徐高原[1]2005年在《猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究》文中认为乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)和伪狂犬病(Pseudorabies)均是危害养猪业的重大疫病,主要引起种猪繁殖障碍,给养猪业造成了巨大的经济损失。同时乙型脑炎还是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,对人类危害巨大。猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主和传染源,因此控制猪的乙型脑炎不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。目前免疫接种仍是预防和控制这两种传染病最有效的措施,而现有乙型脑炎疫苗,无论是灭活疫苗还是弱毒活疫苗都存在一定的缺陷。鉴于此,本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1;实现了E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达;构建了表达乙型脑炎病毒主要免疫原性基因E或NS1的重组伪狂犬病病毒,并对所构建的重组伪狂犬病病毒的生物学特性、安全性及免疫原进行了研究。其具体研究内容包括: 1.乙型脑炎病毒E和E-NS1基因的克隆与序列分析 根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列,设计了2对引物,采用一步法RT-PCR扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1,并进行了克隆与序列测定。结果发现,与已报道的SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较,E基因的同源性为100%,E-NS1基因片段发生了3个核苷酸的改变,即1596 g-a、2639 t-c、2817 g-a,并导致了2个氨基酸的改变,即E207 G-R,NS114 G-S,而2639 t-c为无义突变。 2.E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达 将E基因RT-PCR产物克隆到pBlusecriptⅡSK(+)载体中,然后分别亚克隆到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体pcDNA3.1+中,筛选重组质粒,分别命名为pKG-E和pcDNA3.1E。pKG-E转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为83KD,主要以包涵体形式存在,Western blot分析证实表达产物具有良好的生物学活性。pcDNA3.1E采用脂质体法转染BHK-21细胞,48小时后收集转染的细胞处理后,进行SDS-PAGE电泳,经Western blot分析,在53KD处出现特异性反应带,而对照未出现特异性反应带,证实E基因在哺乳动物细胞中获得表达。 3.表达乙型脑炎病毒E或NSl蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 设计1对引物从质粒pTNSl上扩增NSl基因,双酶切后将NSl基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体pgG-Uni中,得到重组转移载体pgG-NSl:用BamHl和EcoRI酶切pSK-E,回收E基因后与经相同酶切的载体pgG-Uni相连,得到重组转移载体pgG-E。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK~-/gG~-/LacZ~+突变株基因组DNA共转染PK-15细胞,经空斑筛选纯化、PCR、Southern印迹、Western blot等鉴定,获得了2株纯化的重组病毒,分别命名为TK~-/gG~-/NS1~+和TK~-/gG~-/E~+。重组病毒部分生物学特性研究表明:本研究构建的2株重组病毒遗传稳定性良好:外源基因的插入不影响伪狂犬病病毒在细胞
