代斌 李强 唐一丁
（成都市龙泉驿区第一人民医院普外二科 四川 成都 610100）
【摘要】 目的：评估血清线粒体DNA（mtDNA）在急性阑尾炎（AA）诊断中的价值。方法：纳入拟诊AA患者164例及健康对照38例，采集外周静脉血，检测白细胞计数（WBC）和C反应蛋白数值（CRP）、血清mtDNA水平。比较确诊AA患者与健康对照及非AA患者上述指标差异，并通过受试者工作曲线（ROC曲线）分析上述各指标诊断AA的效能。结果：AA患者上述指标显著高于健康人和非AA患者（P<0.05）。ROC曲线分析显示，WBC、CRP和mtDNA的曲线下面积分别为0.776、0.884和0.943。mtDNA诊断AA的灵敏度为0.911，特异度为0.926。结论：mtDNA可能参与AA的发生发展过程，诊断效力高于WBC和CRP，可作为诊断AA的辅助指标，未来可能在临床推广。
【关键词】 急性阑尾炎；线粒体DNA；ROC曲线；诊断
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）19-0147-03
急性阑尾炎（acute appendicitis，AA）是普通外科常见急腹症之一，各个年龄段均易感，总体患病率约7%[1]。急性阑尾炎的诊断主要依赖于症状体征和常规临床检查手段，如白细胞计数（WBC）、C反应蛋白和影像学检查（彩超、CT等）[1]。虽然临床有诸多手段可以诊断急性阑尾炎，但上述诊断方法仍不能达到完全准确诊断AA的效果。据文献报道，阑尾切除术中的无炎症阑尾比例高达5～40%；而漏诊AA导致手术时机推延可引起5～30%阑尾穿孔。所以，迫切需要一种新的方法来辅助诊断AA。线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）是一种新发现的内源性致炎因子，其释放入血可引起典型的全身炎症也反应；同时，mtDNA也可以作为有效的指标辅助诊断炎症相关性疾病[2]。本研究拟对拟诊AA患者进行血清mtDNA及常规WBC和血清CRP检测，以评估血清mtDNA在AA诊断中的价值。
1.资料及方法
1.1 临床资料
本研究纳入2013年9月～2015年9月拟诊为AA的入院患者164例，其中男性87例，女性77例；年龄12～70（42.4±30.8）岁。拟诊AA的患者均接受阑尾切除术。根据术中病理结果分组，分别分为B组（非阑尾炎组42例），包括急性右侧附件炎21例，右侧卵巢黄体破裂出血11例，右侧输尿管结石8例，麦克尔憩室2例；C组（急性单纯性阑尾炎69例）；D组（急性化脓性阑尾炎53例）。同时纳入同期体检的健康人38例（A组），男20例，女18例，年龄13～68（39.7±28.9）岁，健康人均排除肝胆、血液系统及免疫系统疾病。
1.2 观察指标及方法
A组健康人于清晨空腹采集外周静脉血；B、C和D组患者与入院当时采集外周静脉血，即时送我院检验科行血常规检测得到WBC数值和检测CRP；同时将采集的血液标本通过1000g/min离心后取上清，即得到血清，-80℃保存，一月内通过实时荧光PCR检测mtDNA水平。
mtDNA检测方法[3]：血清中mtDNA浓度测定使用基于SYBR-Green染色的荧光定量PCR技术分析。人类mtDNA（human NADH dehydrogenase 1 gene）引物上游为：CGAGCAGTAGCCCAAACAAT；下游为：TGTGATAAGGGTGGAGAGGTT。荧光定量PCR检测mtDNA浓度步骤为：初始阶段2分钟，50℃；第一步变性温度为95℃，3分钟；紧接着是95℃10秒钟、55℃15秒钟和72℃ 10秒钟的循环，共39个循环。
标准曲线为携带有人类mtDNA的质粒（SC101172，ORIGENE，USA）十倍梯度稀释获得。mtDNA浓度使用标准的转换系统转换成拷贝数（http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html）。
血清mtDNA浓度的计算公式为：c= Q×VDNA/VPCR ×1/VEXT
其中c代表血清中mtDNA的浓度；Q代表荧光定量PCR检测的样本中mtDNA的拷贝数；VDNA代表每个血清样本中提取DNA的总体积，本实验中为200μl；VPCR代表荧光定量PCR时加入DNA的体积，本实验中为1μl；VEXT代表提取DNA时使用的血清的量，本实验中为50μl。
1.3 统计分析
