牛利国[1]1998年在《抗人肝癌单链抗体基因的克隆表达及活性鉴定》文中研究指明基因工程抗体的研究带动了肝癌导向治疗的发展，近年来已有不少鼠源性抗肝癌单克隆抗体或抗体片段用于肝癌的珍断及免疫治疗，显现了在肝癌诊断及治疗上的潜质。但鼠源性单抗的免疫原性限制了它的临床应用，而基因工程抗体可以克服鼠源性单抗的主要缺点，显示了良好的应用前景。本文的目的就是克隆抗肝癌单链抗体的基因，在大肠杆菌中进行表达，获得具有肝癌特异结合活性的单链抗体，为其在治疗上的应用打下基础。 本文采用RT-PCR方法从可分泌抗人肝癌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞HAb18中克隆出抗体可变区基因，所克隆重轻链基因分别长363bp和342bp，基因内无终止码，为开放读框，分别编码121个和113个氨基酸，含三个CDR区和四个FR区，并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸。计算机网上(blast)分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性。表明所克隆基因为功能性重排的小鼠抗体可变区基因。
温伟红[2]2003年在《人抗HBsAg单链抗体基因的构建、表达及其表达产物的活性鉴定》文中提出目的 构建人抗HBsAg单链抗体基因，在真核细胞和原核细胞中进行表达，并对其表达产物的活性进行鉴定。 方法 以从噬菌体抗体库中筛选获得的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增出其轻、重链可变区(V_L、V_H)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly_4Ser)_3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L-V_H-Linker-V_L结构的单链抗体基因。 将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N3，瞬时转染COS-7细胞，分析其表达情况。稳定转染Jurkat细胞，建立稳定表达ScFv融合蛋白的细胞系，并分析其表达产物的活性。 将获得的不含前导肽的单链抗体基因克隆入HA和6His融合的原核表达载体pTAT-HA，在大肠杆菌BL21中进行表达，分析其表达情况。表达产物并经NiNTA柱纯化后，分析其活性。 结果 经测序表明，前导肽、连接肽、V。及V。的序列正确，经酶切鉴定证实成功地构建了绿色荧光蛋白基因融合表达载体。瞬时转染COS刁细胞后，通过荧光显微镜观察、间接免疫荧光检测、免疫组化检测证实了SCFV融合蛋白的表达。稳定转染 Jurkat细胞，经 G4筛选，建立了稳定表达 ScFv融合蛋白的细胞系。建系细胞裂解产物和浓缩的培养上清经SDS－PAGE及Western Blot分析，证实了ScFv融合蛋白的分泌性表达。间接ELISA检测证实所表达的单链抗体具有与HBSAg结合的特异性。建系细胞培养上清与肝癌细胞作用后，经荧光显微镜观察、间接免疫荧光及流式细胞仪检测进一步确定表达的SCFV融合蛋白具有与HBSAg特异性结合的活性。 经酶切鉴定证实原核表达载体pTAT爿ASCFV构建成功。在大肠杆菌BLZI中实现了 SCFV融合蛋白的表达。经 Ni－NTA柱纯化获得纯化产物，经间接ELISA分析确定所得产物具有与HBSAg结合的特异性。与肝癌细胞作用后，通过间接免疫荧光检测、免疫组化捡测进一步确定所获得的纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。 结论 门）成功地构建了五种人抗HBSAg单链抗体基因。Q）瞬时转染COS7细胞，获得了分泌性表达。稳定转染Jurkat细胞，经筛选获得稳定表达SCFV融合蛋白的细胞系，并证实表达产物具有与HBSAg特异性结合的功能。（3）在大肠杆菌 BLZI中进行表达，经 Ni－NTA柱纯化获得了纯化产物，并证实纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。
王建丽[3]2005年在《二硫键稳定单链抗体B3（ds-scFv）靶向超抗原SEA的制备及活性鉴定》文中研究说明超抗原(supperantigen SAg)的概念由White 等于1989 年首先提出,它是由一组细菌或病毒编码的蛋白分子可不需要抗原提呈细胞(APC)处理,以完整的蛋白质分子形式直接与APC 膜上的MHCⅡ类分子抗原结合槽外侧结合,导致带有特异性Vβ节段T 细胞大量活化增殖,其活化的T 细胞数是普通抗原数千倍乃至数万倍。由于它产生的杀伤性很强的细胞毒T 细胞(CTL)对肿瘤极其强大的杀伤作用,因此,超抗原作为强大的T 细胞激活剂,有可能成为新一代抗肿瘤免疫分子,给肿瘤的治疗带来新的突破。近年来,超抗原理论得到迅猛发展,已成为肿瘤免疫治疗新的热点。葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A SEA)是金黄色葡萄球菌的产物,是近年来研究较多的一种细菌性超抗原。但是,SEA 激活的T 细胞所介导的细胞毒作用在对肿瘤细胞进行杀伤的同时对正常细胞也具有毒性,并且只能对MHCII+的肿瘤分子进行杀伤。因此,利用基因工程抗体对超抗原进行靶向,减少其副作用具有良好的应用前景,成为利用超抗原进行肿瘤免疫治疗的新的研究热点。