李自力[2]2004年在《猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究》文中认为乙型脑炎病毒和伪狂犬病病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一，给养猪业造成了巨大的经济损失，同时乙型脑炎是一种人畜共患病，猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主，因此控制猪的乙型脑炎具有十分重要的意义。而预防和控制这两种传染病最有效的措施就是免疫接种。目前尚无商品化的猪用乙型脑炎疫苗，主要采用人用的两种乙型脑炎疫苗，而这些常规疫苗都存在一定的缺点。鉴于此，本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因PrM、PrM-E和NS1，构建了叁株表达猪乙型脑炎病毒主要免疫原性基因的重组伪狂犬病病毒，即TK~-／gG~-／PrM~+、TK~-／gG~-／PrM-E~+和TK~-／gG~-／PrM-E-NS1~+，在此基础上研制了猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗，并进行了动物试验。主要研究工作和结果如下： 1．乙型脑炎病毒PrM-E基因的克隆、测序与序列分析 根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列，设计了一对引物，以RT-PCR方法扩增了其主要免疫原性基因PrM-E，并克隆至pMD18-T载体中，命名为pTPrM-E，序列测定结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较，PrM的同源性均为100％，与SA14-14-2疫苗株比较，E基因发生了4个核苷酸的改变，即2181a-g，2317a-g，2441a-t，2443g-a，其中2317a-g为回复突变，共导致了3个氨基酸的改变，即E402 T-A，E447 D-G(为回复突变)和E489 G-D，而E488为无义突变，但未发生与毒力相关位点的突变。 2．乙型脑炎病毒主要免疫原性基因重组伪狂犬病病毒的构建 采用3对引物(各引入一个酶切位点)分别从pTPrM-E和pTNS1扩增PrM、PrM-E和NS1基因，双酶切后分别将PrM、PrM-E和PrM-E-NS1基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体PgG-uni中，分别得到叁个重组转移载体，命名为PgG-PrM、PgG-PrM-E、PgG-PrM-E-NS1。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK~-／gG~-／LacZ~+突变株基因组DNA共转染PK-15细胞，形成病变的转染物经空斑筛选纯化，PCR扩增和Southern印迹等鉴定，获得了叁株纯化的重组病毒，分别命名为TK~-／gG~-／PrM~+、TK~-／gG~-／PrM-E~+和TK~-／gG~-／PrM-E-NS1~+。重组病毒在IBRS-2、PK-15和CEF细胞上增殖滴度依次降低，Western印迹表明JEV PrM、E和NS1基因在重组病毒中均获得了表达。表达的蛋白质大小分别为19KD、53KD和46KD。重组病毒与载体病毒在IBRS-2细胞上的增殖比较试验表明外源基因的插入不影响重组伪狂犬病病毒在细胞上的增殖滴度。 3．叁株重组伪狂犬病病毒的免疫原性研究 利用已构建的叁株重组病毒在鸡胚成纤维细胞上培养增殖后制备成冻干的猪乙华中农业大学博十学位论文型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗。动物实验表明,其对小鼠和猪是安全的,而且免疫的Balb/c小鼠和断奶仔猪均产生了针对PRV和JEV的特异性免疫应答。重组病毒TK,/gG’用rM一E+和TK一G护rM一E一Nsl+产生的JEV抗体和特异性cTL活性基本一致,均略低于JEv弱毒疫苗株,而TK一/gG护rM+产生的特异性免疫应答稍差些。统计分析表明所有重组病毒产生的CTL活性与阴性对照相比,差异极显着(P< 0.01)。叁株重组病毒和载体病毒免疫猪在首免后8周所产生的PRV抗体水平差异不显着印>0 .05)。结果表明重组病毒TK’/gG一用rM一E+和TK一/gG护rM一E一NSI+可以作为预防猪乙型脑炎和伪狂犬病的二价基因工程疫苗。关键词:乙型脑炎病毒:伪狂犬病病毒;基因克隆;重组病毒载体疫苗
