张茜[1]1998年在《内皮损伤时血管平滑肌细胞中凝血酶受体的表达及反义凝血酶受体基因的抑制效应》文中指出介入治疗后再狭窄的发生严重限制了该治疗手段的应用，探讨再狭窄的发生机理、寻找有效的预防手段以提高介入治疗技术的最终疗效，一直是国际上心血管病专家们注视和研究的焦点。 凝血酶作为一种重要的血管活性物质，多年来一直以其凝血作用而受到关注。但近年来随着生物新技术的应用，对其功能的认识有进一步扩展，也有越来越多的证据显示，凝血酶与再狭窄的形成关系密切，它能：①促进血管壁损伤处的血液凝集和血栓形成；②促进血管壁细胞成分的增殖和迁移；③促进血管壁非细胞成分的累积；④促进血管内膜合成和释放炎症反应因子，调节血浆中白细胞及血管壁组成细胞的炎症反应。由此可见，抑制凝血酶的功能可望预防再狭窄的发生。由于凝血酶的许多功能均由凝血酶受体(TR)介导，因此，本研究以抑制TR的合成为基础进行了以下研究： 1．采用超大球囊(1．1-1．3倍直径于血管内径)损伤及高胆固醇饲喂的方法建立了小型猪主动脉内皮损伤模型，经病理切片及血脂分析发现，术后4周血脂显著升高，主动脉内皮层增厚，且凝血酶受体的表达升高；由在体损伤的血管培养的主动脉平滑肌细胞(ASMC)，在血清作用下的增殖明显加快，而Western Blot显示其TR的蛋白表达亦明显升高。 2．利用重组DNA技术构建了含有部分反义凝血酶受体(ATR)cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3／ATR，并将其导入培养的人ASMC中，发现pcDNA3／ATR的瞬时转染即能显著抑制人ASMC的增殖，且该作用与导人的DNA量呈剂量依赖性，而pcDNA3／ATR对猪ASMC的作用则不明显。 3．利用G418的药物选择作用，筛选出含有ATR基因的猪ASMC，发现ATR的稳定表达能从mRNA及蛋白水平抑制TR的合成。 4．稳定表达ATR的猪ASMC在血清及凝血酶共同作用下，其PDGF-A链及bFGF的表达明显降低，而胞内cAMP含量却高于对照组，说明ATR的表达能抑制血清与凝血酶共同刺激的细胞内信息传递，从而抑制了ASMC的
钱传云[2]2006年在《灯盏花素抑制血管平滑肌细胞增殖的分子基础研究》文中研究表明目的：研究反义凝血酶受体寡核苷酸(Antisense Thrombin Receptor Oligo-deoxy-nucleotides，Antisense TR ODNs)及灯盏花素在凝血酶(Thrombin，Ⅱa)诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用，比较二者对血管平滑肌细胞凝血酶受体基因、蛋白表达功能及肌醇代谢的影响，以期在分子水平探讨高血压脑出血预防用药的作用机制以及药物筛选方法。 方法：应用细胞转染、反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、免疫印迹(Western-Blot)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、氚-胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)及~3H肌醇掺入实验等对体外培养的第4-6代Sprague-Dawley(SD)大鼠血管平滑肌细胞的凝血酶受体基因、蛋白表达功能、核酸及肌醇代谢进行测定。探索灯盏花素和反义凝血酶受体对血管平滑肌细胞增殖的影响。 结果：灯盏花素和反义凝血酶受体寡核苷酸均明显抑制凝血酶诱导的大鼠血管平滑肌细胞的增殖，与对照组、正义组相比，存在统计学差异(P＜0.05)，RT-PCR、Western-Blot及ELISA试验结果显示灯盏花素和反义凝血酶受体显著抑制了大鼠血管平滑肌细胞凝血酶受体mRNA和蛋白的表达；且明显抑制了血管平滑肌细胞磷酸肌醇代谢。灯盏花素和反义凝血酶受体对平滑肌细胞增殖的抑制效应没有差异。
张前[3]2004年在《羟基红花黄色素A对血管内皮细胞调控机理的研究》文中提出肿瘤的生长需要血管为之提供营养和排除代谢产物。研究表明，至少有30种生长因子与肿瘤的血管生成有关，其中最直接的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。如何阻断肿瘤血管的生成已成为目前肿瘤研究领域的一个重要课题。 抑制肿瘤血管生成药物的筛选依赖于体内或体外的实验方法，体内模型中鸡胚尿囊膜(CAM)生成实验占有优势，是大量初筛抗血管生成药物的良好模型；体外研究模型中一般首先采用噻唑蓝(MTT)实验检测抑制血管内皮细胞生长的药物。 在新血管的发生过程中，血管内皮细胞增殖是最基本和最重要的环节。