合作用后免疫保护效果有所提高,插入LTB序列后,omp2比omlA的保护效果要好。
刘琼[7]2013年在《血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌双基因ApxⅠC/ⅡC缺失株的构建研究》文中指出猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是一种引起猪严重呼吸道症状的传染病病原菌,可以引发猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia, PCP);在近几年的文献报道中发现,研发主要毒力基因缺失的弱毒疫苗菌株已经成为了研究防治该病的主要方向。本试验以APP单基因缺失株SW1A Ⅱ C为亲本株,构建了同时缺失ApxⅠC以及ApxⅡC的双基因缺失突变株SW1ΔⅠC/ΔⅡC,并对其生物学特性和免疫原性进行相关研究。1、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌SW1ΔIC/ΔIIC的构建1.1同源重组载体pBOSKΔⅡC的构建设计引物以本实验室分离的APP血清5型SW1株基因组为模板扩增ApxⅡC基因上游2654bp和下游2039bp序列TA克隆至pMD19-T,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过SacⅠ、SaiⅠ位点酶切连接至载体pBS-OSK,作为其左、右同源臂,通过PCR和酶切鉴定,试验成功构建了缺失451bp的ApxⅡC基因的APP血清5型SW1株重组转移载体pBOSKΔⅡC。1.2 APP双基因ApxⅠC/ⅡC缺失突变株的构建和筛选将重组转移载体pBOSKΔⅡC通过电转化的方式转入APP血清5型单基因缺失株SW1ΔⅠC感受态,促进同源重组转移载体中同源序列与亲本株基因组进行同源重组,均匀涂布于含有Kan的TSA平板上,待菌落从平板上长出,用PCR扩增鉴定其包含的两个拷贝的含有ApxⅡC基因的上下游片段以及不包含ApxⅡC基因的同源重组载体(738bp和287bp),将阳性菌落转移到含蔗糖的TSA平板,促进其进行第二次负向筛选过程,把在蔗糖平板上长出的菌落进行PCR扩增得到一条约为287bp的片段,该结果证实成功构建了一株在单基因缺失株的基础上再缺失ApxⅡC基因的双基因缺失突变株,命名为SW1ΔⅠC/ΔⅡC,2、SW1ΔⅠC/ΔⅡC的生物学特性和免疫原性研究：生长特性试验证实突变株SW1△ⅠC/△Ⅱ C的生长曲线与亲本株差别不大；基因组体外传代稳定性测定证实突变株的基因组在体外连续培养过程中稳定,不会有突变等影响菌株存活的情况发生；溶血活性验证表明在兔血平皿中不表现溶血活性；上清对细胞生长影响测定表明其上清对细胞基本没有毒性；通过检测其毒素表达情况,表明缺失株仍能够正常表达ApxⅡ毒素；通过测定其毒力以及LD50表明,突变株的毒力相比亲本株明显降低,突变株的LD50为5.0×108CFU,与亲本株相差200倍；在小鼠上进行突变株的免疫保护力实验,免疫了双基因缺失突变株的小鼠能对中剂量的亲本株以及异源血清型菌株的攻击提供100%的保护,对高剂量的异源血清型毒株仍能够提供一定的保护力；用自建ELISA方法检测免疫小鼠血清结果表明：双基因缺失株能够很好的诱导小鼠产生对APP毒素的抗体,抗体滴度在第三次免疫后达到最高。以上这些实验均表明,本研究所构建的双基因缺失突变株的致病性明显降低,能够对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌同源以及异源血清型菌株的攻击提供较全面、有效的保护。
王妮[8]2007年在《猪胸膜肺炎放线杆菌尿素酶的提取及特性研究》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia ; APP)引起的一种猪呼吸道传染病,世界各国均有发生,尤以欧、美各国流行严重。各种年龄的猪均易感染,并常与巴氏杆菌等混合感染。临床症状以病猪呼吸困难为特征,病理变化主要是肺部不同程度的充血、出血和纤维素性肺炎,其发病率和死亡率常在20%以上,最急性型的死亡率可高达80%～100%,如果发展为慢性或潜伏于猪群内,可使猪生长缓慢,饲养成本增加,抵抗力下降。该病在我国的发生呈现逐年上升的趋势,给我国的养猪业造成了严重的经济损失。构成APP致病的毒力因素包括溶血毒素、荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、渗透因子、尿素酶等。研究APP毒力因子的致病作用有利于毒力因子亚单位疫苗或基因工程疫苗的研究,同时对有效疫苗的选择和应用,预防和控制本病也具有重要意义。本研究主要分两个部分:第一部分:猪胸膜肺炎放线杆菌尿素酶的提取纯化及理化特性研究。胸膜肺炎放线杆菌在样品缓冲液中经超声波破碎后,4℃、10000r/min离心20min取上清得到粗提的尿素酶,再经过硫酸铵盐析和SephadexG-200凝胶过滤层析进行提纯,由SDS-PAGE电泳检测提取物的纯度并测定分子量,以及对尿素酶的理化特性,包括pH(6.0、6.5、7.0、7.5、7.7、8.0、8.5、9.0、9.5)和温度(25、30、35、40、45、50和55℃)对尿素酶活性的影响进行了研究。结果表明,APP尿素酶由三个亚单位组成,其分子量分别为11.0、25.0和60.0KD;该酶的最适pH为8.5,最适温度为45℃,在该条件下测得酶比活为96.253U/mg。第二部分:猪胸膜肺炎放线杆菌尿素酶对小鼠免疫原性研究。将制备的APP尿素酶分不同剂量(5、10、15、20、25和30μg/只)免疫小白鼠,然后进行同源保护性试验。结果尿素酶在25μg/只的免疫剂量下可对小白鼠产生较强的保护作用。用同血清型菌株对免疫后的小白鼠攻毒,病理学变化为对照组未经免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡,肺脏严重出血,肝脏肿大出血,而免疫组除免疫5μg组的小白鼠全部死亡、肺脏出血严重,肝脏肿大出血外,其他组小鼠的死亡率呈下降趋势,与对照组相比,肺脏出血轻微;病理组织学变化为对照组肝细胞坏死崩解,肺泡内出血严重,肺间质增厚,间质内出血;免疫组也有类似病变,但程度不同,逐渐减轻。表明尿素酶在猪传染性胸膜肺炎的免疫保护过程中起一定的作用,该研究为APP亚单位疫苗的研制及应用提供了理论依据。
