钟波[1]2001年在《酸性成纤维细胞因子对肾小管上皮细胞—肌成纤维细胞转分化影响的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：目前实验研究表明在建立大鼠肾衰模型的基础上，残肾小管-间质纤维化发展过程中有肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞形态及表型发生转分化现象。本文旨在研究酸性成纤维细胞因子对上皮-间质转分化的影响，探讨有丝分裂原激动蛋白激酶的ERK信号传导途径在此过程中的作用，为肾小管-间质纤维化的防治提供理论依据。 方法：将大鼠肾小管上皮细胞株（NRK）培养基内加或不加不同剂量重组人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）；并在玻璃表面或Ⅰ型胶原处理过的培养表面无血清培养6天。使用透射电镜、免疫细胞化学及western blot等方法对肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞形态及表型的转变进行评估，并对转分化过程中活性蛋白激酶ERK的含量行western blot分析。 结果：未加aFGF时，在玻璃或胶原处理的培养表面生长的NRK显示正常上皮细胞形态学特点。当加入aFGF的浓度达到50ng/ml且在胶原处理过的培养表面上呈离散生长时，细胞形态和表型发生改变：体积增大、失去尖端-基底极性和微绒毛、细胞延长、具有浸润特征的前后向双末端极性、出现肌动蛋白中间丝结构。免疫组化和western blot分析发现加入aFGF后角蛋白、E-钙黏附分子表达减少，纤粘连蛋白表达增加，同时有肌成纤维细胞的特异性标志物α-平滑肌动蛋白（α-SMA）的表达，α-SMA~+细胞数％（32.7±0.110）较无aFGF处理组（1.7±0.110）有显着性差异（P＜0.05）。 当细胞形态发生变化时，细胞内肌动蛋白中间丝沿转化的成纤维细胞突起分布。α-SMA阳性细胞的比例与介入aFGF的浓度正相关，亲和抗aFGF抗体可消除这种转分化现象。加入aFGF后，在玻璃表面α-SMA~+细胞数ou4．4土 0．090）较 1型胶原处理培养表面 aE啪”细胞数O门4．6士 0二 of）有显着差异（P＜0刀5）。当培养细胞达到融合状态时，加入 aFGF可促进细胞增殖而无形态及表型的变化。在上皮细胞向肌成纤维细胞转分化的过程中，细胞内活性ERK的含量与加入lGF的浓度正相关。 结论：aFGF在促进肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化的过程中有重要的意义，该过程亦与细胞的生长状态和生长环境有关，细胞外信号调节激酶ERK参与了该转化过程。本研究提示肾小管上皮细胞的表型转化是肾间质纤维化的重要原因，小管－间质转分化可能与a％F高表达以及ERK的激活有关。
陈朝青[2]2011年在《姜黄素抑制UUO大鼠肾小管上皮细胞转分化作用的实验研究》文中研究表明肾小管间质纤维化(Tubulointerstitial Fibrosis)是多种慢性肾脏病发展到终末期肾衰的共同途径。它以过量细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)(如胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型、纤维黏连蛋白和层黏连蛋白)在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征,导致正常肾结构的改变,随之肾功能丧失。肾小管上皮细胞转分化(Epithelial-mesenchymal Transition, EMT)是肾小管间质纤维化的重要发病机制之一,TGF-β/Smads信号转导途径是EMT的主要信号转导途径,在EMT过程中扮演着重要的角色。姜黄(Curcuma)为姜黄属植物,根茎入药,中医认为姜黄能行气、散风活血、通经止痛。姜黄素(Curcumin，Cur)是姜黄的最重要的活性成分。近些年来,姜黄素的降血脂、抗突变、抗癌、抗氧化、清除自由基等生理功能和作用机理相继被发现。本研究以EMT及其信号转导途径为靶点观察姜黄素的干预作用,对于阐明姜黄素防治肾小管间质纤维化的作用及机制具有重要意义。目的本研究围绕EMT及其信号转导途径(TGF-β/Smads信号转导途径),探讨姜黄素抑制或减缓肾小管间质纤维化的作用及机制,以期更加深入地了解细胞因子网络在EMT发生过程中的作用,为更好地开展中药抗肾小管间质纤维化的研究提供新思路和新方法。方法本研究采用单侧输尿管梗阻方法建立肾小管间质纤维化模型(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)。将32只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,姜黄素1组和姜黄素2组。对模型组和治疗组大鼠行左侧输尿管结扎建立单侧输尿管梗阻的动物模型。姜黄素1组于术后第2天给予姜黄素100mg-kg-1·d-1灌胃,姜黄素2组于术后第10天给予姜黄素100 mg-kg-1·d-1灌胃。术后28天处死大鼠,取梗阻侧肾脏,部分肾组织用4%多聚甲醛固定,其余肾组织放入液氮中保存备用,并进行以下实验研究。1.姜黄素对UUO大鼠肾脏病理学改变的实验研究采用HE染色和Masson染色观察各组大鼠梗阻侧肾脏病理学变化,及姜黄素对UUO大鼠病理学改变的影响,初步探讨姜黄素对肾小管间质纤维化的保护作用。2.姜黄素对UUO大鼠细胞外基质表达影响的实验研究观察姜黄素对UUO大鼠细胞外基质表达变化的影响,进一步探讨姜黄素的作用机制。分别采用免疫组化和实时荧光定量PCR,检测各组大鼠梗阻侧肾脏组织细胞外基质主要成分FN、Col-Ⅰ和Col-III蛋白及mRNA的表达变化。3.姜黄素干预肾小管上皮细胞转分化的实验研究免疫组化检测各组大鼠梗阻侧肾脏组织肾小管上皮细胞转分化的标志性蛋白a-SMA和E-cadherin的表达变化,观察姜黄素对UUO大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。4.姜黄素对UUO大鼠TGF-β/Smads信号转导途径影响的实验研究观察姜黄素对UUO大鼠肾小管上皮细胞转分化的TGF-β/Smads信号转导途径的影响。采用western-blot和实时荧光定量PCR,分别检测各组大鼠梗阻侧肾脏组织TGF-β/Smads信号转导途径的关键细胞因子TGF-β1、TβRⅠ、Smad2、Smand3和Smad7蛋白及mRNA的表达变化。