何永龙[3]2010年在《猪伪狂犬病、细小病毒病和乙型脑炎叁联灭活疫苗的研制》文中研究表明病毒性传染病是诱发母猪繁殖障碍性疾病的主要因素之一,其中猪伪狂犬病、细小病毒病和乙型脑炎等均可导致妊娠母猪流产,产死胎、木乃伊胎,本研究旨在从生产实际出发,探讨制备一种针对这叁种猪繁殖障碍性疾病的多联灭活疫苗,拟达到简化免疫程序、降低免疫成本、减小免疫刺激,起到一针防多病的临床应用效果。疫苗的研制及检验结果如下：1.叁联灭活疫苗的制备通过在传代细胞上接毒,收获TCID50为10-6.5/0.1mL的猪伪狂犬病毒液8000mL,HA为29细小病毒液8000mL,将病毒液灭活后分别通过透析和超滤这两种不同的方法进行浓缩,再与稀释过的乙型脑炎病毒液等体积混合,将混合后的病毒液与一定比例的佐剂混匀,通过组织捣碎机和胶体磨两种不同的乳化设备进行乳化,共试制了猪伪狂犬病、细小病毒病和乙型脑炎叁联油乳剂灭活疫苗2个批次,一个批次为1000mL,另一个为3000mL。2.叁联灭活疫苗的检验对试制疫苗进行物理性状及细菌检验均符合疫苗检验要求。将试制疫苗接种妊娠母猪、后备母猪及Balb/C小鼠,接种后试验动物采食生长正常,无异常反应,妊娠母猪无流产、产死胎和木乃伊胎的记录。将试制叁联灭活疫苗进行Balb/C小鼠的免疫与效力保护性试验,小鼠在二免后21d,PRV平均中和抗体指数达到1:28.5,用105.0TCID50的猪伪狂犬强毒足垫部位攻击小鼠,疫苗对小鼠保护率达到90%；用试制叁联灭活疫苗进行KM小白鼠的免疫与效力保护性试验,二次免疫后21d用105.84PFU的P3株强毒对小鼠进行腹腔攻毒,疫苗对小鼠的保护率达到80%；用试制的叁联灭活疫苗免疫豚鼠,二次免疫后10周,豚鼠的PPV HI抗体水平仍然维持在1：210以上。3.叁联灭活疫苗对猪的免疫原性试验将试制叁联灭活疫苗免疫6月龄的后备母猪发现,产生的猪伪狂犬病毒ELISA抗体平均水平和猪伪狂犬病毒单价灭活疫苗所产生的抗体水平相当；叁联灭活疫苗产生的细小病毒HI抗体水平要高于猪细小病毒灭活疫苗；猪乙型脑炎病毒的ELISA抗体水平低于猪乙型脑炎弱毒疫苗。
李伟豪[4]2013年在《猪乙型脑炎—猪圆环病毒病二联灭活疫苗的研究》文中进行了进一步梳理猪乙型脑炎和猪圆环病毒病是危害养猪业的重要传染性疾病，而且乙型脑炎还严重危害人类身体健康。目前还没有特效药治疗这两种疾病，疫苗预防是控制这两种疾病的有效手段。为了有效预防这两种疾病，本研究对本实验室分离鉴定的乙型脑炎病毒LS株在Vero细胞上的培养特性和免疫原性等进行了研究，并利用乙型脑炎病毒LS株和本实验室分离鉴定的猪圆环病毒2型HNYY株研制了猪乙型脑炎-猪圆环病毒病二联油乳剂灭活苗。具体研究结果如下：1.乙型脑炎病毒LS株的理化特性及其在Vero细胞上的增殖动态研究对乙型脑炎LS株的理化特性及其在Vero细胞上的增殖规律进行研究。将乙型脑炎病毒LS株以106.2TCID50的接种量接种在100mL细胞瓶铺满单层的Vero细胞，在病毒接种后每隔8h收集细胞上清液和混悬液并测定病毒效价。结果显示，病毒理化特性研究发现乙型脑炎病毒LS株对乙醚、胰蛋白酶、热（56℃）、酸（pH5）敏感，反复冻融，对病毒活力影响轻微；在接种后56h细胞上清液和混悬液的病毒效价达到高峰，分别为106.0TCID50/0.1mL、106.5TCID50/0.1mL。2.乙型脑炎病毒罗山株的免疫原性研究将乙型脑炎病毒LS株接种Vero细胞增殖，收获的病毒液经甲醛灭活后，以矿物油为佐剂制备出油乳剂灭活苗。将疫苗免疫小鼠和猪，分别免疫2次，间隔2周，免疫后采集血清，检测血清中抗乙型脑炎病毒抗体水平。结果显示：试制疫苗免疫小鼠能够诱导产生平均1:64的乙型脑炎乳胶凝集试验（LAT）抗体，免疫猪能够诱导猪产生平均1:200的乙型脑炎血凝抑制（HI）抗体，抗体水平比市售猪乙型脑炎灭活疫苗高。