所有计量资料数据均以均数±标准差(Mean±SD)表示，各组数据比较前行方差齐性检验，如方差齐则进一步行方差分析或t检验，如方差不齐则行变量变换再行方差分析或t检验。采用EpiData3.0软件录入数据，SPSS16.0软件（SPSS 16.0;SPSS Inc., Chicago, IL, USA）分析数据。
2.结果
2.1 各组患者检测指标对比
各组急性阑尾炎患者（C、D组）WBC、血清CRP和mtDNA水平显著高于健康人（A组）和非阑尾炎患者（B组）（P<0.05）；急性化脓性阑尾炎患者（D组）WBC、血清CRP和mtDNA水平显著高于急性单纯性阑尾炎组（C组）（P<0.05）（表1）。
2.2 各指标ROC曲线
对各组患者绘制受试者工作曲线（ROC），比较WBC、CRP和mtDNA对急性阑尾炎患者的诊断效率，结果显示WBC、CRP和mtDNA的曲线下面积分别为0.776、0.884和0.943。mtDNA的临界点为283.0copies/μL，其诊断急性阑尾炎的灵敏度为0.911，特异度为0.926，阳性似然比为12.3，阴性似然比为0.096（表2）。
表1 各组患者WBC计数、CRP及mtDNA测定结果比较
Table 1 The levels of WBC, CRP and mtDNA between different groups
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3. 讨论
急性阑尾炎是临床常见急腹症之一，若诊治不及时，可出现阑尾穿孔、腹膜炎等并发症，严重时可危及患者生命。目前临床尚缺乏特异性辅助检查手段来诊断急性阑尾炎，如何提高阑尾炎诊断的准确率一直是临床医师的难题。随着对阑尾炎发病机制的深入研究，炎症反应在阑尾炎产生和发展中的作用越来越受到关注，针对引起炎症反应的因子也逐渐得到重视。张希儒等[4]通过临床研究发现内源性致炎因子参与急性阑尾炎的发病过程，并对急性阑尾炎的诊断具有一定价值。线粒体DNA同样是体内一种内源性致炎因子，本文就线粒体DNA是否参与急性阑尾炎的发病过程及其诊断急性阑尾炎的效力进行研究。
人类线粒体DNA负责编码电子转移链的13个多肽、22个转运RNA和2个核糖体RNA。由于线粒体在细胞自噬或机械损伤过程中会降解或破坏，导致含有暴露的未甲基化炎性序列（CpG序列）的线粒体DNA 释放进入循环系统，引起机体的炎症反应。已有研究显示线粒体DNA可以作为一种促炎因子引起创伤修复手术后患者炎症反应的发生[5]。这说明线粒体DNA可能参与炎症反应相关疾病的进展过程。从结果来看，本研究首次发现急性阑尾炎患者血清中mtDNA水平显著高于健康人组，说明mtDNA同样参与急性阑尾炎的发生发展过程中。
急性阑尾炎是一种局部或全身性炎症疾病，阑尾炎患者WBC和CRP通常高于正常人，临床常用WBC和CRP来辅助诊断急性阑尾炎。虽然WBC可以辅助诊断急性阑尾炎，但是部分患者基础WBC较低或者机体反应性较差，很多临床阑尾炎患者WBC并不高，所以WBC诊断急性阑尾炎的敏感度较低。CRP是肝脏合成的急性期反应蛋白，可以反映机体的炎症水平，但是CRP可在很多炎症性疾病中升高，并不能特异性反映急性阑尾炎，其诊断特异性较差[6]。因此，单独WBC或者CRP诊断急性阑尾炎的效果并不理想。
最新的研究发现，血清mtDNA参与冠心病的发病过程，并且mtDNA是诊断冠心病的一个有效指标[7]。本研究结果同样发现，mtDNA诊断急性阑尾炎的灵敏度为0.911，特异度为0.926，曲线下面积为0.943，说明mtDNA可用于临床诊断急性阑尾炎。而且通过与WBC和CRP的比较，发现mtDNA诊断急性阑尾炎的曲线下面积高于WBC和CRP，其诊断效力高于WBC和CRP。
从本研究来看，mtDNA参与急性阑尾炎的发生发展过程，其可用于临床诊断急性阑尾炎，且诊断效力高于WBC和CRP，所以笔者认为血清mtDNA可作为诊断急性阑尾炎的辅助指标，未来可能在临床推广。
【参考文献】
[1] Bhangu A,Soreide K,Di Saverio S,et al.Acute appendicitis: modern understanding of pathogenesis, diagnosis, and management[J]. Lancet,2015,386(10000):1278-87.
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论文作者:代斌,李强,唐一丁
论文发表刊物:《医药前沿》2016年7月第19期
论文发表时间:2016/7/25
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