结果①模型组大鼠肾脏皮、髓质变薄,肾间质增宽,炎性细胞浸润严重；肾小管病变严重,肾小动脉内膜增厚,管腔变窄；纤维化区域呈灶状分布,·病变严重的区域有肾小球聚集的现象,有明显的肾小管间质纤维化的特征,表明本实验造模成功。姜黄素治疗组大鼠肾间质损伤指数及肾组织胶原沉积相对面积均明显低于模型组。提示姜黄素具有减轻UUO大鼠肾组织病理改变,保护肾脏功能的作用。②UUO组大鼠肾组织中Col-Ⅰ,Col-Ⅲ和FN表达明显增强,姜黄素干预后Col-ⅠCo1-Ⅲ和FN的表达有明显降低。提示姜黄素可通过下调Co1-Ⅰ,Col-Ⅲ和FN在肾组织的表达,从而减少细胞外基质的过度聚集,抑制或减缓肾小管间质纤维化的发生和发展。③UUO组大鼠肾组织中a-SMA表达明显增强,E-cadherin表达明显减弱,姜黄素治疗组a-SMA表达与UUO组相比显着下降,E-cadherin表达显着升高。提示姜黄素可明显抑制EMT的发生和发展。④UUO组大鼠肾组织中Smad2和Smad3蛋白、TGF-β1蛋白及mRNA、TβRI mRNA的表达水平均明显上调,Smad7蛋白表达明显降低。姜黄素治疗组Smad2和Smad3蛋白、TGF-p,蛋白和nRNA、TβRI mRNA的表达水平与UUO组相比显着下降,Smad7蛋白表达显着升高。提示姜黄素可干预UUO大鼠TGF-β/Smads信号通路中多个位点,阻止EMT的发生,从而减轻肾小管间质纤维化。结论UUO诱导的大鼠肾小管间质纤维化进程中有明显的EMT病理过程。姜黄素可以明显减轻UUO大鼠的主要肾脏病理损害,降低肾间质中细胞外基质的表达水平,通过影响TGF-β/Smads信号转导途径中的多个细胞因子的表达,抑制EMT的进程,从而阻断或延缓肾小管间质纤维化的发生与发展。
詹晓丹[3]2017年在《参地补肾胶囊对高糖诱导的HK-2细胞转分化中ZO-1、α-SMA的影响》文中研究指明目的通过观察参地补肾胶囊含药血清对高糖诱导的人肾小管上皮(HK-2)细胞转分化中细胞形态学变化及对ZO-1、α-SMA表达的影响,从分子生物学水平探讨参地补肾胶囊干预肾小管上皮细胞转分化的机制。方法1.健康雄性SD大鼠40只,随机分成四组后,分别给予参地补肾胶囊、贝那普利、生理盐水连续灌胃7天,于末次灌胃2h后,制备大鼠含药血清。2.将体外培养的人肾小管上皮细胞随机分为四组,C组空白对照组(10%大鼠正常血清+K-SFM培养基+5.5m M D-葡萄糖)、H组高糖模型组(10%大鼠正常血清+K-SFM培养基+25m M D-葡萄糖)、B组贝那普利组(10%大鼠贝那普利药物血清+K-SFM培养基+25m M D-葡萄糖)、S组参地补肾组(10%大鼠参地补肾药物血清+K-SFM培养基+25m M D-葡萄糖),作用72h后,用倒置显微镜观察细胞形态学变化,用Western Blot方法检测ZO-1、α-SMA蛋白的表达情况,用Real Time PCR方法检测ZO-1m RNA的表达情况。结果1.各组细胞形态学变化:空白对照组细胞贴壁生长,细胞呈方形或多角形,细胞间紧密连接,形成典型“铺路石”样形态。高糖模型组细胞变大变长,呈梭型改变,表现为成纤维细胞样形态,细胞间隙变大,排列松散,大量细胞脱落,丧失原有“铺路石”样外观。贝那普利组及参地补肾组细胞接近空白对照组细胞,与高糖模型组比较,脱落细胞及“变形”细胞减少,细胞间隙缩小,大部分细胞仍呈贴壁生长,呈多边鹅卵石状。贝那普利组及参地补肾组细胞无明显差异。2.各组细胞ZO-1、ZO-1m RNA的表达情况:空白对照组细胞ZO-1呈高表达,高糖模型组、贝那普利组与参地补肾组表达量均低于空白对照组,差异有统计学意义(p<0.05);与高糖模型组比较,贝那普利组、参地补肾组ZO-1表达量均高于高糖模型组,差异有统计学意义(p<0.05),与贝那普利组比,参地补肾组ZO-1表达量更高,差异有统计学意义(p<0.05)。Real time PCR检测结果显示,与空白对照组比较,高糖模型组、贝那普利组及参地补肾组ZO-1m RNA表达量均低于空白对照组,高糖模型组与空白对照组差异有统计学意义(p<0.05),贝那普利组与空白对照组差异有统计学意义(p<0.05),参地补肾组与空白对照组差异无统计学意义(p>0.05);与高糖模型组比,贝那普利组及参地补肾组ZO-1m RNA表达量高于高糖模型组,差异有统计学意义(p<0.05),与贝那普利组比较,参地补肾组ZO-1m RNA表达量更高,差异有统计学意义(p<0.05)。3.各组细胞a-SMA的表达情况:空白对照组细胞a-SMA呈低表达,高糖模型组、贝那普利组、参地补肾组a-SMA表达均高于空白对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。与高糖模型组比,贝那普利组及参地补肾组a-SMA表达均低于高糖模型组,差异有统计学意义(p<0.05)。与贝那普利组比,参地补肾组a-SMA表达低于贝那普利组,有统计学意义(p<0.05)。结论1.参地补肾胶囊能够抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化。2.参地补肾胶囊可能是通过上调细胞ZO-1,下调α-SMA的表达延缓肾小管上皮细胞EMT。
王宇光[4]2010年在《加味升阳益胃汤对阿霉素肾病大鼠肾小管间质损害保护作用的实验研究》文中指出目的:通过实验研究观察补脾肾活血升阳除湿法组方加味升阳益胃汤对阿霉素肾病大鼠肾小管间质α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)及CTGFmRNA的影响,探讨此方对肾小管间质损害的保护性作用及其作用机理。方法:本实验采用尾静脉二次注射阿霉素建立模型。实验动物分为空白组、模型组、苯那普利组、中药低剂量组及中药高剂量组。观察实验大鼠治疗前后一般状态及肾功能情况;将肾组织病理切片进行HE、Masson染色,观察动物模型治疗前后的病理改变及肾间质病变情况;采用免疫组化半定量分析法检测肾小管间质中的α-SMA、VEGF及CTGF表达水平;采用原位杂交法检测肾小管间质CTGFmRNA表达水平。