证明了乙型脑炎病毒LS株具有良好的免疫原性。3.猪乙型脑炎-猪圆环病毒病二联灭活疫苗的研究利用本实验分离鉴定的乙型脑炎病毒LS株和猪圆环病毒2型HNYY株分别在Vero细胞和PK-15细胞上增殖出较高效价的病毒液，然后通过浓缩，甲醛灭活，等量混合，加入油佐剂乳化，制备出猪乙型脑炎-猪圆环病毒病二联油乳剂灭活疫苗。并对疫苗进行了物理性状检验、无菌检验、安全性检验和小鼠免疫试验。结果显示试制二联苗剂型稳定，对小鼠安全可靠，免疫后能够诱导小鼠产生相应的两种抗体，抗乙型脑炎病毒乳胶凝集抗体平均高达1:37.33，抗猪圆环病毒2型ELISA抗体平均高达1:3200，抗体水平与相应单苗相当。证明两种抗原之间没有相互干扰作用，相互间不影响彼此在动物体内的免疫应答。
朱秀高[5]2012年在《国内猪传染性乙型脑炎的检测及预防》文中研究表明传染性乙型脑炎又称日本乙型脑炎(JE),是一种人畜共患性传染病,具有猪-蚊-人的传播特性,由于疫苗的大范围应用,近年来发生率大幅下降。但因为猪和蚊虫的储存与传播作用,导致该病并不能完全消灭。调查发现,人群中该病的发生通常要较猪群
黄刚[6]2010年在《PPV-JEV二联灭活苗和PPV-PRV二联灭活苗的研制》文中认为猪细小病毒、伪狂犬病毒和乙脑病毒均是引起母猪繁殖障碍的主要病原,为了有效预防这叁种疾病,本研究首先利用本实验室分离鉴定的猪细小病毒WH-1株和伪狂犬病毒鄂A株,研制了用于预防猪细小病毒病和伪狂犬病的二联油乳剂灭活疫苗,同时利用湖北农业科学院提供的乙脑病毒WH-1株病毒液,制备了猪细小病毒和乙脑病毒二联油乳剂灭活疫苗。具体研究结果如下：1.猪细小病毒-伪狂犬病毒二联油乳剂灭活疫苗的研制利用透析袋浓缩法制备了高滴度的猪细小病毒病毒液和伪狂犬病毒病毒液作为制苗用抗原,收集病毒液进行甲醛灭活,将两种灭活的病毒液等体积混合,加入油乳剂乳化制成猪细小病毒-伪狂犬病毒二联灭活疫苗。在进行了疫苗的物理性状检验和无菌检验后,进行了安全性试验和免疫试验,结果证实该疫苗对实验动物及本动物均安全可靠,免疫猪后产生了相应的两种抗体,抗体水平和猪细小病毒灭活疫苗和猪流行性乙型脑炎弱毒疫苗相当。2.猪细小病毒-乙脑病毒二联油乳剂灭活疫苗的研制将制备的浓缩细小病毒液和湖北农科院提供的高滴度乙脑病毒液按体积比3：1和1：1两种配比方式混合,然后乳化制得了两种猪细小病毒-乙脑病毒二联油乳剂灭活苗。在进行了疫苗的物理性状检验和无菌检验后,开展了安全性试验和免疫试验,结果表明该疫苗对实验动物及本动物均安全可靠,免疫猪后可以诱导产生高水平的抗体,细小病毒HI抗体最高可达1：10240,乙脑ELISA抗体滴度最高可达1：40960。猪细小病毒-乙脑病毒二联油乳剂灭活苗免疫猪产生的抗体整体上和各自单苗诱导产生的抗体水平相当。本研究为猪细小病毒病和伪狂犬病的联合免疫提供了可能,也为猪细小病毒病和乙脑的联合防疫提供了可能,而且试验证实本研究制备的二联苗免疫猪后可以诱导和单苗相同滴度的抗体水平,而且能够达到减化免疫程序、减少因免疫接种而带来的应激,能达到一针防多病的目的,满足了规模化养猪的迫切需求。
王林青, 郑兰兰, 李坤, 陈红英, 李文增[7]2014年在《猪伪狂犬病病毒载体重组疫苗研究进展》文中研究表明猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)又名猪疱疹病毒I型(Suid herpesvirus type I),属于疱疹病毒科(Herpesviridae)甲亚科(Alphaerpesvirinae)水痘病毒属(Varicellovirus),为线状双股DNA病毒,全长约150 kb,含有77个读码框,平均G+C含量高达73.6%。PRV由独特的长区段(UL)和短区段(US)及位于US两侧的末端重复序列(TR)和内部重复序列(IR)所组成,即形成了UL-IR-US-IR结构。
