湖南省株洲市中心医院心血管内科 湖南株洲 331728
【摘 要】目的 探讨ACE2 基因多态性分布情况，并分析其与冠心病易感性的关系。方法 从受试者外周血液中抽取 DNA 进行实时定量聚合酶连锁反应（Quantitative real-time PCR），分析 ACE2 基因于 rs2285666、rs4646142、rs2106809 及 rs4240157四个位点的单一核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism），并比较冠状动脉心脏病组和对照组二组间基因型的差异。因 ACE2 基因位于 X 染色体上，故分析结果需将男女分开探讨。结果 本研究共收纳了 379 位冠状动脉心脏病组（冠心病组）和 205位对照组共 584 位受试者，统计分析发现二组在 ACE2 基因四个位点的基因多态性的分布上，不论男女，均没有显著差异。仅可见在女性rs2285666 的 T/T 型、rs4646142 的 G/G 型及 rs2106809的 A/A 型分布倾向于对照组，但均无达到统计意义。结论 ACE2 基因上 rs2285666、rs4646142、rs2106809 及rs4240157 的单一核苷酸多态性，并不影响冠状动脉心脏病的易感性，这可能与人群差异、样本数或是样本选择偏差有关。ACE2 基因多态性与冠状动脉心脏病的关系需要更多的研究与探讨。
【关键词】血管紧张素转换酶2；肾素-血管张力素系统；单一核苷酸多态性；冠状动脉心脏病
根据国际卫生组织（WHO）的定义，冠状动脉心脏病（coronary artery disease or coronary heart disease，以下简称冠心病）是指供应心肌细胞营养与氧气的血管部分或完全阻塞，导致心肌细胞失去功能的一种疾病[1]，造成血管阻塞最常见的因素为动脉粥状硬化（atherosclerosis），其他尚有血管栓塞、血管痉挛、血管剥离等原因。冠心病最主要的原因为粥样动脉硬化（atherosclerosis），粥样动脉硬化的形成包括一连串的步骤：低密度脂蛋白（LDL）堆积并氧化、单核球与 T 细胞的趋化、泡沫细胞（Foam cell）的形成、平滑肌细胞的移行与增生等，继而形成动脉硬化斑块，这过程牵涉到许多细胞黏附因子（如 VCAM-1、ICAM-I）、细胞激素（如 IL-1、IL-6）及趋化因子（如 MCP-1、IL-8）[2]，可视为一个慢性的发炎反应。而血管紧张素II在这个发炎反应中扮演重要角 [3]。
肾素-血管张力素系统（Renin-angiotensin system，RAS）在心血管疾病扮演重要的角色[4，5]。RAS系统里，血管张力素转换酶（Angiotensin-converting enzyme，ACE）将血管张力素I（angiotensin I）转换成血管张力素II（angiotensin II），其会和血管张力素第一型受器（angiotensin type 1 receptor，AT1R）结合，继而造成下游一系列的反应，如血管收缩、钠水滞留、细胞增生及细胞外基质堆积、引发发炎反应，而导致高血压、心脏衰竭、心肌梗塞及中风等疾病。因此，用药物（ACE inhibitor或angiotensin II receptor blocker）阻断RAS系统的活性，能治疗高血压、改善心脏梗塞及心衰竭病人的预后[6-9]。
若 ACE2 活性和心血管疾病有相关性，则影响 ACE2 活性的内在因素是否与心血管疾病相关联就令人关注。ACE2 基因的变异则是影响 ACE2 活性的重要内在因素。单一核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms；SNPs）又占了基因变异中的大多数。本研究探讨血管紧张素转换酶2基因多态性（于rs2285666，rs4646142，rs2106809 及 rs4240157四个位点）的分布情况，并分析其是否与冠状动脉心脏病之易感性有关联。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象