结果:1、实验10周末,与模型组比较,中药低、高剂量组、苯那普利组大鼠尿蛋白明显下降且差异显着(P<0.05),而中药组与苯那普利组比较差异不显着(P>0.05);2、实验10周末,与模型组比较,中药低、高剂量组及苯那普利组大鼠血肌酐、血尿素氮水平均有所降低且差异显着(P<0.05),中药组与苯那普利组比较差异不显着( P>0.05); 3、肾小管间质损害程度病理评分显示,与模型组比较,中药高剂量组的肾小管间质损害评分下降明显(P<0.05),而中药低剂量组及苯那普利组肾小管间质损害评分下降不明显(P>0.05);4、与模型组比较,中药低、高剂量组及苯那普利组肾间质中α-SMA和CTGF的过度表达均减少,肾间质中VEGF表达均增加,且差异显着(P<0.05),而中药组与苯那普利组比较差异不显着(P>0.05);5、与模型组比较,中药低、高剂量组及苯那普利组肾小管间质CTGFmRNA的表达均下调,且差异显着(P<0.05),而中药组与苯那普利组比较差异不显着(P>0.05);6、肾小管间质α-SMA、VEGF、CTGF的表达水平与肾小管间质损害程度及肾功能有明显相关性(P<0.05)。结论:1、补脾肾活血升阳除湿法组方加味升阳益胃汤能减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白排泄量;2、加味升阳益胃汤能下调肾小管间质α-SMA表达,从而抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞(间充质细胞)转分化来减轻肾小管间质损害;3、加味升阳益胃汤能下调肾小管间质组织CTGF及CTGFmRNA表达水平,并上调肾小管间质VEGF表达水平,从而减轻肾小管间质损害,延缓肾小管间质纤维化进展;4、补脾肾活血升阳除湿法组方加味升阳益胃汤通过多靶点、多部位干预对阿霉素肾病大鼠肾小管间质损害起到保护性作用。
丁跃玲[5]2004年在《肾络通对肾小管上皮细胞表型转化及其相关调控因素的影响》文中认为目的：慢性肾功能衰竭是一种严重危害人类身体健康的慢性进展性疾病，目前现代医学仍缺乏理想的治疗药物，在该病的防治中，中医药有着独特的优势，早中期采用中医中药及中西医结合综合治疗是目前公认的重要方法。肾络通是导师赵玉庸教授根据祖国医学理论，在总结多年肾脏疾病治疗经验的基础上，结合现代肾脏病理和药理研究，临床用于防治慢性肾功能衰竭的有效基本方剂。该方由黄芪、丹参、川芎、僵蚕、乌梢蛇、大黄等药物组成，具有益气活血，化瘀通络功能，临床和前期实验研究表明对延缓慢性肾功能衰竭、肾小球硬化、肾小管间质纤维化进程有较好疗效。为了进一步探讨中药肾络通对肾小管上皮细胞表型转化标及其相关调控因素的影响，我们开展了本系列研究。通过建立阿霉素诱导的大鼠肾小管间质纤维化模型，采用生化、光镜、电镜及放射免疫、免疫组化、原位杂交、流式细胞检测等方法，观察了该方对 ２４ｈ 尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、尿 ＮＡＧ、血β２－ＭＧ、尿β２－ＭＧ 等多项肾功能指标、肾组织病理形态学改变、肾小管上皮细胞超微结构变化、α－ＳＭＡ 表达及其相关调控因素肾素活性、血管紧张素Ⅱ、ＴＧＦ－β１ 、ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ、ｃ－ｆｏｓ 及细胞外基质 ＦＮ、ＬＮ 等的影响，并设西药缬沙坦组、病理模型组、假手术组进行对照，探讨了本方保护肾功能、防治肾小管间质纤维化的作用机制，为深化化瘀通络中药的研究，以及推广应用该方提供进一步的实验依据。 第一部分 肾络通对肾小管间质纤维化大鼠肾功能及肾组织病理形态学的影响 方法：纯系健康 ＳＤ 大鼠 ４５ 只，雄性，体重 １７０±１０ 克，适应性喂养一周，测尿蛋白阴性后，随机分为假手术组、病理模型组、肾络通组、缬沙坦组。造模方法采用单侧肾切除加阿霉素尾静脉重复注 1<WP=5>中 文 摘 要射复制肾小管－间质损伤模型。从第一次注射阿霉素后开始预防性治疗，病理模型组和假手术组给予等量蒸馏水灌胃。实验周期共 １０ 周。实验结束时，收集 ２４ 小时尿液，心脏取血，分离血清，冷藏待测；迅速取左肾称重，分别留取光镜和电镜标本。采用双缩脲法、苦味酸法、二乙酰一肟法、放射免疫法，分别测定 ２４ 小时尿蛋白定量、血肌酐（ＳＣｒ）、尿素氮（ＢＵＮ）、血β２－ＭＧ、尿β２－ＭＧ；尿 ＮＡＧ 测定用 ７２１分光光度计测吸光度，按说明书计算酶活力单位。肾组织光镜标本置４％多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋，３μｍ 厚切片， ＨＥ 染色、及 Ｍａｓｓｏｎ、ＰＡＳ 染色，光镜下观察肾脏皮质区及皮髓交界区肾小管及间质的结构及变化。电镜标本，以４％戊二醛固定，１％锇酸后固定，梯度脱水，丙酮置换，Ｅｐｏｎ８１２ 环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察肾小管近曲小管和远曲小管的超微结构。 结果： １ 一般情况、肾重／体重、２４ｈ 尿蛋白定量检测结果 病理模型组大鼠在第二次注射阿霉素后体重增长缓慢，甚至下降，毛色差，实验结束时，出现大量蛋白尿，肾脏体积增大。２４ 小时尿蛋白假手术组（２８．８５±１０．６８ｍｇ／２４ｈ），病理模型组（４２１．０６±１５２．７ｍｇ／２４ｈ），肾络通组（２９７．９６±３６．２４ ｍｇ／２４ｈ），缬沙坦组（３０３．３±８９．９６ｍｇ／２４ｈ），病理模型组显着高于假手术组（Ｐ＜０．０１）；肾络通组、缬沙坦组与病理模型组比较有明显降低（Ｐ＜０．０５）；其中肾络通组优于缬沙坦组但无显着性差异。肾重／体重假手术组（０．３７±０．０４％），病理模型组（１．４０±０．１８％），肾络通组（１．１０±０．０９％），缬沙坦组（１．３１±０．３４％）；病理模型组显着高于假手术组（Ｐ＜０．０１）；肾络通组与病理模型组比较有明显降低（Ｐ＜０．０５）；肾络通组与缬沙坦组比较无显着性差异。 ２ 血肌酐、尿素氮、尿 ＮＡＧ、血β２－ＭＧ、尿β２－ＭＧ 测定结果 血肌酐假手术组（１２８．２±１２．１０μｍｏｌ／ｌ），病理模型组（２２３．５±４８．０５μｍｏｌ／Ｌ），肾络通组（１４１．１１±２６．９８μｍｏｌ／Ｌ），缬沙坦组（２４３．３±５３．９９μｍｏｌ／Ｌ）；尿素氮假手术组（３．３８±０．３９ｍｍｏｌ／Ｌ），病理模型组（１３．２９±６．２４ ｍｍｏｌ／Ｌ），肾络通组（７．８６±２．１２ ｍｍｏｌ／Ｌ），缬沙坦组（１２．６３±４．６９ ｍｍｏｌ／Ｌ）；尿 ＮＡＧ 假手术组（８．３３±３．７６ ｕ／Ｌ）， 2<WP=6>中 文 摘 要病理模型组（３３．９７±９．３７ ｕ／Ｌ），肾络通组（２４．６１±５．１６ ｕ／Ｌ），缬沙坦组（２１．６１±８．６０ ｕ／Ｌ）；血β２－ＭＧ 假手术组（２．８８±０．４６μｇ／ｍｌ），病理模型组（３．３５±０．５０μｇ／ｍｌ），肾络通组（２．９１±０．２１μｇ／ｍｌ），缬沙坦组（３．１６±０．４６μｇ／ｍｌ）；尿β２－ＭＧ 假手术组（３．７５±０．?
