[通信作者：邸红莲]
李颖邸红莲*
保定市第一中心医院071000
【摘要】目的探讨SD大鼠采用抗青光眼滤过术处理后热休克蛋白47（Heatshockprotein47，HSP47）在滤过泡中的表达变化及其意义。方法选取健康成年SD大鼠24只，雌雄各半，均随机编号1～12号，采用随机数值表法分为2d、4d、6d、10d、14d、正常组6个组（4只每组），2d、4d、6d、10d、14d组大鼠均进行右眼抗青光眼滤过手术处理，术后采用裂隙灯观察各组大鼠滤过泡及眼前节情况，分别与实验第2d、4d、6d、10d、14d处死相应组大鼠，应用实时荧光定量（PCR）技术检测滤过泡中的HSP47、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达情况。结果SD大鼠在术后第2d的HSP47、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、mRNA在滤过泡中的表达就略微的上升，但与正常组比较差异不显著（P>0.05）,术后第4d、6d、10d、14d大鼠滤过泡中的HSP47、Ⅲ型胶原蛋白、mRNA表达水平较正常组显著地升高且差异具有统计学意义（P<0.05）；Ⅰ型胶原蛋白、mRNA在大鼠抗青光眼术后第6d、10d、14d较正常组显著的升高（P<0.05）。结论SD大鼠抗青光眼术后HSP47蛋白及mRNA的表达水平变化基本与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、mRNA表达变化一致，表明HSP47在大鼠眼滤过泡瘢痕形成过程中可能具有重要作用。
【关键词】抗青光眼滤过术；SD大鼠；热休克蛋白47；滤过泡
【中图分类号】R775【文献标识码】A
1材料与方法
1.1实验动物及分组方法
选取健康成年SD大鼠24只，雌雄各半，体质量250～300g，平均（274±22）g；由某大学医学部动物实验中心提供（许可证号：SCKK（沪）2014009）；雌雄均随机编号1～12号，采用随机数值表法分为2d、4d、6d、10d、14d、正常组6个组（4只每组）。饲养于室温为18～25℃、湿度40%、黑暗与日光照射各12h的环境中，
1.2实验方法
1.2.1实验仪器与药品
选用北京中杉金桥生物技术有限公司生产的二步法免疫组化检测试剂盒、枸橼酸盐抗原修复液及浓缩型DAB试剂盒；选用北京协和医院病理科提供的伊红染液；选用卫生部中日友好医院病理科提供的0.1％苦味酸-天狼星红染。选用日本高木精工株式会社提供的，TAKAGIOM．10眼科手术显微镜；选用日本Nikon公司生产的E600W光学显微镜及数码成像系及偏振光显微镜及数码成像系统；选用日本SANYO公司生产的恒温培养。
1.2.2造模方法
给予大鼠腹腔注入35mg/kg2%戊巴比妥钠溶液麻醉，并给予大鼠0.5%盐酸地卡因滴眼麻醉，5-0尼龙线开睑，再次0.5%盐酸地卡因滴眼麻醉。于角膜后2.0cm处切口，横向切开球结膜、球筋膜、巩膜，选用热大头针灼烧巩膜切除区域。扩大切口直至前房，剪除角巩膜缘处组织，平铺结膜瓣，缝合球结膜，常规抗炎，送回饲养房，常规喂养。
1.3指标检测方法（PCR法检测HSP47、Ⅰ、Ⅲ型mRNA及蛋白的表达）
2％戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，打开大鼠腹腔，暴露心脏，剪开左心耳，选用生理盐水快速灌注心脏，直至右心耳流出液清亮。摘除大鼠双侧眼球，福尔马林固定，包埋封闭，置入脱水机内脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察并照相记录。
1.4统计学分析
统计分析在SPSS17.0中进行。计量资料以（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1SD大鼠造模眼的滤过泡形态及眼前节变化