本研究利用自 2015 年自 2016年，于我院接受选择性心导管检查（elective coronary angiography）的 584 位病患血液标本做为研究来源，这些受试者皆是先接受非侵入性检查（包括运动心电图、核医心肌灌注扫描及冠状动脉计算机断层扫描）并有阳性结果。本研究中冠状动脉心脏病的定义为心导管检查显示在冠状动脉主干或主要分支的任何一段有超过 50%以上的狭窄。受试者中共有 395位男性，189位女性。所有受试者均有记录基本的身高、体重及根据病历数据纪录冠状动脉心脏病的传统危险因子如高血压、高血脂等等。
1.2 测量方法与标本分析
1.2.1 心导管测量冠状动脉心脏病严重度
本研究的受试者皆接受心导管检查，患者血管狭窄程度是以机器软件测量（Quantitative coronary angiography）。有冠状动脉心脏病的定义为冠状动脉主干或主要分支的任何一段有超过 50%以上的狭窄。
1.2.2 DNA萃取
利用受试者的静脉血液进行 DNA 萃取。本研究使用 QIAamp DNA blood mini kits（Qiagen，Valencia，CA，USA）。首先，将 DNA 标本溶解于 TE 缓冲剂[10 mM Tris（pH 7.8），1mM EDTA]，然后使用QD 260 测量定量，贮存于-20℃下，并当作聚合酶连锁反应的模板。
1.2.3 ACE2基因多态性的选择
根据前述 ACE2 基因与冠心病相关研究，我们选出四个 ACE2 的SNPs，分别是 rs2285666、rs4646142、rs2106809 及 rs4240157，四个位于 ACE2 基因的内含子区域。
1.2.3 实时定量聚合酶连锁反应
利用 ABI StepOne TM Real-Time PCR 系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）以及 SDS version 3.0 software（Applied Biosystems）与 TaqMan Assay 进行 ACE2 gene rs2285666、rs4646142、rs2106809 及 rs4240157基因单一核苷酸多态性分析。即时定量聚合酶连锁反应（real-time PCR）其主要原理是将设计好带有荧光探针的两股引子，利用 DNA 模板上基因序列的差异会与不同的引子结合，当引子与 DNA 模板结合后便会释放出相对应的荧光，利用侦测荧光的强度便可以判断 DNA 模板上基因序列的差异。反应最终体积为 10μL，含有 5μL 的 TaqMan Genotyping Master Mix，0.25μLTaqMan probe mix，及 10ng genomic DNA。整组反应条件为 95℃10分钟、95℃ 15 秒与 60℃ 1分钟共 循环 40次。
1.3 统计方法
本研究所使用的统计方法，在冠心病组和对照组的临床特征比较，若是连续性变项（年龄、身高、体重等）以独立样本 t检验（independent two-sample t-test）分析；若是类别变项（性别，糖尿病，高血压、吸烟等）则以卡方检验（chi-square test）或 Fisher exact test 检验。P 值<0.05为统计学上显著。二组间各基因型的分布则利用逻辑式回归（logistic regression）来分析其 95％信赖区间的胜算比（odds ratios，ORs）。P值<0.05为统计学上显著。以上数据以 SAS 统计软件（SAS Institite Inc.，Cary，NC，USA）做分析。
2 结果
2.1 受试者特征的分布频率
本研究共收纳了 395 位男性，189位女性。冠心病组有 379人，对照组有 205人。冠心病组和对照组在年龄（66.57±12.25 年 对照65.60±11.17年，p=0.331）、身高（160.6±8.63公分对照 161.83±8.45 公分，p=0.100）和体重（65.07±12.89公斤对照 67.18±12.62公斤，p=0.056）分布上没有差异。但冠心病组的男性比例明显较多（72.8%对照 58.0%，p<0.001）。