李自力, 陈焕春, 徐高原, 方六荣, 肖少波[8]2007年在《表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建》文中指出本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转移载体pPgG-PrM,并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明:与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较,PrM基因的同源性为100%。以伪狂犬病病毒Ea株TK-/gG-/LacZ+突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/PrM+,为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。
孔嫄嫄[9]2012年在《猪乙型脑炎病毒的克隆纯化及其免疫原性研究》文中进行了进一步梳理猪流行性乙型脑炎(Epidemic encephalitis B)简称猪乙脑,是由乙型脑炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。猪群对乙型脑炎的感染非常普遍,也是乙型脑炎病毒的重要贮存宿主与增殖宿主,是乙型脑炎的主要传染源。怀孕母猪主要表现为高热、流产、死胎、木乃伊胎,公猪表现为睾丸炎甚至不育,可给养猪业的发展造成了严重经济损失。本研究是对四川分离的乙型脑炎病毒株进行克隆纯化和生物学特性和免疫学特性研究,以筛选出一株免疫原性好的候备制苗株。1.乙型脑炎病毒的克隆纯化对乙型脑炎病毒株进行细胞培养、挑斑纯化,得到具有稳定蚀斑性状的两个病毒株,分别为CZ-1和NJ1-1.CZ1-1株于72h形成2-3mm蚀斑,NJ1-1株于48h形成1-2mm的蚀斑,经RT-PCR鉴定,扩增出JEV的高保守区PrM/E基因。各毒株对BHK-21的细胞的适应性好,致病变能力强且稳定,细胞毒价(TCID50) CZ1-1为10-6.52/O.1mL,NJ1-1为10-6.90/0.1mL。各毒株对小鼠的适应性良好,致病力较强,小鼠毒价(LD50)CZ1-1为10-8.55/0.03mL,NJ1-1为10-7.56/0.03mL。2.乙型脑炎疫苗的免疫原性研究用CZ1-1和NJ1-1毒株分别制备灭活疫苗,病毒含量为7.01gLD50,并对其进行物理性状检验、无菌检验、灭活检验、安全检验及效力检验。结果表明该疫苗无菌、安全。对小鼠腹腔免疫两次,间隔7d。一免后14d用两病毒株对免疫组小鼠进行脑内攻毒和腹腔攻毒,检测免疫保护力。结果分别为：CZ1-1毒株脑内攻毒后的保护率为70%、60%,NJ1-1脑内攻毒后的保护率为70%、50%,CZl-1株腹腔攻击后的保护率为80%、70%,NJ1-1腹腔攻击的保护率为100%、90%。达到或优于商品化灭活疫苗的水平。于一免后7d、14d、21d、28d采血,用微量血清中和实验检测中和抗体,在28d时CZ1-1效价为1:138,NJ1-1效价为1:96,相对而言,CZl-1可作为乙型脑炎的候备制苗毒株。
参考文献：
[1]. 猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D]. 徐高原. 华中农业大学. 2005
[2]. 猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D]. 李自力. 华中农业大学. 2004
[3]. 猪伪狂犬病、细小病毒病和乙型脑炎叁联灭活疫苗的研制[D]. 何永龙. 华中农业大学. 2010
[4]. 猪乙型脑炎—猪圆环病毒病二联灭活疫苗的研究[D]. 李伟豪. 河南农业大学. 2013
[5]. 国内猪传染性乙型脑炎的检测及预防[J]. 朱秀高. 养猪. 2012
[6]. PPV-JEV二联灭活苗和PPV-PRV二联灭活苗的研制[D]. 黄刚. 华中农业大学. 2010
[7]. 猪伪狂犬病病毒载体重组疫苗研究进展[J]. 王林青, 郑兰兰, 李坤, 陈红英, 李文增. 中国预防兽医学报. 2014
[8]. 表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建[J]. 李自力, 陈焕春, 徐高原, 方六荣, 肖少波. 畜牧兽医学报. 2007
[9]. 猪乙型脑炎病毒的克隆纯化及其免疫原性研究[D]. 孔嫄嫄. 四川农业大学. 2012
标签：畜牧与动物医学论文; 狂犬病论文; 灭活疫苗论文; 猪伪狂犬病论文; 抗原抗体论文; 传染病论文; 细胞免疫论文;