张艳秋[6]2007年在《运动训练和红车轴草与芒柄花素磺酸钠对高脂膳食大鼠肾组织影响的实验研究》文中提出目的：探讨有氧运动以及红车轴草、芒柄花素磺酸钠在脂质肾损害中的保护作用和可能机制。方法：选取3月龄大鼠(由西安交通大学医学院动物管理中心提供)70只，体重220±20g。将实验大鼠随机分为7组，每组10只：安静对照组(A组)；高脂对照组(B组)；高脂+有氧运动组(C组)；高脂+芒柄花素磺酸钠磺组(D组)；高脂+芒柄花素磺酸钠+有氧运动组(E组)；高脂+红车轴草组(F组)；高脂+红车轴草+有氧运动组(G组)。安静对照组给予基础饲料，自由饮水；剩余6组用含2％胆固醇、10％猪油和0.5％胆酸钠的高脂饲料饲喂大鼠，建立高脂模型。高脂模型在高脂饲料饲喂四周后建立，从第5周开始，有氧运动组以及药物+有氧运动组的运动负荷为每周训练5d，递增速度为3m／min，时间5min，运动至速度为20m／min，时间为60min，保持其运动量，训练过程持续4周；在高脂饲料基础上，芒柄花素磺酸钠、芒柄花素磺酸钠+有氧运动组大鼠灌喂13.5mg／d／只，红车轴草、红车轴草+有氧运动组大鼠灌喂400mg／d／只，安静对照组代之以每日一次灌注等量生理盐水2ml。观察有氧运动、药物以及有氧运动+药物对大鼠血脂、肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质增生、肾小管间质细胞浸润、肾组织胶原等的影响；对肾组织细胞因子(TGF-β、VEGF、CTGF、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、OPN、NF-κB)、细胞骨架蛋白(Desmin、Vimentin、a-SMA)和细胞凋亡蛋白(Bax、Bcl-2)表达的影响，并探讨其可能的生物学机制。所有数据运用SPSS 13.0 for Windows软件包进行处理。统计学方法包括：One-Way ANOVA法，两两比较采用Independent-Samples T Test法。实验结果以平均数±标准差((?)±SD)表示。显着性差异选择P＜0.05和P＜0.01水平。结果：高脂组与安静对照组大鼠相比较，高脂膳食大鼠毛发无光泽、有脱落，并伴有活动减少、精神不振等现象，其体重较安静对照组明显增加(P＜0.01)；高脂膳食大鼠肾脂肪垫、附睾脂肪垫显着性高于安静对照组(P＜0.01)，大鼠肾脂肪垫／体重、附睾脂肪垫／体重之比有显着性差异(P＜0.05，P＜0.01)。高脂对照组大鼠血清TC和LDL显着性高于安静对照组(P＜0.01)；高脂膳食大鼠肾小球肥大明显，球内系膜细胞中重度增多，部分萎缩成分叶状改变，肾小球囊膜增厚，系膜区增宽；肾小管上皮细胞空泡样变性，间质肿胀，有大量单核细胞浸润。肾组织有明显的红染(VG染色)和蓝染(Masson染色)的胶原增生现象；高脂组大鼠肾组织TGF-β、VEGF、CTGF、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、OPN、NF-κB、Desmin、Vimentin、a-SMA和Bax的表达增加(P＜0.01)，Bax／Bcl-2比值增加(P＜0.01)。有氧运动组与高脂对照组比较，肾组织形态学变化较高脂组显着减轻。肾组织内有部分肾小球肥大，局部有少量空泡形成，球内系膜细胞轻、中度增多；肾小管上皮细胞有部分空泡样变性，有少量单核细胞浸润。Masson染色和VG染色显示肾间质和肾小球基质中有少量红染和蓝染的胶原纤维。有氧运动对高脂膳食大鼠肾组织TGF-β、CTGF、VCAM-1、MCP-1、OPN、NF-κB、Desmin、Vimentin、a-SMA和Bax的表达有明显的抑制作用，与高脂对照组比较显着性降低(P＜0.01)；而对肾组织VEGF和ICAM-1的表达没有显着的抑制作用(P＞0.05)。芒柄花素磺酸钠组与高脂对照组比较，肾组织形态学变化较高脂组显着减轻。肾组织内有部分肾小球肥大，局部有少量空泡形成，球内系膜细胞轻中度增多；肾小管上皮细胞有部分空泡样变性，有少量单核细胞浸润。Masson染色和VG染色显示肾间质和肾小球基质中有少量红染和蓝染的胶原纤维。芒柄花素磺酸钠干预对高脂膳食大鼠肾组织TGF-β、VEGF、VCAM-1、MCP-1、OPN、ICAM-1、Desmin、a-SMA和Bax的表达有明显的抑制作用，与高脂对照组比较明显着性降低(P＜0.01)；而对肾组织CTGF、NF-κB和Vimentin的表达则没有显着的抑制作用(P＞0.05)。芒柄花素磺酸钠+有氧运动组与高脂对照组比较，肾组织形态学变化较高脂组显着减轻。肾组织内偶见肾小球肥大，球内系膜细胞轻度增多；肾小管间质有少量单核细胞浸润。Masson染色和VG染色显示肾间质中有极少量红染和蓝染的胶原纤维。灌喂芒柄花素磺酸钠+有氧运动对高脂膳食大鼠。肾组织TGF-β、VEGF、ICAM-1、CTGF、VCAM-1、MCP-1、OPN、Desmin、Vimentin、a-SMA和Bax的表达有明显的抑制作用，与高脂对照组比较显着性降低(P＜0.01)，尤其对ICAM-1的抑制效果最明显，而对肾组织NF-κB的表达没有显着的抑制作用(P＞0.05)。红车轴草组与高脂对照组比较，肾组织形态学变化较高脂组显着减轻。肾组织内有部分肾小球肥大，局部有少量空泡形成，球内系膜细胞轻中度增多；肾小管上皮细胞有部分空泡样变性，有少量单核细胞浸润。Masson染色和VG染色显示肾间质和肾小球基质中有少量红染和蓝染的胶原纤维。红车轴草干预对高脂膳食大鼠肾组织TGF-β、VEGF、VCAM-1、MCP-1、OPN、CTGF、NF-κB、ICAM-1、Desmin、a-SMA和Bax的表达有明显的抑制作用，与高脂对照组比较显着性降低(P＜0.01)，尤其对ICAM-1的抑制效果最明显，而对肾组织Vimentin的表达则没有显着的抑制作用(P＞0.05)。红车轴草+有氧运动组与高脂对照组比较，肾组织形态学变化较高脂组显着减轻。肾组织内偶见肾小球肥大，球内系膜细胞轻度增多；肾小管间质有少量单核细胞浸润。Masson染色和VG染色显示肾间质中有极少量红染和蓝染的胶原纤维。灌喂红车轴草+有氧运动对高脂膳食大鼠肾组织TGF-β、VEGF、ICAM-1、CTGF、VCAM-1、MCP-1、OPN、Desmin、Vimentin、NF-κB、a-SMA和Bax的表达有明显的抑制作用，与高脂对照组比较显着性降低(P＜0.01)，尤其对ICAM-1、OPN的抑制效果最为显着。灌喂红车轴草与灌喂芒柄花素磺酸钠相比较，对脂质沉积造成的肾组织形态学变化都有一定的保护作用。而在对脂质沉积造成肾组织细胞因子释放方面存在着差异：红车轴草干预组在抑制肾组织细胞因子VEGF、TGF-β、CTGF、NF-κB和a-SMA的表达上，效果显着性优于芒柄花素磺酸钠组(P＜0.01)；两组对ICAM、VCAM、MCP-1、OPN、Desmin和Vimentin的表达抑制上没有显着性差异。而芒柄花素磺酸钠组大鼠肾组织Bax的表达以及Bax／Bcl-2的比值显着性低于红车轴草组(P＜0.01，P＜0.05)。结论：1有氧运动对高脂膳食造成的肾损伤有一定保护作用，能够减轻高脂血症造成的大鼠肾组织形态结构的变化，并抑制促肾组织纤维化细胞因子的释放。2芒柄花素磺酸钠、红车轴草同属于异黄酮类化合物，对降血脂均有一定的作用，能够减轻高脂血症造成的大鼠肾组织形态结构的变化，并能抑制肾组织损伤过程中一些炎症因子、细胞生长因子的释放。其中，在抑制肾组织细胞因子VEGF、TGF-β、CTGF、NF-κB和a-SMA的表达上，红车轴草干预组效果显着性优于芒柄花素磺酸钠组(P＜0.01)；而芒柄花素磺酸钠组大鼠抑制肾组织细胞凋亡效果优于红车轴草组；两组对肾组织ICAM、VCAM、MCP-1、OPN、Desmin和Vimentin的表达抑制上没有显着性差异。3芒柄花素磺酸钠+有氧运动、红车轴草+有氧运动组对保护高脂血症造成的肾损伤效果最为显着。从肾组织形态学观察以及抑制促肾组织纤维化因子的释放，效果优于单纯有氧运动及单纯药物组。提示两类异黄酮类化合物以及有氧运动干预对大鼠脂质性肾损害有一定的保护作用。可能因为异黄酮类化合物以及有氧运动能够降血脂，并通过减少脂质沉浸和过氧化反应以及炎症细胞浸润等，从而抑制肾小球系膜细胞、内皮细胞以及细胞外基质的增殖和肾小管细胞的表型转化。