由于肿瘤细胞和血管内皮细胞互相依赖介导了肿瘤血管新生。因此，研究体外肿瘤血管新生，要求模拟体内与肿瘤细胞共生的过程，即：血管内皮细胞与肿瘤细胞在共培养的条件下生长。 中医理论认为“血瘀证”为肿瘤的基本证型，活血化瘀法在抗肿瘤的研究中占有重要地位。红花是传统的活血化瘀类中药，临床上用于大肠癌等多种恶性肿瘤，但其作用机制鲜见相关报道。羟基红花黄色素A(HSYA)是红花的主要有效成分，目前有关HSYA作用的文章尚篇数不多。对于HSYA抑制新生血管形成的作用，国内外尚未见报道。 本研究通过预实验，首次从十味活血化瘀中药或中药有效组分中，筛选出HSYA能显著抑制CAM新生血管的生成及人脐静脉内皮细胞的增殖。为进一步探讨HSYA对肿瘤细胞的作用情况及作用机理，本研究将肿瘤细胞上清液加入到血管内皮细胞中，建立了异常增殖血管内皮细胞模型，通过MTT实验、荧光定量PCR和ELISA实验观察HSYA对正常及异常增殖血管内皮细胞的作用及作用机理，在基因表达及蛋白表达两个层次上探讨HSYA抑制新生血管可能的作用机理。本实验分为三部分： 第一部分，HSYA影响鸡胚尿囊膜血管生成的机理研究 由于新生血管与bFGF、VEGF及其受体的关系最为密切，本实验设计了bFGF、VEGF及其受体的引物，利用CAM血管生成实验，直接从富含血管的CAM组织上取材，通过RT-PCR实验，观察HSYA对CAM组织中上述三个基因表达的影响。结果表明，HSYA能显著抑制CAM毛细血管中bFGF、VEGF及VEGF受体flt-1的mRNA表达，尤其是对bFGF mRNA的表达明显呈抑制作用，与正常组相比，呈极显著性差异。 第二部分，HSYA在生理及病理条件下对培养ECV304的作用 由于肿瘤血管的生成由血管内皮细胞异常增殖开始的，因此，抑制血管内皮细胞增殖就可以抑制新生血管生成。本实验通过MTT法，观察了不同浓度的HSYA对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的作用，结果表明，低浓度的HSYA(5.35mg／L～0.16mg／L)表现出有抑制ECV304生长的作用，并且抑制强度与浓度呈反比，当HSYA的浓度在0.66mg／L～0.16m/L之间时，对ECV304细胞的抑制作用最强，呈极显著抑制(p＜0.001)。 为了进一步探讨HSYA对肿瘤血管内皮细胞的作用，本实验将肿瘤细胞上清液加入到血管内皮细胞中，建立了异常增殖血管内皮细胞模型，通过MTT实验观察HSYA对内皮细胞的作用。结果表明：不加中药的肿瘤组内皮细胞增长迅速，与对照组比较，经墓红花黄色素A对血管内皮细胞调控机理的研究呈极显著促进作用印<0.001)。而加入了经基红花黄色素A的中药组，均呈现出不同程度的抑制作用，尤其是0.66m岁L和0.33mg几两个浓度的HSYA组，与肿瘤组相比显示出极显著抑制内皮细胞的生长的作用印<0.001)。 第三部分经墓红花黄色素A抑制新生血管增殖的机理研究 为了深入探讨HSYA抑制生理及病理情况下内皮细胞增殖的调控机制，本实验设计了与血管内皮细胞生长有关的数个墓因的引物和数个细胞因子，通过上述建立的正常与异常增生血管内皮细胞模型，利用荧光定量PCR实验和EUSA实验，从墓因表达及蛋白表达的两个层次探讨HSYA抑制内皮细胞增殖的可能的作用机理，阐明红花抗肿瘤的可能的分子机制.结果如下: 荧光定量PCR实验的结果:在共培养细胞模型中，0.“m叭、0.33m叭浓度的HSYA对血管生成促进因子vEGF及其受体KDR、bFGF及其受体bFGFR和癌墓因c一my。及硫酸乙酞肝素蛋白聚糖2(HSPGZ/Perlecan)的角RNA表达具有抑制作用;对野生型抑癌墓因p53 mRNA的表达具促进作用.说明HSYA能抑制新生血管的生成及肿瘤细胞(L 5180)上清液刺激下血管内皮细胞(E Cv3o4)的增殖，其可能的作用机理之一是由于HsYA抑制了与增殖相关的早期反应墓因c一myom丑NA的表达，进而抑制了vEGF、bFGF等生长因子mRNA的表达;之二是HSYA通过促进野生型p53基因的表达，来抑制VEGF启动子的活性，进而抑制VEGF的表达;之三是HSYA通过在RNA水平上的调控，降低HSPG的表达，减少了与bFGF的结合，进而减少了bFGF的释放。 EUSA实验的结果:由于Rl;PCR结果只能反应出各基因在RNA水平上的调控情况，而RNA的表达和蛋白质的表达有时是不一致的，为了更深入地探讨HSYA的作用机理，本实验检测了VEGF、bFGF等6个与血管内皮细胞生长有关的细胞因子的表达，进一步在蛋白质水平上探讨HSYA抑制新生血管生成的作用.结果表明:在共培养细胞模型中，0.“m澎L、o.33m叭浓度的HsYA对血管生成促进因子vEGF及其受体flt一1、bFGF?