20只SD大鼠的造模过程顺利，抗青光眼滤过术后手术区球结膜弥散隆起（图1），未发现渗漏、滤过泡的形成完好；造模大鼠的切口愈合良好，结膜透明，前房完好，所有手术眼术后均可见房水闪辉，2到3d消失，手术中有3只眼睛出现术中出血，术后2d完全吸收，术后大鼠的瞳孔圆形，晶状体透明，对光反射存在。
2.2SD大鼠抗青光眼滤过术后HSP47、Ⅰ、Ⅲ型胶原在蛋白质水平上的表达变化
SD大鼠在术后第2d的HSP47、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在滤过泡中的表达就略微的上升，但与正常组比较差异不显著（P>0.05）,术后第4d、6d、10d、14d大鼠滤过泡中的HSP47、Ⅲ型胶原蛋白表达水平较正常组显著地升高且差异具有统计学意义（P<0.05）；Ⅰ型胶原蛋白在大鼠抗青光眼术后第6d、10d、14d较正常组显著的升高（P<0.05）。详见图1。
2.3SD大鼠抗青光眼滤过术后HSP47、Ⅰ、Ⅲ型胶原在mRNA水平上的表达变化
SD大鼠在术后第2d的HSP47、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在滤过泡中的表达就略微的上升，但与正常组比较差异不显著（P>0.05）,术后第4d、6d、10d、14d大鼠滤过泡中的HSP47、Ⅲ型胶原mRNA达水平较正常组显著地升高且差异具有统计学意义（P<0.05）；Ⅰ型胶原mRNA在大鼠抗青光眼术后第6d、10d、14d较正常组显著的升高（P<0.05）。详见图2。
3.讨论
抗青光眼滤过术是青光眼尤其是难治性青光眼（如开角型青光眼等）的常用治疗术式，但术后患者眼内常出现滤过泡瘢痕，这严重影响手术疗效。
热休克蛋白47（HSP47）是胶原特异性分子伴侣之一，主要存在于胶原分泌细胞的内质网中。胶原是分泌性蛋白的一种，该细胞多于细胞内生成前胶原，并分泌到细胞外最终转化为胶原蛋白。而HSP47是这一过程的重要参与物质，HSP47可介导前胶原肽链折叠、修饰，并促螺旋结构形成。HSP47表达与胶原分泌细胞分化及发育中的胶原蛋白数量密切相关。Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的初级合成成纤维细胞内均可见HSP47的表达，而在293胚肾细胞等无胶原合成细胞内则未见HSP47表达。抗青光眼滤过术滤过泡瘢痕化是一个多细胞因子参与的复杂过程，其本质是组织创伤修复。这也是临床认为调控抗青光眼滤过术患者术后恢复是降低滤过泡瘢痕率的重要方式的根本原因。本次研究中，我们还发现SD大鼠术后第4d、6d、10d、14d大鼠滤过泡中的HSP47、mRNA表达水平较正常组显著地升高，这表明HSP47参与着滤过泡瘢痕的发生、发展，提示抗青光眼滤过术带来的手术创伤可能对HSP47表达具有促进作用，临床可从调控患者眼部HSP47表达入手防治滤过泡瘢痕。值得注意的是，滤过泡瘢痕化影响因素多元，年龄、种族、其他眼部疾病、身体状态、手术技巧等均也将影响这一病变过程。这些因素在作用疾病时，彼此间往往存在密切联系，而本次研究中仅单纯性针对HSP47进行了研究，故研究可能存在一定局限，这有待我们进一步完善。
综上所述，SD大鼠抗青光眼术后HSP47蛋白及mRNA的表达水平变化基本与Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、mRNA表达变化一致，表明HSP47参与着大鼠眼滤过泡瘢痕化这一过程，提示临床可从调控患者眼部HSP47表达而介入滤过泡瘢痕化的防治工作中。
参考文献
[1]戈严.羊膜移植应用于青光眼术后滤过泡瘢痕化疗效分析[J].河北医学,2014,01(07):1160-1162.
[2]饶婷,汪昌运.青光眼滤过术后抗瘢痕的研究进展[J].中国实用眼科杂志,2014,32(07):809-812.
论文作者:李颖邸红莲*
论文发表刊物:《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年8月第8期供稿
论文发表时间:2015/9/10
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