李丽[7]2010年在《PAX2基因沉默在梗阻性肾病肾小管上皮细胞转分化中作用机制的研究》文中研究指明前言梗阻性肾病(Obstructive nephropathy)是由于泌尿道结构和(或)功能改变,阻碍尿液的排出,导致肾实质病理和功能损害的临床综合征。梗阻性肾病不是一个独立原发病,是由不同病因疾病引起的共同临床表现。梗阻性肾病是引起儿童慢性肾衰竭常见的原因。据北美统计,儿童梗阻性肾病占儿童终末期肾脏疾病的0.3%,占儿童肾移植的16.1%,这给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此,延缓、阻止甚至逆转梗阻性肾病的进展具有重大的经济和社会意义。许多学者通过体内外实验研究表明,肾间质纤维化是梗阻性肾病最终的共同途径。迄今为止,虽然对肾小管间质纤维化进行了大量的研究,但对其发生机制仍未完全阐明,目前认为肾小管上皮细胞-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肾间质纤维化的重要发病机制之一。肾脏损伤后组织病变过程类似于胚胎后肾发育过程的重演,即成熟肾脏在病理状态下,一些在肾脏胚胎发育过程中高表达的因子、蛋白(prepro-EGF、Tamm-Horsfall protein、PAX-2 protein等)重新高表达,并且转分化表达胚胎间充质细胞表型,而丧失成熟细胞的标志,这一过程类似于胚胎肾的生理发育过程中后肾间充质细胞向上皮细胞转化(mesenchymal epithelial transition, MET)的逆转。PAX2 (Paired Box2)基因编码核转录因子,是肾脏胚胎发育过程中诱导肾小管上皮细胞转分化的关键性发育基因之一,在前、中、后肾发育的全过程中表达,参与胚胎肾脏各个发育阶段的调控,成熟肾单位PAX2表达消失。近来发现,PAX2在肾间质纤维化模型中出现重新表达,但在PAX2的表达部位以及PAX2的重新表达对肾损害的影响方面存在分歧。单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)造成肾梗阻是诱导肾间质纤维化经典的模型,是目前应用最为广泛的研究肾间质纤维化发生机制、肾脏细胞转分化和评价肾纤维化治疗方法的实验动物模型。本研究建立UUO大鼠模型明确PAX2表达的具体部位,以及重新表达与梗阻性肾病肾间质纤维化之间的关系；并应用RNA干扰技术沉默梗阻性肾病大鼠肾小管上皮细胞PAX2基因,探讨PAX2基因沉默对肾间质纤维化程度及肾功能的影响,阐明PAX2基因沉默在肾小管上皮细胞转分化中的作用。材料和方法一、动物模型与分组雄性Wistar大鼠168只(120-150克,4-6周),购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心。以随机排列表法随机分为：模型组(UUO)32只和假手术组(sham组)32只,于术后3d、5d、7d、14d分为4组,每组8只；根据siRNA的设计的位点不同分为五组,即siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和阴性对照组,每组8只；沉默组(RNAi)32只和阴性对照组(NC)32只,于转染后3d、5d、7d、14d分为4组,每组8只。模型组(UUO组)：以单侧输尿管结扎制作梗阻性肾病模型,10%的水合氯醛(300 mg／kg)腹腔注射麻醉后,行左侧耻骨上切口,沿左肾下极寻找到左输尿管,用4-0号丝线上下结扎两处,从中剪断输尿管以防逆行性感染,分层缝合关闭腹腔。假手术组(sham组)：分离输尿管不结扎,随即缝合腹腔。siRNA1、siRNA2. siRNA3. siRNA4口阴性对照组：在制作模型后,立即将装有200μl PAX2-siRNA-invivo jetPEI复合物注入肾被膜下,分层缝合关闭腹腔。沉默组(RNAi):在制作模型后,立即将装有200μl PAX2-siRNA3-invivo jetPEI复合物注入肾被膜下,分层缝合关闭腹腔。阴性对照组(NC)：在制作模型后,立即将装有200μl NC-siRNA-invivo jetPEI复合物注入肾被膜下,分层缝合关闭腹腔。二、标本的采集和处理1、肾组织各组大鼠于术后或转染后3d、5d、7d、14d给予10%水合氯醛0.3ml／kg腹腔注射麻醉,处死大鼠。腹部常规消毒,无菌条件下留取左侧肾组织,以无菌生理盐水冲洗,剥离表面脂肪,滤纸吸干表面水分,一部分置4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,待做病理形态学检测和免疫组化。一部分剥离表面脂肪后分离肾脏皮质和髓质,包入无菌锡纸中置液氮罐内,再转移至-80℃冰箱,待做实时荧光定量PCR和Western blot。2、尿大鼠于转染后1d、2d、3d、5d、7d和14d置于代谢笼中收集24小时尿液,新鲜尿样以3000rpm速度离心15min,去沉渣,-80℃冰箱保存,用以测尿β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)含量。3、血大鼠转染后1、2d末在乙醚实施浅麻醉下用毛细玻璃管采大鼠内呲静脉血1ml采血；转染后3d、5d、7d和14d末腹主动脉采血4ml,3000转／分离心,血清置于-80℃冰箱保存,用以测血肌酐含量。叁、实验方法及检测指标1、各组动物在不同时间点的大体观察,包括肾脏颜色,表面是否光滑,包膜是否完整,有无肾积水、肾实质变薄、肾盂肾盏受压等。2、HE染色光镜观察肾小管间质损伤程度。3、Masson染色光镜观察肾间质纤维化程度。4、免疫组化法测肾皮质PAX2、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。5、Western blot法测定肾皮质PAX2、E-cadherin和α-SMA蛋白相对表达量。6、实时荧光定量PCR法测肾皮质(?)PAX2mRNA、E-cadherin mRNA和α-SMA mRNA的相对表达量。7、肾功能检测：尿β2-MG含量与血肌酐含量,采用中国医科大学附属盛京医院检验科全自动生化分析仪一次性检测。8、荧光显微镜观察PAX2-FAM-siRNA-PEI在肾组织内转染情况。四、统计学分析实验数据采用均数士标准差表示,应用SPSS13.0统计软件,组间比较采用t检验,各组内比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两变量相关分析采用Pearson相关分析,P<0.05有统计学意义。