李妍[4]2002年在《反义整合素真核表达载体转染及恒磁场干预对动脉平滑肌细胞生物行为的影响》文中研究指明【研究背景】经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)及支架植入术应用于临床以来，术后20％～30％的再狭窄(RS)率一直制约其远期疗效，因此也成为心血管领域研究的热点和难点问题。随着细胞生物学和分子生物学的飞速进展，细胞外基质(ECM)受到广泛关注和研究。ECM如纤维粘连蛋白(FN)、胶原(Col)和层粘连蛋白(LN)，通过其相应的细胞膜粘附分子整合素受体，激活细胞内多个信号转导途径，调节细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达等多方面生物行为，参与RS形成和发展。因此我们设想，通过阻断ECM－细胞－整合素受体构成的细胞与基质的粘附系统内部之间的联系，并进而阻断其受体后信号转导途径，就可达到阻断平滑肌细胞过度增殖、迁移和基质大量合成这三个关键的环节，可望成为抑制再狭窄的新策略。但是ECM中各种成分如何对平滑肌细胞进行调节，整合素受体各亚基的表达水平及介导产生怎样的效应，均不十分清楚。 【目的】本实验旨在探讨ECM中两种重要成分纤维粘连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)及其整合素受体α_5β_1对平滑肌细胞生物功能的调节，并进一步采用反义基因转染和物理因素恒磁场干预，观察对细胞-ECM之间相互作用及信号转导的作用，为RS治疗提出新的靶点。 【方法】对人脐动脉平滑肌细胞的原代培养方法进行改进。建立体外FN和LN可溶性和不容性两种物理状态，以模拟体内的病理情况。采用~3H-TdR掺入和MTT法检测细胞增殖能力，~3H-羟脯氨酸检测细胞合成胶原能力，进行细胞粘附实验、Transwell细胞迁移实验检测细胞粘附和迁移能力。流式细胞仪检测细胞周期。单标记和双标记间接免疫荧光染色检测细胞整合素α_5和β_1、FN及细胞骨架蛋白α-SM-Actin的表达和分布。构建整合 刃四旱区大学俗士学世公文7 素反义真核表达载体AS心和AS仙转染平滑肌细胞，或用不同磁感应强 度的恒磁场干预细胞，透射电镜检测干预后细胞超微结构变化，流式细胞 仪检测细胞周期变化，厂乍stem Blot检测细胞表达整合素蛋白和磷酸化FA K 水平，DOt BIOt检测转染前后细胞整合素tRNA水平，用 FltO－3／AM标iC 细胞内时＼ 激光扫描共聚焦显微镜枝术检测细胞内游离比”浓度变化。 【结果】 一、人动脉平滑肌细胞原代培养方法的改良 小动脉平滑肌细胞培养可以采用动脉环直接接种的方法进行培养，接 种后培养瓶翻转前时间适当延长至5－6h，可以使组织块更好贴壁以及去除 成纤维细胞的污染。加入较高浓度bFGF和EGF，使长出时间提前5－7天， 而且模拟了体内局部病理环境。加入NaHCO；无细胞毒性。鉴定平滑肌细 胞时应选取原代培养的前3代，免疫细胞化学SABC法染色及间接免疫荧 光染色证实细胞表达a－SM－Actin，分别呈黄褐色丝状及丝状红色荧光分布 于胞浆内，透射电镜可见典型的平滑肌细胞肌丝形成的密斑和密体及吞饮 小泡。 二、不同物理状态的FN和LN对细胞生物行为的影响 卜 不同物理状态的FN和LN对细胞生物行为的作用不同。用20、40、60、 80、100 pg．／mL五种浓度65 FN和 LN，友现随浓度逐渐增加，iFN组fro胞 吸光度值、‘H＊dR掺入量、细胞粘附百分数、迁移细胞数均显著增加，iLN 则轻度促进增殖和粘附，而抑制细胞迁移，并呈浓度依赖性。sFN和sLN 对 hUASMCS的增殖、粘附呈浓度依赖性抑制，而 SLN则促进细胞迁移。 二 分别力。、抗整合素。；和pl亚基的抗体PIh年NCIO、＊＊＊mP短肽、 酪氨酸激酶抑制剂Gel。istein和钙通道阻断剂Nicaxdipine千预rN和几N介 导的细胞生物行为，友现对细胞增殖和粘附的抑制强度是Genistein＞ GRGDSP短肽＞P4C一PI D6＞Nicardipine。对细胞迁移的子 制强度是 GRGDSP短肽＞P4C10＞G＞flistsifl＞PID6＞NICCdlplflfl。 3．浓度为 60～100卜u／mL的 iFN和 sLN，显著促进 hUASMCs的胶原合成 能力，iFN较 sLN作用更强。但低浓度 20、40pg／mL与对照组无明显差别。 而 SFN、iLN则抑制细胞合成胶原。 4．iFN使细胞表达整合素 15和A 增加，并使其形成微。］、簇状粘着斑，o sFN组整合素a。和p；及 Actin呈弥散分布，没有形成微小簇状粘着斑。 三、转染反义整合素l。和pl真核表达载体对平滑肌细胞生物行为的改变 l．pECE－a。和pECE｝为模板，进行修饰聚合酶链反应（mPCR），得到两 I’Is伽ie OfO汕ov地cular砌eme风WU 2002 剪曰旱巨大攀俗士学位论文 吕 端分别带有ECORI和HIOdlll酶