而二组在冠心病的传统危险因子的比较上，冠心病组有高血压的比例较高（73.4%对照 63.4%，p=0.013）；吸烟比例较高（43.5% vs34.1%，p=0.027）；有三项冠心病危险因子以上（CAD risk≧3）的比例较高（58.6 % 对照 46.8%，p=0.007）。而家族史、糖尿病及高血脂的分布二组没有显著差异。
对照组有心房颤动（25.9%对照 10.0%，p<0.001）及心衰竭（32.7%的对照 21.6%，p=0.003）比例明显较高。这可能是因为心房颤动及心衰竭本身就有可能造成压力测试（运动心电图及心肌灌注扫描）出现伪阳性。
另外，在冠心病组有较高的比例有急性冠心症的表现：24小时内有严重心绞痛（recent severe angina）及心肌酶的上升（cardiac markers elevation）的比例明显较高，分别是 73.7%对照 59.5%（p=0.001）及 57.0%对照 36.6%（p<0.001）。
2.2 ACE2 基因多态性在冠心病组与对照组的基因分布频率（男性）
因为 ACE2 基因位于 X 染色体上，男性不会出现异性合子（heterozygote）的情况，故分析基因多态性时需将男女分开探讨。
表 2显示 ACE2 基因上四个位点于二组男性病患的基因型分布频率。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆在详细的基因分布中，可发现 ACE2 rs2285666、rs4646142、rs2106809 及 rs4240157 这四个位点的基因型在冠心病组与对照组之间并无统计学上的差异。其中 rs4240157的 G 型在冠心病组的人数明显比对照组多（9人对照 1人），但因 G 型的人数太少，故无法达到统计学上的差异。
2.3 ACE2 基因多态性在冠心病组与对照组的基因分布频率（女性）
表3显示 ACE2 基因上四个位点于二组女性病患的基因型分布频率。在 rs2285666、rs4646142 及 rs2106809这三个位点，均是异型合子（heterozygote）主要基因型，分别是 C/T 型、C/G 型及 G/A 型。而 rs4240157则以 A/A 型为主要基因型（二组均为 100 ％），在此位点没有发现单一核苷酸多态性。
如同男性，ACE2 rs2285666、rs4646142、rs2106809 及rs4240157 这四个位点的基因型在冠心病组与对照组之间并无统计学上的差异。仅可见 rs2285666的 T/T 型、rs4646142的 G/G 型及rs2106809 的 A/A 型分布倾向于对照组，但均无达到统计意义（odd ratio 分别为 0.601，p=0.222；0.617，p=0.237；0.613，p=0.410）。
3 讨论
本研究为单一医学中心的横断式观察型研究。我们试图了解四川汉族在血管紧张素转换酶2（ACE2）基因特定位置上所发生的单一核苷酸多态性，并进一步分析这些基因多态性对于冠状动脉心脏病易感性的影响。期许这些研究结果可以帮助厘清疾病机转，进一步运用在临床医学上，促进医学的进步。
因血管紧张素转换酶2在肾素-血管张力素系统内的角色，目前临床研究聚焦于其基因多态性与心血管疾病的相关性。较多的文章是探讨其与高血压的相关[10]。
因 ACE2 基因位于 X 染色体上，故需将男女分开探讨。在男性的结果分析中可以发现所选四个位点的单一核苷酸多态性并不影响冠心病的发生率。Zhao Qet al. [11]的研究分析了三个位点（rs2285666、rs4646142、rs1978124），其中二个和本研究相同，男性群族的分析结果显示此三位点的多态性在冠心病组和对照组无显著差异，只有在次人群分析发现不喝酒的男性 GGC haplotype 有较高的冠心病风险，在我们的研究中并无统计饮酒与否。在 Chen Y Y，et al.[12]的研究中分析 rs2285666此位点，在主要分析也显示此处的SNP 在冠心病组和对照组并无关联。Kruit A et al. [13]的研究分析rs2285666 的 SNP和心血管事件（包含冠心病及中风）的相关性，同样的，在男性也看不到二者的关联性。