结果一、肾组织形态学改变(一)大体观察UUO组大鼠肾脏随着时间延长体积逐渐增大,颜色变灰白、无光泽,表面不光滑,颗粒感明显,可见肾积水,肾实质变薄,肾盂扩张,肾盏乳头受压,穹隆部乳头变平钝,部分成凹型；sham组大鼠肾脏呈深红色,表面光滑,包膜完整,与肾实质不粘连,切面皮髓分界清晰。(二)光镜下肾脏病理变化HE和Masson染色观察到尿路梗阻后肾脏纤维化表现：肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润；肾小管扩张、萎缩、管腔塌陷；肾间质增宽、胶原纤维的沉积等。证明本实验UUO模型造模成功。二、PAX2蛋白和mRNA在UUO大鼠肾脏中的表达情况免疫组化观察sham组PAX2蛋白在肾小管上皮细胞无表达,在集合管上皮细胞核内较多表达；UUO组术后3d在肾小管上皮细胞可见PAX2蛋白表达,术后14d表达更加明显(P<0.05)；且显着高于sham组(P<0.05)。Western blot结果显示,PAX2蛋白水平在UUO组术后3d相比sham组明显的增加(P<0.05),随着梗阻时间延长PAX2蛋白表达更加明显；Realtime PCR结果显示,PAX2 mRNA与PAX2蛋白的表达趋势相同。叁、PAX2蛋白与肾间质纤维化程度的相关性分析PAX2蛋白表达量与肾小管损伤评分和肾间质相对面积进行Pearson相关分析,结果表明：PAX2蛋白与肾小管损伤程度呈正相关(r=0.991,P<0.05)和肾间质纤维化程度呈正相关(r=0.985,P<0.05)。四、PAX2-siRNA-PEI复合物的筛选与鉴定(一) PAX2-siRNA-PEI在肾组织内转染情况FAM-siRNA-PEI和NC-siRNA-PEI注射体内3天后取肾脏,立即制作冰冻切片,放置于荧光显微镜下观察,注射FAM-siRNA-PEI的肾脏内可见肾小管周围存在绿色荧光,注射NC-siRNA-PEI'肾脏未见荧光。(二) PAX2-siRNA-PEI对PAX2 mRNA和蛋白的抑制效果利用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测肾组织PAX2 mRNA及蛋白表达,四对干扰序列均有不同程度的抑制肾皮质]PAX2 mRNA及蛋白的表达,其中siRNA3位点对PAX2干扰效果最强,mRNA及蛋白抑制分别达到55%和81%。五、PAX2-siRNA3-PEI转染后各时间点PAX2基因沉默的鉴定化学合成的PAX2-siRNA3和阴性对照siRNA与in vivo jetPEI复合物转染UUO大鼠体内,荧光定量PCR和Western blot检测转染后不同时间点PAX2 mRNA和蛋白表达,结果沉默组与同期对照组相比PAX2 mRNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05)。六、PAX2基因沉默对肾间质纤维化程度及肾功能的影响(一)肾间质纤维化程度HE和Masson染色观察到对照组随梗阻时间延长,肾小管病变逐渐加重,肾间质增宽明显,大量胶原纤维增生,胶原沉积更加显着。沉默组与同期对照组3d、5d、7d相比无明显变化(P>0.05)；在14d时沉默组与对照组相比肾小管扩张程度减轻、间质病变程度减低、胶原沉积程度显着降低、纤维化进程明显延缓(P<0.05)。(二)肾功能本实验分别于转染后第1d、2d、3d、5d、7d、14d末采血和留尿,检测对照组和沉默组大鼠血肌酐与尿β2-MG含量,结果显示：对照组和沉默组在转染后各时间点血肌酐水平有所波动,但无统计学差异(P>0.05)；尿β2-MG含量两组均从转染后第5d开始升高,沉默组与同期对照组相比在第1d、2d、3d、5d和7dβ2-MG含量无差异,第14d是沉默组明显低于对照组。七、UUO大鼠肾小管上皮-间充质转化(EMT)免疫组化、Western blot和实时荧光定量PCR法检测E-cadherin与a-SMA蛋白和mRNA表达,UUO组术后3d E-cadherin蛋白和mRNA的相对表达量减少,α-SMA蛋白和(?)nRNA的相对表达量增加；随着梗阻时间的延长E-cadherin表达量逐渐降低,α-SMA表达量逐渐增加；术后14d在肾皮质E-cadherin仅见微量表达,α-SMA表达显着,与sham组比较有统计学差异(P<0.05)；而UUO组各时间点的E-cadherin与α-SMA蛋白和mRNA的相对表达量比较有统计学差异(P<0.05)。八、PAX2基因沉默对UUO大鼠肾小管EMT的影响对照组随着梗阻时间的延长,E-cadherin蛋白和mRNA表达量逐渐下降,a-SMA蛋白和mRNA表达量逐渐升高；沉默组与同期对照组相比各指标在转3d、5d和7d无差异(P>0.05),在转染14d时,沉默组E-cadherin蛋白和mRNA相对表达量明显高于对照组(P<0.05),a-SMA蛋白和mRNA相对表达量明显低于对照组(P<0.05)。结论1、胚胎发育基因PAX2在梗阻性肾病大鼠肾小管上皮细胞存在重新表达,随着梗阻时间的延长PAX2表达更加明显。2、PAX2蛋白表达水平与肾小管损伤程度和肾间质纤维化程度呈正相关。3、In vivo jetPEI介导PAX2-siRNA注射大鼠肾被膜下可成功到达肾实质内。4、实时荧光定量PCR及Western blot技术检测转染后肾皮质的PAX2mRNA及蛋白表达,四对干扰序列均有不同程度的抑制作用,其中siRNA3位点对PAX2干扰效果最强,mRNA及蛋白抑制分别达到55%和81%。5、PAX2基因沉默在梗阻早期对肾间质纤维化程度的改变无明显作用,在梗阻的晚期可延缓其肾间质纤维化的进程、减轻肾小管损伤程度,对肾间质纤维化有明显治疗作用。6、PAX2基因沉默在梗阻晚期可以降低UUO大鼠尿中β2-MG含量,改善肾功能。7、UUO大鼠模型随着梗阻时间的延长,E-cadherin mRNA和蛋白的表达逐渐下降、α-SMA mRNA和蛋白的表达逐渐增加,即肾小管上皮细胞发生了EMT。8、PAX2基因沉默在梗阻早期对EMT无影响,在晚期可抑制肾小管EMT的过程,延缓肾间质纤维化的进程。9、PAX2在UUO大鼠模型肾小管上皮细胞重新表达具有修复损伤或加重病变的双重细胞生物学意义。
曹旭[8]2014年在《基于wnt通路研究肾阳虚型慢性肾衰竭大鼠肾小管上皮细胞稳态失衡机制》文中提出目的基于Wnt通路探讨肾阳虚型慢性肾衰竭大鼠肾小管上皮稳态失衡的生物学机制。方法实验动物分为4组：正常组、腺嘌呤组、氢化可的松组和单侧输尿管结扎手术（UUO）组，各组大鼠用相应的方法制造模型。1、观察各组大鼠造模后一般情况；2、自动生化仪检测各组大鼠的24小时尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮；3、放免法检测各组大鼠血促肾上腺皮质激素（ACTH）、促甲状腺素（TSH）值；4、肾组织病理切片进行HE、Masson染色，观察病理变化；5、免疫组化法检测各组大鼠肾组织Wnt2b、β-catenin、E-cadherin及α-SMA的表达。结果1、腺嘌呤组、氢化可的松组大鼠出现食少、多尿，逐渐出现精神萎靡、体重减轻等阳虚表现。2、与正常组比较，腺嘌呤组24h尿蛋白、血清尿素氮和血清肌酐均有较为显着升高（P<0.01），UUO组24h尿蛋白有显着性升高（P<0.05）、血清尿素氮和血清肌酐均有较为显着升高（P<0.01）；腺嘌呤组比UUO组24h尿蛋白显着性升高（P<0.05）。