缪玉兰[5]2009年在《RNAi下调凝血酶敏感蛋白-1对脓毒症损伤影响的实验研究》文中研究指明目的:利用RNA干扰(RNAi)方法探讨凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)对脓毒症肝损伤的影响及其作用机制。方法:雄性Balb/c小鼠通过盲肠结扎穿刺成功制作脓毒症模型,观察腹腔及肝脏大体解剖,检测血清转氨酶含量、肝脏TSP-1mRNA表达水平及肝脏TSP-1蛋白表达水平,探讨脓毒症时肝脏TSP-1的变化规律;利用RNAi技术靶向降解TSP-1 mRNA,引起转录后基因沉默,从而下调肝脏TSP-1表达水平,检测血清转氨酶含量、血清TNF-α含量,观察肝细胞凋亡情况,检测肝脏p38 MAPK蛋白表达变化,探讨TSP-1在脓毒症肝损伤中的作用及其机制。结果:与对照组相比,制作脓毒症模型后6小时肝脏TSP-1 mRNA及TSP-1蛋白表达明显增高,同时伴有肝脏炎症加重、血清ALT和AST含量明显升高,之后在制模24小时观察期内TSP-1维持于较高水平;利用流体尾静脉注射法予以siRNA-TSP1有效片段进行RNA干扰,制作脓毒症模型后血清ALT和AST含量、血清TNF-α含量均明显降低,肝细胞凋亡明显减少,同时肝脏磷酸化p38 MAPK蛋白表达减少。结论:脓毒症时肝脏TSP-1表达增加,作为炎症介质可能参与介导脓毒症肝损伤发生,导致血清转氨酶含量升高、血清TNF-α含量升高、肝细胞凋亡增加,同时磷酸化p38 MAPK蛋白活化,TSP-1可能通过p38 MAPK信号转导通路的激活介导其肝损伤作用。
张新平[6]2006年在《粉防己碱对动脉内膜损伤后血管再狭窄的防治作用及机制》文中认为第一部分建立家兔颈总动脉内膜球囊剥脱损伤后新生内膜增殖和血管重塑动态变化模型目的：目前普遍认为，血管内皮损伤诱发的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖并且向内膜迁移，随之引起的内膜增殖和血管重塑被认为是经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后再狭窄(restenosis，RS)的主要病理机制。为探索RS的发病机制并进行干预研究，我们模拟复制家兔颈总动脉内膜损伤后不同时间点的VSMC增殖和血管重塑动态变化模型。方法：选用家兔42只行左侧颈总动脉内膜(内皮细胞)球囊剥脱损伤，分别于损伤后1天(day，d)、3d、5d、7d、14d、28d、35d处死家兔，取损伤区域的血管段制备标本HE染色，进行形态学观察。同时应用医学图文分析系统测算损伤后不同时间点各组血管腔面积(lumen area，LA)、内膜和中膜厚度及面积、以及外弹力膜内横截面积(external elastic lamina area，EELA)与对侧未损伤血管比较。结果：(1)未损伤侧家兔颈总动脉内膜仅见单层内皮细胞；球囊损伤后1d可见动脉内皮剥脱，损伤后3d血管腔内表面可见增殖的VSMC，损伤后5～7d新生内膜(neointima，NI)形成并逐渐增厚，损伤14d以后NI厚度及面积继续增加，至35d达最大，同时细胞外基质(extracellular matrix，ECM)也逐渐增加。(2)损伤后3～14d中膜厚度及面积逐渐增加，其中14d中膜面积明显大于未损伤侧，28～35d趋于降低。LA于损伤后5～7d开始减少；14d以后明显小于未损伤侧。损伤后1～7d EELA逐渐增大，至14d达最大，28d后开始回缩。结论：(1)家兔颈总动脉内膜球囊损伤能较好的模拟RS形成过程，我们模拟复制的RS动态变化模型是成功的，具有合理性和科学性。(2)内膜增殖与血管重塑均是RS形成的主要病理机制，RS形成由内膜增殖与血管重塑的失衡所决定，两者协同导致管腔狭窄。第二部分实验一动脉内膜损伤后VSMC表型转化及P38 MAPK、MKP-1的表达变化目的：观察动脉内膜损伤后血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和P38丝裂原激活蛋白激酶(P38 MAPK)、丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)表达变化以及它们之间的关系。方法：本实验通过建立家兔颈总动脉内膜球囊损伤后再狭窄(restenosis，RS)模型，分别应用免疫组化、免疫印迹(Western blot)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测假损伤组(S组)和损伤后不同时间点血管壁中增殖细胞核抗原(PCNA)、平滑肌α肌动蛋白(SMα-actin)、P38 MAPK蛋白和MKP-1蛋白及其mRNA表达的变化。结果：(1) S组中膜VSMC及内皮细胞(内膜)PCNA免疫组化染色为阴性；中膜于损伤后1～14d、新生内膜(niointima，NI)于损伤后5～14d PCNA阳性细胞率逐渐增加，以14d达到高峰，28d后开始逐渐减少，但其阳性细胞率仍较高，且各时间点NI中的PCNA阳性细胞率略高于中膜。(2) S组中膜SMα-actin染色为阳性，内膜为阴性；中膜SMα-actin阳性表达面积于损伤后1d开始减少，3d最为明显，5d后开始逐渐增加，28d后接近于S组水平。损伤后5～35d NI中SMα-actin均有阳性表达，但阳性表达面积略少于中膜。(3) S组中膜P38 MAPK免疫组化染色呈阴性或弱阳性。中膜于损伤后1～14d、NI于损伤后5～14d P38 MAPK阳性表达面积显著增加，以14d达高峰，28d后开始逐渐减少，但至损伤后35d仍明显高于S组，且NI阳性表达面积高于中膜。Western blot检测损伤后1～35d血管壁中P38 MAPK呈持续性高表达，其中以14d升高最为明显，28d后开始逐渐减少。P38 MAPK与PCNA表达变化呈正相关。(4) S组中膜及内膜MKP-1免疫组化染色呈弱阳性或阳性。损伤后1～3d中膜阳性表达面积进行性减少，5～7d达到最低值，同时NI呈阴性或弱阳性着色。