本研究女性人群的分析结果同样显示此四个位点的 SNP并不影响冠心病的易感性。仅可见 rs2285666 的 T/T 型、rs4646142 的 G/G型及 rs2106809 的 A/A 型分布倾向于对照组，但均无达到统计意义。在 Zhao Q et al.[11] 的研究中，rs4646142 的 G/G 型有较高的心肌梗塞风险（有达到统计意义）；而 rs2285666 的 T/T 型有增加心肌梗塞的倾向（p=0.058），特别的是这二个位点的结果都和本研究相反。在Chen Y Y，et al.[12] 的研究中，女性的 rs2285666多态性和冠心病无相关性。而在 Kruit A et al.[13]的研究，女性的 rs2285666 A allele 可减少致命性中风及冠心病（fetal stroke and myocardial infarction）的事件（p=0.04）。
目前探讨 ACE2 基因多态性与冠心病相关性的文献较少，且可能因研究样本数目、种族或分析的基因位点不同，并没有一致的结论，有许多具统计意义的数据也只出现在亚群分析（subgroup analysis）。本研究所分析的四个位点，不论男女均无得到与冠心病有统计学上之意义，可能因素分析如下：
一、本研究所选四个位点的基因多态性不影响 ACE2 的表现：既往研究发现冠状动脉绕道术后一小时的 ACE2水平和术后心肌梗塞率有关，但 也发现 ACE2 rs2285666、rs4646142、rs1978124这三个位点的 SNPs 和血中 ACE2 水平并无显着相关。但目前探讨 ACE2 基因多态性与血中 ACE2 活性相关性的研究很少，需更多的研究探讨。
二、ACE2 的表现和冠心病的相关性：根据基础研究，已知ACE2 在肾素-血管张力素系统内的角色，有血管扩张、抗纤维化、抗细胞增生及减少发炎介质等具心血管保护的作用。但这些机转是否最后能抑制或减缓动脉粥样硬化的形成则不清楚，因为动脉粥样硬化有许多其他的危险因子，如高血压、糖尿病、高血脂及吸烟等等，ACE2 的重要性可能被这些危险因子所稀释。另外，虽然研究显示血中 ACE2 的浓度与心血管疾病的关联性，但无法确定 ACE2 浓度的变化是心血管疾病的因抑或是果。
三、样本选择的偏差：本研究的样本来自接受过冠状动脉摄影的患者，再依冠状动脉摄影的结果分为冠心病组及对照组，因为全部的患者都有至少一项的非侵入检查（运动心电图、核医心肌灌注扫描及冠状动脉计算机断层扫描）阳性结果，因此对照组可能无法完全等同于无冠心病人群。
四、对照组的心房颤动及心衰竭明显较多，有研究发现，ACE2 基因多态性（rs2106809）可能增加心房颤动的风险，因此，可猜测冠心病以外的心脏疾病也和 ACE2 基因多态性有关。对照组可能因为有较高比例的其他心脏疾病（冠心病除外），抵消了二组间基因分布的差异。
五、冠状动脉摄影的限制：以冠状动脉摄影方式测量主要冠状动脉的狭窄程度，是以 2 维（2D）的方式测量，若病灶是离心性的，可能就会低估病灶严重度，而影响分组。
六、样本数：因 ACE2 基因位于 X 染色体 上，在分析上必须男女分开统计，这使得样本数减少（男女分别为 395 人及 189 人），可能使统计结果无法看出显著差异，尤以女性为甚。
总的来说，目前只有少数研究探讨 ACE2 基因多态性与冠心病的关联性，而本研究结果显示 rs2285666、rs4646142、rs2106809及rs4240157 这四个位点的 SNP 与冠心病的易感性无相关。推究其原因，可能是 ACE2 基因表现本身就和冠心病易感性无关，或是本研究在样本选择上的偏差所造成。
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论文作者:欧阳繁,杨礼,刘卫清
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年5期
论文发表时间:2018/9/20
标签：冠心病论文; 多态性论文; 基因论文; 冠状动脉论文; 血管论文; 对照组论文; 位点论文; 《兰大学报（医学版）》2018年5期论文;