3、与正常组比较，腺嘌呤组、氢化可的松组血清TSH含量有较为显着降低（P<0.01），血浆ACTH有显着性降低（P<0.05）。4、病理显示：腺嘌呤组肾组织损伤严重，UUO组损伤较轻。部分肾体积明显增大，颜色苍白，肾间质增宽炎细胞浸润，成纤维细胞及胶原纤维增多，肾小管萎缩，肾小管基底膜较薄，肾间质水肿，部分近端小管管腔内可见脱落坏死的上皮细胞，纤维化区域呈灶状分布。其中腺嘌呤组还可见腺嘌呤代谢结晶占据大部分肾小球和肾小管。Masson染色见模型组肾小管结构明显被破坏，胶原明显增多。UUO组中肾小管上皮出现明显的凋亡细胞和凋亡小体，且数目的动态变化与肾小管萎缩的规律一致。氢化可的松组及正常组病理形态基本正常。5、与正常组比较，腺嘌呤组、UUO组的E-cadherin平均光密度值有显着性降低（P<0.05），腺嘌呤组、UUO组的α-SMA和β-catenin平均光密度值均有显着性升高（P<0.05），UUO组的Wnt2b有显着性升高（P<0.05）。结论由腺嘌呤诱导的模型大鼠存在慢性肾功能衰竭的同时伴有肾阳虚的表现；氢化可的松造模大鼠仅仅有肾阳虚表现而无肾功能损害；UUO组大鼠存在肾小管间质纤维化而无肾阳虚；肾小管上皮转分化在慢性肾衰竭过程起重要作用；Wnt/β-catenin通路异常是肾小管上皮细胞稳态失衡的重要信号。
周秋根[9]2005年在《人肾小管上皮—间充质细胞转化过程中VEGF及其受体表达变化的实验研究》文中进行了进一步梳理夕名中国偏矛，臂料天李中国奇檬封管托博士研究生学位论文中国协和医科大学研究生院中国协和医科大学博士研究生论文论文题目:
何春梅[10]2007年在《血管内皮生长因子（VEGF）对肾小管上皮—间充质细胞转化的作用及机制探讨》文中研究指明第一部分血管内皮生长因子(VEGF)对肾小管上皮-间充质细胞转化的作用及其与BMP-7、Id变化的关系目的肾小管上皮细胞-间充质转化(epithelial-myofibroblast transition,EMT)是肾间质纤维化主要的细胞分子机制之一。TGF-β1是主要的致纤维化因子之一,而骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)则可维持肾小管上皮细胞功能,逆转EMT。TGF-β1致鼠乳腺上皮细胞分化抑制因子(inhibitor of DNAbinding/differentiation,Id)表达的下调,可能是诱导其发生EMT的机制之一。而BMP-7可上调Id表达,逆转晶状体上皮发生的EMT。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)是调节血管发生的基本生长因子,其对肾小管上皮细胞表型具有保护作用,但机制尚不明确。本研究探讨VEGF对肾小管上皮EMT的作用及其与BMP-7、Id2及Id3变化的关系。方法实验一观察不同浓度的VEGF对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)发生EMT的影响及BMP-7、Id的变化,分组为:(1)正常对照组;(2)TGF-β1(5ng/ml)阳性对照组;(3)TGF-β1+VEGF_(165)共同作用组:TGF-β1(5ng/ml)与不同剂量VEGF_(165)(0.1、1、10、100ng/ml)共同作用,各组作用时间均为48h,免疫组化双染方法检测各组HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达情况,Western Blot法检测各组细胞α-SMA、BMP-7、Id2及Id3蛋白水平。实验二分别观察VEGF、VEGFR1抗体对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)发生EMT的影响及BMP-7、Id的变化,分组为:(1)正常对照组;(2)TGF-β1(5ng/ml)阳性对照组;(3)VEGF_(165)(100ng/ml)作用组;(4)VEGFR1抗体(10μg/ml)作用组;(5)TGF-β1(5ng/ml)+VEGF_(165)(100ng/ml)共同作用组;(6)TGF-β1(5ng/ml)+VEGFR1抗体(10μg/ml)共同作用组,各组作用时间均为48h,免疫组化双染方法检测各组HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达情况,Real-time PCR法、Western Blot法检测各组细胞α-SMA、BMP-7、Id2、Id3mRNA及蛋白水平。实验叁观察中和内源性的BMP-7后,VEGF对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)发生EMT影响的变化及Id2的变化,HK-2细胞分组为:(1)正常对照组;(2)TGF-β1(5ng/ml)阳性对照组;(3)VEGF_(165)(100ng/ml)作用组;(4)Alk6/Fc chimera(2ug/ml)作用组:Alk6/Fc chimera可与内源性BMP-7结合从而抑制其活性;(5)TGF-β1(5ng/ml)+VEGF_(165)(100ng/ml)共同作用组;(6)TGF-β1(5ng/ml)+Alk6/Fc chimera(2ug/ml)共同作用组;(7)VEGF_(165)(100ng/ml)+Alk6/Fc chimera(2ug/ml)共同作用组;(8)TGF-β1(5ng/ml)+VEGF_(165)(100ng/ml)+Alk6/Fc chimera(2ug/ml)共同作用组,各组作用时间均为48h,Western Blot法检测细胞α-SMA、Id2水平。结果免疫组化双染、Real-time PCR、Western Blot方法均显示,TGF-β1阳性对照组较正常对照组α-SMA mRNA及蛋白表达水平显着增强(P＜0.05),而E-cadherin表达显着减弱,BMP-7、Id2及Id3mRNA及蛋白表达水平显着降低(P＜0.05)。TGF-β1+VEGF_(165)(10、100ng/ml)共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMA蛋白表达水平显着降低(P＜0.05),而E-cadherin表达则有部分恢复,BMP-7及Id2蛋白水平显着升高(P＜0.05),Id3蛋白水平无显着变化。VEGF_(165)以浓度依赖方式增强HK-2细胞BMP-7及Id2蛋白表达。TGF-β1+VEGFR1抗体(10μg/ml)共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMA mRNA及蛋白表达水平进一步增强(P＜0.05),而E-cadherin表达则几乎消失,BMP-7、Id2 mRNA及蛋白表达水平进一步降低(P＜0.05),Id3 mRNA及蛋白表达水平无显着变化。TGF-β1+VEGF_(165)(100ng/ml)+Alk6/Fc chimera(2ug/ml)共同作用组同TGF-β1+VEGF_(165)(100ng/ml)共同作用组比较,α-SMA蛋白表达增强(P＜0.05),而Id2蛋白表达无显着变化。