而损伤后14～28d中膜和NI中MKP-1阳性表达面积略有回升，至35d仍远未回到S组水平，且NI阳性表达面积稍低于中膜。血管壁中MKP-1 mRNA表达变化与其免疫组化结果基本一致，与PCNA表达变化呈负相关。结论：(1) VSMC增殖能力与其表型转化密切相关。(2) P38 MAPK和MKP-1可能参与了血管内膜损伤后VSMC表型转化的信号转导及其调节。第二部分实验二粉防己碱对血管内膜损伤后VSMC表型转化和P38 MAPK、MKP-1表达的影响目的：探讨粉防己碱(tetrandrine，Tet)对血管内膜损伤后血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和P38丝裂原激活蛋白激酶(P38 MAPK)及丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)表达的影响。方法：本实验通过建立家兔颈总动脉内膜球囊损伤模型，采用HE染色检测28天(day，d)假损伤组(sham-injured group，S组)、损伤组(injured group，Ⅰ组)和损伤+Tet治疗组(injured+Tet-treated group，Tet组)血管形态学改变；又分别使用免疫组化、Western blot和RT-PCR技术检测Ⅰ组和Tet组7d、14d和28d血管壁中增殖细胞核抗原(PCNA)、平滑肌α-肌动蛋白(SMα-actin)、P38 MAPK和MKP-1表达的变化。结果：(1) S组28d血管壁各层结构完整；Ⅰ组28d新生内膜面积(neointima area，NIA)显著增加，管腔面积(Lumen area，LA)显著缩小；而Tet组新生内膜增殖程度较同期Ⅰ组明显减轻，LA显著增加。(2)损伤后7d，Tet组与Ⅰ组比较血管壁中的SMα-actin、PCNA、P38 MAPK和MKP-1表达基本一致，新生内膜增殖程度亦基本相同。Tet组14d和28d，血管壁中的PCNA和P38 MAPK表达均分别显著低于同期Ⅰ组，而MKP-1表达均分别显著高于同期Ⅰ组，且Tet对上述各指标的影响均呈时间依赖性；损伤后14、28d SMα-actin表达均略高于同期Ⅰ组。结论：Tet能够不同程度地拮抗内膜损伤后P38 MAPK信号转导途径及其上调MKP-1的负性调节，抑制VSMC表型转化，继而减缓新生内膜增殖。第三部分血管内膜损伤后MMP9和TIMP2表达变化及Tet对其表达的影响目的：探讨血管内膜损伤后基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP 9)和基质金属蛋白酶抑制剂2(tissue inhibitors of metalloproteinases 2，TIMP 2)在再狭窄细胞外基质(extracellular matrix，ECM)形成中的作用以及粉防己碱(Tetrandrine，Tet)对MMP9、TIMP2表达和新生内膜增殖的影响。方法：制作家兔颈总动脉内膜损伤后血管再狭窄模型，采用免疫组化、逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术，分别检测假损伤组(S组)28 d时和损伤组(Ⅰ组)、损伤+Tet治疗组(Tet组)7 d、14 d、28 d时血管壁中的MMP9、TIMP2 mRNA及其蛋白表达的变化，以及新生内膜增殖的变化。结果：(1)损伤后7 d组血管中膜MMP9阳性表达面积较高，而14和28 d开始逐渐减少；新生内膜于损伤后7 d时MMP9阳性表达面积较低，14 d显著增加，而28d又明显减少。损伤7 d组中膜、新生内膜TIMP2阳性表达面积较低，而14 d和28 d均显著增加。(2)与同期Ⅰ组比较，Tet组7 d中膜及新生内膜中MMP9和TIMP2阳性表达面积无明显变化，而14 d和28 d两者阳性表达面积均分别显著减少，新生内膜增殖程度也有减轻和明显减轻。(3)S组动脉壁中MMP9 mRNA及其蛋白水平呈低表达，而TIMP2 mRNA及其蛋白则呈高表达。与S组比较，Ⅰ组7、14和28 d血管壁中MMP9 mRNA和蛋白呈强表达或高表达；Ⅰ组7 d血管壁中TIMP2 mRNA和蛋白呈低表达，而14和28 d又恢复甚至高于S组水平。(4)与同期Ⅰ组比较，Tet组7 d血管壁中MMP9、TIMP2 mRNA和蛋白表达均无显著变化；而治疗后14和28 d均分别显著减少，以TIMP2 mRNA及其蛋白减少更为明显。结论：(1)MMP9和TIMP2不平衡增加和／或比例失衡在血管内膜损伤后ECM形成中具有重要作用。(2)Tet可降低内膜损伤后血管壁中MMP9和TIMP2 mRNA及其蛋白的异常高表达，使二者比例趋向平衡，减少ECM大量分泌和积累，从而抑制新生内膜增厚和血管重塑。