马艳芳, 刁有祥, 张鑫, 纪巍, 孙法良[9]2009年在《猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究》文中提出将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMCaCl2的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化ApxⅠ。将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变化观察。将纯化的ApxⅠ与弗氏佐剂按1:1的比例混合制备亚单位疫苗,免疫小鼠,初免2周后加强免疫1次,二免2周后用血清10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,测定最佳免疫剂量。根据最佳免疫剂量于30日龄和45日龄免疫小鼠,60日龄时分别用血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒。结果该毒素对小鼠的LD50为80.9mg/kg,LD50的95%平均可信限为63.2~103.5mg/kg;ApxⅠ亚单位疫苗的最佳免疫剂量为40μg,对血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌的攻击具有一定的免疫保护效果。
梅岭[10]2006年在《胸膜肺炎放线杆菌血清1型ApxIA N-端多肽免疫原性的确定及表达该多肽的血清7型重组菌株的构建》文中研究表明猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。 目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌感染猪引起的临床症状并降低死亡率，但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变，对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说，目前采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择，迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。 与灭活疫苗和亚单位疫苗不同，自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。这样，弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。构建胸膜肺炎放线杆菌突变株的传统方法存在很多缺陷。利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性，只适合于表型发生明显变化的突变子筛选，而不导致明显表型变化的突变株就不能够通过这些方法获得；而通过同源重组导致靶基因突变方法获得的突变株最后含有抗性标记，由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。本实验室贝为成博士缺失了ApxⅡ的毒力激活因子ApxⅡC的编码基因apxⅡC，获得了基因工程毒力缺失突变株HBC~-／GFP~+，其毒力显著减弱，并能诱导试验动物产生免疫保护，对同血清7型APP的攻击保护率为100％，但对异源血清1型的攻击保护率只有75％。为了进一步提高HBC~-／GFP~+突变株的免疫效力，我们设想以该基因缺失菌株为载体表达ApxⅠ的结构基因apxⅠA，构建新的重组菌株。然而，apxⅠA全长3000多个碱基，采用同源重组的方法引入全长apxⅠA非常困难。鉴于上述背景，本研究确定了ApxⅠ毒素的主要免疫原性区段，试图通过使用同源重组技术和负向选择方法(counter-selection strategy)构建不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡC~-／apxⅠA5~+基因工程突变株，主要研究内容包括： 1．ApxⅠ外毒素N端多肽的免疫原性研究 ApxⅠ外毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)最重要的毒力因子，为了研究其N端多肽的免疫原性，分别将apxⅠA基因的全长编码区(apxⅠA，3146bp)及其5’端1140bp的片段(apxⅠA5)克隆到原核表达载体pET-28a，经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达，表达产物ApxⅠA和ApxⅠAN均以包涵体的形式存在，Western-blot检测证实两种表达产物均具有免疫反应性。将纯化的重组蛋白(rApxⅠA和rApxⅠAN)和提取的天然毒素ApxⅠ(nApxⅠ)分别经腹腔免疫BALB／c小鼠，于免疫前、免疫2周和4周后分别检测了ELISA抗体和毒素中和抗体水平，结果表明，rApxⅠAN免疫组的ELISA抗体显著低于rApxⅠA免疫组和nApxⅠ免疫组，但rApxⅠAN免疫组血清中和试验中测定的溶血素单位与rApxⅠA及天然nApxⅠ免疫组没有显著差异。第二
参考文献：
[1]. 胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素特性鉴定及免疫原性研究[D]. 王春来. 中国农业科学院. 2000
[2]. 胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素特性鉴定及免疫原性研究[J]. 王春来, 杨旭夫, 刘杰. 中国预防兽医学报. 2001
[3]. 胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛结构蛋白ApfA功能及免疫原性研究[D]. 周洋. 华中农业大学. 2013
[4]. 猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的提取纯化及对小鼠致病性和免疫原性研究[D]. 马艳芳. 山东农业大学. 2009
[5]. 猪胸膜肺炎放线杆菌亚单位成分的制备、免疫原性研究及型特异性间接ELISA方法的建立[D]. 刘霞. 山东农业大学. 2006
[6]. 猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及六个外膜蛋白的免疫原性研究[D]. 张桂华. 湖南农业大学. 2013
[7]. 血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌双基因ApxⅠC/ⅡC缺失株的构建研究[D]. 刘琼. 四川农业大学. 2013
[8]. 猪胸膜肺炎放线杆菌尿素酶的提取及特性研究[D]. 王妮. 山东农业大学. 2007
[9]. 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究[J]. 马艳芳, 刁有祥, 张鑫, 纪巍, 孙法良. 中国农学通报. 2009
[10]. 胸膜肺炎放线杆菌血清1型ApxIA N-端多肽免疫原性的确定及表达该多肽的血清7型重组菌株的构建[D]. 梅岭. 华中农业大学. 2006
标签：生物学论文; 畜牧与动物医学论文; 血清蛋白论文; 肺炎疫苗论文; 胸膜论文; 溶血反应论文; 肺炎表现论文; 肺炎症状论文; 传染病论文; 溶血素论文; 尿素酶论文;