结论VEGF_(165)可抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生的EMT,其机制可能与BMP-7和Id2表达的上调有关,而与Id3的表达变化无关;且VEGF_(165)可能具有直接的上调Id2表达的作用,而与BMP-7变化无关。第二部分血管内皮生长因子(VEGF)对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化过程中Smad2、Smad3途径的影响目的血管内皮生长因子(VEGF)对维持血管内皮细胞生存、再生及其功能稳定发挥关键作用。TGF-β1通过Smads信号转导途径参与调节肾小管上皮细胞转化,其中Smad2、Smad3的磷酸化是关键步骤。研究表明,VEGF可下调TGF-β刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)Smad2/3的磷酸化水平,发挥抑制TGF-β的作用,但对肾小管上皮细胞Smads作用如何尚不清楚。本研究探讨VEGF在TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT的过程中对Smad2、Smad3途径的影响。方法分两个步骤进行:实验一观察不同浓度的VEGF对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)发生EMT的影响及Smad2/3磷酸化水平的变化,分组为:(1)正常对照组;(2)TGF-β1(5ng/ml)阳性对照组;(3)TGF-β1+VEGF_(165)共同作用组:TGF-β1(5ng/ml)与不同剂量VEGF_(165)(0.1、1、10、100ng/ml)共同作用,各组作用时间均为48h,Western Blot法检测各组细胞α-SMA、p-Smad2/3和Smad2/3蛋白水平。实验二分别观察VEGF、VEGFR1抗体对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)发生EMT的影响及Smad2/3磷酸化水平的变化,分组为:(1)正常对照组;(2)TGF-β1(5ng/ml)阳性对照组;(3)VEGF_(165)(100ng/ml)作用组;(4)VEGFR1抗体(10μg/ml)作用组;(5)TGF-β1(5ng/ml)+VEGF_(165)(100ng/ml)共同作用组;(6)TGF-β1(5ng/ml)+VEGFR1抗体(10μg/ml)共同作用组,各组作用时间均为48h,Real-time PCR方法检测HK-2细胞α-SMAmRNA表达情况,Western Blot法检测各组细胞p-Smad2/3和Smad2/3蛋白水平。结果实验一Western Blot方法显示,TGF-β1阳性对照组HK-2细胞较正常对照组α-SMA蛋白表达水平显着增强(P＜0.05),同时细胞(p-Smad2/3)/(Smad2/3)二者比值即Smad2/3磷酸化水平升高(P＜0.05);TGF-β1与不同浓度VEGF_(165)(0.1、1、10、100ng/ml)共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMA蛋白表达水平及(p-Smad2/3)/(Smad2/3)二者比值即Smad2/3磷酸化水平呈下降趋势,表现为剂量依赖性,较高浓度的VEGF_(165)(10、100ng/ml)共同处理组有显着性差异(P＜0.05)。实验二Real-time PCR方法及Western Blot方法显示,TGF-β1与VEGFR1抗体(10μg/ml)共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMAmRNA表达水平进一步增强(P＜0.05),同时细胞(p-Smad2/3)/(Smad2/3)二者比值即Smad2/3磷酸化水平进一步升高(P＜0.05)。结论VEGF_(165)可呈剂量依赖性抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生的EMT,其机制可能与磷酸化的Smad2/3表达下调有关。第叁部分麦考酚酸酯对大鼠肾间质纤维化和肾小管上皮-间充质转化的作用及机制探讨目的麦考酚酸酯(Mycophenolate mofetil,MMF)是一种免疫抑制剂,其代谢产物麦考酚酸可高度选择性、非竞争性、可逆性地抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)。MMF主要用于治疗免疫性疾病,近年实验研究表明,MMF具有抗纤维化的作用,但其机制尚不明确。本研究探讨MMF对腺嘌呤致大鼠慢性肾衰模型的肾间质纤维化及肾小管上皮-间充质转化(EMT)的作用,以及该作用同肾组织血管内皮生长因子(VEGF)及分化抑制因子(Id2、Id3)变化的关系。方法雄性Wistar大鼠64只,分为3组:1、正常组(n=16);2、慢性肾衰(CRF)模型组(n=24):腺嘌呤125mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃;3、MMF治疗组(n=24):腺嘌呤125mg·kg~(-1)·d~(-1)+MMF15mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃。分别于第2、4、6、8周处死动物,处死前1天留取24小时尿,检测尿蛋白。处死前心脏取血,生化自动分析仪检测血肌酐值。同时留取肾组织,HE和Masson染色行肾间质纤维化程度评分;免疫组化法检测肾组织α-SMA、TGF-β1表达情况;RT-PCR方法检测肾组织TGF-β1、VEGFmRNA水平的表达情况;Western Blot方法检测肾组织α-SMA、VEGF、Id2、Id3蛋白水平的表达情况。结果随腺嘌呤给药时间延长,MMF治疗组与CRF模型组血肌酐逐渐升高,与正常组比较差异显着(P＜0.01),但MMF治疗与CRF两组间无显着性差异(P＞0.05)。MMF治疗组在第6、8周,24小时尿蛋白水平较CRF模型组下降(P＜0.01)。同正常组比较,CRF模型组与MMF治疗组在第6、8周肾间质纤维化程度明显加重(P＜0.01),且MMF治疗组肾间质纤维化程度较CRF模型组均减轻(P＜0.01)。同正常组比较,CRF模型组及MMF治疗组肾组织α-SMA表达水平在第6、8周明显增强(P＜0.01),且MMF治疗组肾组织α-SMA表达水平较CRF模型组降低(P＜0.01)。同正常组比较,CRF模型组及MMF治疗组肾组织TGF-β1表达增加(P＜0.05),MMF治疗组较CRF模型组降低,在第2、4、6周有显着差异(P＜0.01)。同正常组比较,在第8周CRF模型组肾组织VEGF蛋白表达下降(P＜0.01),MMF治疗组肾组织VEGF表达在第6、第8周显着高于CRF模型组(P＜0.01)。MMF治疗组肾组织Id2、Id3表达较CRF模型组增强,在第4、6周差异显着(P＜0.05)。结论在腺嘌呤致大鼠慢性肾衰模型中,麦考酚酯酸具有减轻肾间质纤维化的作用,该作用可能与抑制肾小管上皮细胞转分化、肾组织TGF-β1表达的下调及VEGF、Id2、Id3表达的上调有关,其确切机制需进一步探讨。
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