信红亚[7]2007年在《DDAH/ADMA系统调节内皮细胞组织因子表达作用及其机制研究》文中研究表明出血是急性白血病早期多见的临床表现，也是急性白血病死亡的首要原因。危及生命的出血的发生与白血病细胞所致的组织因子(TF)水平升高有关。白血病细胞除了在其细胞膜上表达大量TF抗原外，还可与内皮细胞相互作用诱导内皮细胞表达TF，导致白血病患者的凝血功能紊乱。此外，白血病患者极易合并和(或)继发细菌感染，而常见的感染致病菌中的脂多糖(LPS)成份可显著增强内皮细胞TF的活性及其表达，从而激活TF介导的凝血途径，导致弥散性血管内凝血(DIC)的发生。一氧化氮(NO)是维持血管内皮功能最重要的一种介质，由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成，发挥舒张血管、抗炎、抗血栓形成等多种生物学功能。近期研究显示，体内存在内源性NOS抑制物如非对称二甲基精氨酸(ADMA)，其在体内和体外均可抑制NO的合成，导致内皮功能不全。在一些心血管疾病中，血浆ADMA浓度显著升高，且与病理性血栓形成等凝血功能紊乱的发生发展密切相关。但是急性白血病患者血浆ADMA水平如何，是否与急性白血病患者凝血功能紊乱有关在国内外尚未见报道。先前研究显示内源性NO可抑制内毒素或单核细胞诱导的内皮细胞TF的表达。二甲基精氨酸—二甲胺水解酶(DDAH)是ADMA的特异性水解酶，在调节组织和细胞内ADMA水平中起关键作用。因此，DDAH／ADMA通路被认为是一个调节内源性NO生成和内皮功能的新系统。那么，DDAH／ADMA通路是否参与了白血病细胞及LPS诱导内皮细胞表达TF中的作用也是本研究要讨论的内容。全反式维甲酸(ATRA)是治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的首选药物，可迅速缓解白血病患者的凝血功能紊乱。新近报道ATRA可上调内皮细胞DDAH mRNA的表达，增加内源性NO的生成。去甲基雏菊叶龙胆酮(DMB)是从中草药川东獐牙菜中提取出来的一种主要的(口山)酮化合物，具有多种药理学活性。在氧化应激和炎症因素存在时，DMB可通过改善DDAH活性，降低ADMA水平发挥保护内皮细胞功能的作用。先前研究显示(口山)酮化合物在内毒素诱导的鼠DIC中有保护作用。因此，我们对DDAH／ADMA通路在ATRA及DMB分别在抑制白血病细胞或LPS诱导内皮细胞表达TF中的作用以及该作用是否与调节DDAH／ADMA通路有关进行了探讨。基于上述设想，本研究对以下二个方面进行了探讨：(1)检测ADMA水平与血浆TF在急性白血病患者中的表达，并在白血病细胞与内皮细胞细胞共培养模型中探讨：DDAH／ADMA通路对白血病细胞诱导内皮细胞表达TF的调节作用及其机制；(2)研究DDAH／ADMA通路在LPS诱导内皮细胞表达TF的作用，及其在(口山)酮抑制LPS诱导内皮细胞表达TF中的作用。方法(1)选择121例急性白血病患者，健康对照组20例。(2)培养人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)和急性粒细胞白血病细胞株(HL-60)。建立白血病细胞与内皮细胞共培养模型。(3)构建hDDAH2 cDNA表达质粒，脂质体法转染HUVECs获得过表达DDAH2的内皮细胞。(4)高效液相色谱法(HPLC)测定血浆及细胞培养上清液中ADMA的含量；通过测定被酶代谢掉的ADMA的量评价内皮细胞DDAH的活性。(5)酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)定量检测血浆TF抗原含量。(6)MTT法观察细胞活力。(7)一期凝固法检测培养细胞冻融液的促凝活性。(8)RT-PCR法检测TF及DDAH2 mRNA水平。(9)Western Blot检测DDAH2蛋白表达。(10)荧光Ca~(2+)示踪剂Fura-2检测细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)。(11)荧光发光法检测细胞内氧自由基(ROS)生成。(12)凝胶电泳迁移率法(EMSA)分析核因子—κB(NF-κB)的DNA结合活性。结果(1)初治急性白血病患者血浆ADMA水平及TF抗原表达明显高于健康对照组(P＜0.01)；化疗后血浆ADMA水平显著降低(P＜0.01)；未缓解组和完全缓解组血浆ADMA水平明显低于初治组(P＜0.01)。复发组与初治组血浆ADMA水平无显著差异(P＜0.01)；初治急性白血病患者血浆ADMA水平与血浆TF抗原表达呈正相关(R=0.853，P＜0.01)。(2)HL-60与HUVECs共培养后，混合细胞TF促凝活性显著增高，且增加的促凝活性来自于内皮细胞而非HL-60。外源性ADMA(1μM)预处理HUVECs细胞后可显著增强共培养所致TF活性及mRNA表达上调的作用；相反，过表达DDAH2可显著抑制此过程。(3)共培养上清可显著增加细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)，此过程可被预处理ADMA(1μM)增强，被过表达DDAH2明显抑制。细胞内Ca~(2+)螯合剂BAPTA-AM可抑制共培养上清和ADMA所致内皮细胞TF活性及mRNA表达的增加。(4)ATRA(10~(-7)M～10~(-5)M)预处理内皮细胞可呈浓度依赖性地抑制共培养上清诱导内皮细胞TF活性及mRNA的表达，上调DDAH2 mRNA的表达。(5)LPS能呈浓度和时间依赖性地诱导HUVECs表达TF。外源性ADMA(1μM)后可明显增强LPS(1μg／ml)上调TF活性及mRNA表达的作用，相反L-精氨酸(50 mM)、过表达DDAH2及DMB可显著抑制此过程。(6)LPS(1μg／ml)能显著增高内皮细胞培养上清中ADMA的水平、降低内皮细胞DDAH活性，DMB(1μM～10μM)可呈浓度依赖性地抑制此过程。(7)LPS可增加细胞内ROS生成并激活NF-κB，其作用可被ADMA(1μM)增强，被L-精氨酸(50mM)、过表达DDAH2与DMB抑制。结论(1)急性白血病患者血浆ADMA水平显著升高，并与TF表达呈正相关，提示内源性ADMA含量升高可能是急性白血病患者发生凝血功能紊乱的原因之一。(2)DDAH／ADMA通路参与了白血病细胞诱导内皮细胞TF的表达，其作用与调节细胞内Ca~(2+)信号有关。(3)ATRA能调节内皮细胞DDAH／ADMA通路，抑制白血病细胞诱导的内皮细胞TF的表达。(4)DDAH／ADMA通路可通过ROS-NF-κB依赖性途径调节LPS诱导内皮细胞TF的表达。(5)DMB可通过调节DDAH／ADMA系统、抑制ROS-NF-κB依赖性途径在转录水平抑制LPS诱导的TF表达。
李元青[8]2008年在《三七活性成分抗B_（16）黑色素瘤生长及肿瘤血管生成实验研究》文中研究指明1目的通过小鼠B_(16)黑色素移植瘤模型,观察三七提取活性成分Rh_2、Rg_3抗肿瘤效应,并从影响肿瘤血液供应角度探讨其可能的作用机制。2方法(1)建立小鼠B_(16)黑色素移植瘤模型,随机分9组给药:①模型组;②CTX组;③Rh_2大剂量组;④Rh_2中剂量组;⑤Rh_2小剂量组;⑥Rh_2+Rg_3组;⑦Rg_3大剂量组;⑧Rg_3中剂量组;⑨Rg_3小剂量组。用药10天,实验过程中动态观察小鼠整体状况、体重以及死亡情况。第15天眼球取血放射免疫法测定白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)水平;脱颈处死小鼠,摘除胸腺、脾称重,计算免疫器官脏器指数;剥离肿瘤称重,计算抑瘤率。(2)小鼠B_(16)黑色素移植瘤模型随机分6组给药:①模型组;②Rh_2组;③Rh_2+Rg_3大剂量组;④Rh_2+Rg_3中剂量组;⑤Rh_2+Rg_3小剂量组;⑥Rg_3组。用药10天,第15天脱颈处死小鼠,剥离肿瘤,10%甲醛固定肿瘤组织,石蜡包埋。HE染色光镜下观察肿瘤组织形态。采用免疫组化与组织化学双重染色法检测血管生成拟态:①使用内皮细胞标记物CD31和PAS双重染色;②黑色素瘤特异性标记物S-100和PAS双重染色。免疫组化法检测肿瘤血管生成相关基因VEGF、EphA2、Laminin、MMP-2、VE-cadherin的表达。3结果(1)所有实验小鼠均存活。实验过程中发现模型组、CTX组小鼠一般状态逐渐下降,进食量明显减少,鼠体渐消瘦,且毛色逐渐变得缺乏光泽,并有脱毛、行动迟缓等现象,尤以CTX组更加明显。Rh_2、Rg_3各剂量组与模型组、CTX组比较,整体状况良好。剥离肿瘤时发现模型组肿瘤呈浸润性生长,肿瘤血管丰富,包膜不易剥离;其余各组瘤体包膜相对比较完整,血管相对较少,易于剥离完整瘤块,尤其以Rh_2各剂量组和Rh_2、Rg_3联合用药组明显。(2)与治疗前比较,模型组、CTX组小鼠体重明显下降,脏器指数明显减低,血清IL-2和TNF水平下降,尤以CXT组更为明显,各实验组小鼠体重增加,Rh_2、Rg_3单用及联合用药均能明显提高外周血中IL-2、TNF-α的含量,以联合用药组最为显著,且能够提高荷瘤小鼠免疫器官重量,与对照组比较差异显著。(3)三七提取活性成分Rh_2、Rg_3各剂量组均能抑制小鼠B_(16)黑色素瘤生长,平均瘤重与模型组比较有统计学意义(P＜0.05)。尤其是Rh_2大、中剂量组,Rg_3大剂量组和Rh_2、Rg_3联合用药组,抑瘤率分别为35.5%,30.1%,33.6%和38.6%。Rg_3大、中剂量组抑瘤效果低于Rh_2相应剂量组。(4)与模型组比较,三七活性成分Rh_2、Rg_3单独用药及联合用药各组肿瘤血管生成拟态密度(VMD)以及内皮依赖性微血管密度(MVO)均有降低,CD31和S-100的表达下调,以各联合用药组更为明显。(5)模型组肿瘤组织高表达VEGF、EphA2、MMP-2及VE-cadherin、Laminin;三七活性成分Rh_2、Rg_3各实验组均能明显下调VEGF、EphA2、VE-cadherin、MMP-2的表达。以Rh_2、Rg_3联合用药组更显著,与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。4结论1.三七活性成分Rh_2、Rg_3对小鼠B_(16)黑色素瘤生长有明显的抑制作用而没有明显毒副作用,能够改善小鼠整体状况而不降低小鼠体重,不抑制荷瘤小鼠免疫功能,表明其能在抗肿瘤同时提高荷瘤小鼠的生活质量。2.三七活性成分Rh_2、Rg_3能显著抑制小鼠B_(16)黑色素瘤血管生成拟态及内皮依赖性新生血管的形成,从而有效地阻断肿瘤血液供应。3.三七活性成分Rh_2、Rg_3抑制小鼠B_(16)黑色素瘤血管生成拟态的机制可能是通过阻止EphA2的活化,下调MMP-2及VE-cadherin的表达,从而抑制Laminin的表达及水解有关;其抗肿瘤内皮依赖性新生血管的机制可能与下调VEGF、MMP-2的表达有关。4.抑制肿瘤VM及内皮依赖性血管的形成可能是三七活性成分Rh_2、Rg_3抗肿瘤机制之一。5.三七活性成分Rh_2、Rg_3联合用药抗肿瘤血液供应及抗肿瘤效应更显著。
陈凌[9]2008年在《5-HT2A受体及其阻滞剂在糖尿病勃起功能障碍中的作用机制及其治疗意义》文中研究指明目的1.观察糖尿病大鼠阴茎勃起功能的变化情况及阴茎海绵体病理损伤状况。2.用免疫组化的方法明确5-HT2A受体在大鼠阴茎组织的表达及其分布情况,并通过观察5-HT2A受体在雄性糖尿病勃起功能障碍(DED)大鼠中的变化,初步探讨其在糖尿病性ED发病中的作用。3.尝试用5-HT2A受体阻滞剂盐酸沙格雷酯治疗糖尿病大鼠,观察其对勃起功能的改善情况及其对阴茎eNOS、5-HT2A受体的表达、血清5-HT、NO、ET-1浓度及NO/ET-1比值的影响,同时观察该药干预后糖尿病大鼠阴茎组织病变的变化情况,探讨5-HT及其2A型受体参与DED发生、发展的可能机制,明确5-HT2A受体阻滞剂治疗糖尿病ED的作用及其途径。方法SD大鼠高脂高糖加小剂量STZ(35mg/kg)腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型,将大鼠分为正常对照组(NC)、盐酸沙格雷酯高、中、低剂量干预组(SH组:100mg/kg/d、SM组:50mg/kg/d、SL组:25mg/kg/d)、西地那非干预组(WG)及糖尿病组(DM)。阿朴吗啡(APO)颈后皮下注射,观察大鼠阴茎勃起功能并以该实验阴性作为判断发生DED的标准,将药物干预12周末的糖尿病组大鼠分为发生ED组(DED)及未发生ED组(NED)。5-HT2A受体阻滞剂盐酸沙格雷酯(sarpogrelate hydrochloride )干预12周,并与糖尿病组和西地那非组对照,观察各组的勃起率和勃起次数。免疫组化法测定各组大鼠阴茎组织中5-HT2A受体、一氧化氮合酶(eNOS)的分布、表达情况。ELISA法和硝酸还原酶法测定各组大鼠5-HT、ET-1、NO的血清含量,计算NO/ET-1比值。光镜及电镜下观察糖尿病大鼠阴茎海绵体病理损伤状况。结果1.与NC组相比,DM组大鼠阴茎勃起功能明显下降。光镜、透射电镜下观察DM组大鼠阴茎海绵体存在明显病理损伤。2.大鼠阴茎组织中5-HT2A受体主要表达在阴茎海绵窦和血管的内皮及平滑肌细胞,以及神经纤维中。与NC组相比,DM大鼠血清5-HT浓度明显增高,而阴茎5-HT2A受体表达明显下调(P<0.01),DED组5-HT2A受体表达下调较NED组更为显著(P<0.05)。3.药物干预第4、8、12周时,与DM组对比,高剂量盐酸沙格雷酯治疗组大鼠阴茎勃起率、勃起次数有明显增加(P﹤0.05);与西地那非组相比,高剂量、中剂量盐酸沙格雷酯治疗组早期勃起率及勃起次数均低于WG组(P﹤0.05),中期上述指标与WG组接近,后期勃起率、勃起次数均高于WG组,但无统计学差异。5.与DM组相比,5-HT2A受体阻滞剂治疗使大鼠阴茎组织5-HT2A受体及eNOS蛋白表达水平上调(p<0.01),血清5-HT浓度下降(p<0.01),NO浓度上升(p<0.05),NO/ET-1比值上升(p<0.01),阴茎海绵体病理损伤明显减轻。结论1.糖尿病严重影响大鼠阴茎勃起功能,造成阴茎组织不可逆性病理损伤。2.随病程延长,糖尿病大鼠阴茎勃起功能进行性下降,DED发病率不断上升。3.APO实验是较好的用于判断大鼠阴茎勃起功能的方法,并可以用于筛选勃起功能障碍大鼠。4.5-HT- 2A受体主要表达在阴茎血管和海绵窦的内皮及平滑肌细胞,以及神经纤维中。5.12周病程糖尿病大鼠血清5-HT浓度升高,阴茎海绵体5-HT2A受体表达下降。6. 5-HT2A受体阻滞剂对糖尿病大鼠阴茎勃起功能有保护作用,它改善糖尿病大鼠阴茎组织病理损伤状况,突出表现为保护海绵窦内皮细胞及抑制胶原增生的作用。7. 5-HT2A受体阻滞剂上调糖尿病大鼠阴茎组织eNOS表达水平,5-HT收缩血管的机制可能包括抑制eNOS的表达。8. 5-HT及5-HT2A受体在DED的发生中起一定作用。
陈俊松[10]2014年在《TF对内皮细胞P-选择素表达的影响及TFPI对其调控作用》文中进行了进一步梳理组织因子(TF)是生理性止血的重要影响因子,它通过直接启动外源性凝血途径和间接放大内源性凝血途径来发挥止血的功能。本研究我们就探讨TF对内皮细胞P-选择素表达的影响及组织因子途径抑制物(TFPI)的抑制作用。目的：观察组织因子(TF)对人脐静脉血管内皮细胞株(HUVECs) P-选择素(Ps)表达的影响及其作用机制,并探讨TFPI对TF诱导HUVECs表达P-选择素的抑制作用。方法：HUVECs和单核细胞THP-1的培养均采用DMEM完全培养基；MTT比色法观察HUVECs活力；比色法检测细胞黏附率；ELISA法检测Ps抗原；RT-PCR的方法检测Ps mRNA。结果：①与对照组相比,不同浓度的TF (1、10、50、100、150pg/ml)呈剂量依赖性的方式促进Ps抗原(r=0.958, P<0.05)、Ps mRNA表达增加(P<0.05),且浓度达到100pg/ml时为最佳刺激效应浓度；同时也呈剂量依赖性的方式促进HUVECs与THP-1之间的黏附(r=0.972, P<0.05);②TFPI (1、10、50、100、150ng/ml)单独刺激时,血管内皮细胞与单核细胞之间的黏附率并没有受到影响(P>0.05)；但在给予TF刺激之前30min用TFPI (1、10、50、100、150ng/ml)预处理HUVECs后,TF (100pg/ml)刺激]HUVECs表达Ps的作用(r=-0.946,P<0.05)以及其与单核细胞的黏附作用明显受到抑制,相关性分析表明这种作用存在显著的量效关系(r=-0.934,P<0.05),且浓度在100ng/ml时其抑制作用最强。⑨与对照组相比,使用NF-κB信号途径抑制剂PDTC时,可显著抑制TF诱导]HUVECs细胞表达Ps抗原和mRNA (P<0.05)。结论：①TF能以时间依赖性和剂量依赖性方式诱导血管内皮细胞表达Ps,且这种作用是发生在mRNA水平上的；②TFPI能抑制TF诱导血管内皮细胞Ps表达的作用；③TF能促进HUVECs的黏附性,而TFPI对该作用具有抑制效应；④NF-κB信号途径可能参与TF诱导HUVECs细胞表达Ps上调的作用。
参考文献：
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