为了提高单链抗体的稳定性,改善导向效果,本研究在B3 单链抗体(来源于一种肿瘤相关抗原对应的单抗)中引入了一对链间二硫键构建了二硫键稳定单链抗体B3ds-scFv,通过重叠PCR 连接B3 抗体的VH 和VL 片段,并将PCR 产物克隆至pET22b表达载体(B3ds-scFv-pET22b);将测序正确的SEA 基因片段经酶切连接亚克隆至B3ds-scFv-pET22b 表达载体,重组表达载体经酶切鉴定两片段连接正确;转化BL21(DE3)后经IPTG 诱导表达,将表达的包涵体进行变性、复性,并用阳离子柱SP-Sepharose 将复性产物进行了初步纯化,ELISA 测定此融合蛋白中抗体部分的结合活性以及其在37℃的稳定性,并采用MTS 法检测其对B3 抗原表面阳性细胞HT-29 的杀伤作用。经鉴定,重叠PCR 扩增得到了B3ds-scFv 抗体基因,并通过酶切连接成功融合了B3ds-scFv 和SEA(D227A)两段基因,成功构建了B3ds-scFv-SEA(D227A)-pET表达载体,诱导表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的33%左右;复性后的B3ds-scFv-SEA(D227A)保持了良好的抗原结合活性,并可成功杀伤人结肠癌细胞;在37℃及不同的温度下孵育一定时间后,经ELISA 测定,37℃孵育一周蛋白仍能保持活性基本不变。本研究首次成功构建了B3ds-scFv-SEA(D227A)重组毒素,此蛋白具备了导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能,并且通过链间二硫键的引入大大提高了整个融合蛋白的稳定性,为其发展为有效的肿瘤免疫治疗靶向药物奠定了基础。
陈琳[4]2013年在《全人源抗肝癌基因工程单链抗体与阿霉素偶联物的制备及其抗肿瘤作用研究》文中认为目的：构建全人源抗肝癌单链抗体原核表达载体,诱导表达获得有活性的单链抗体；利用葡聚糖为中介偶联单链抗体与化疗药物阿霉素以制备高效、小型化免疫偶联物；通过体内、外实验研究免疫偶联物的抗肿瘤效应,为肝癌的靶向生物治疗奠定基础。方法：采用PCR等方法构建pET-21a(+)-SA3原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),利用诱导剂IPTG诱导单链抗体ScFv-SA3的表达,蛋白提取及纯化,Western-blot验证ScFv-SA3蛋白大小,间接ELISA验证单链抗体ScFv-SA3的抗体活性,细胞免疫化学检测ScFv-SA3对人肝癌细胞系HepG2的特异性结合作用；以氧化葡聚糖Dextran-T10为中介偶联单链抗体ScFv-SA3与阿霉素(ADM),制备ADM-Dex-ScFv-SA3免疫偶联物,间接ELISA检测偶联物的抗体活性；MTT、平板克隆及裸鼠移植瘤模型等体内、外实验研究ADM-Dex-ScFv-SA3的抗肝癌作用。结果：成功构建pET-21a(+)-SA3重组载体,转化大肠杆菌原核表达体系后在IPTG诱导下表达可溶性单链抗体ScFv-SA3, SDS-PAGE验证蛋白大小为40KD；大量表达及纯化ScFv-SA3后,间接ELISA及细胞免疫化学检测到其具有抗体活性且对人肝癌细胞HepG2有特异性结合作用；以氧化Dextran-T10为中介介导ADM和ScFv-SA3形成稳定的免疫偶联物,其中ScFv-SA3:ADM摩尔比为1：14.21；体外实验MTT和平板克隆实验都显示偶联物ADM-Dex-ScFv-SA3对肝癌细胞生长抑制作用明显强于游离的ADM、ADM+ScFv-SA3,且对非靶细胞的毒性小于游离ADM；体内实验表明偶联物可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并能延长裸鼠的中位生存时间。总之,ADM-Dex-ScFv-SA3偶联物显示了较强的抗肿瘤效应。结论：1.成功构建了原核表达载体pET-21a(+)-SA3,诱导表达后纯化获得有活性的全人源抗肝癌单链抗体ScFv-SA3。2.成功制备出以葡聚糖为中介的阿霉素和单链抗体免疫偶联物ADM-DEX-ScFv-SA3。3.免疫偶联药物ADM-Dex-ScFv-SA3在体外可明显抑制肝癌细胞的生长；在体内可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,且明显延长了裸鼠的中位生存时间。ADM-Dex-ScFv-SA3偶联物显示了较强的抗肿瘤效应。
赵岩[5]2004年在《噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选及表达》文中研究说明乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率正呈逐年上升趋势，这一现象在大中城市尤为突出。目前，乳腺癌治疗的主要手段仍然是手术治疗，但仅通过手术不可能根治乳腺癌。在手术治疗的基础上辅以化疗、放疗、免疫治疗、中医中药治疗等各项治疗手段，才能取得一个较好的治疗效果。多年来，人们一直在探索应用免疫学的方法来治疗乳腺癌，但直到1998年，美国FDA批准针对乳腺癌基因过表达产物HER2受体的人源化单克隆抗体Herceptin用于乳腺癌的临床治疗，人们才真正看到了免疫治疗乳腺癌的曙光。传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体费时费力。噬菌体抗体库技术的出现使抗体的制备产生了突破性的进展。该技术与传统的杂交瘤技术相比，具有简便易行；筛选容量大，过程短；利于进一步进行基因工程改造；生产成本低等优点。噬菌体展示的抗体片段可以是单链可变区片断（scFv）或Fab段，也可以是用一段多肽链或二硫键连接的双抗体或多抗体片段。ScFv是由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的六分之一，分子量约为27KD。ScFv弥补了传统单克隆抗体抗原性强、穿透力弱等不足，在导向治疗方面有着巨大的应用潜力。虽然噬菌体抗体库技术应用的时间较短，但在肿瘤的诊断和治疗、抗原表位分析、药物设计等多个领域显示出了巨大的发展潜能和广阔的应用前景。本研究应用噬菌体展示技术构建了一个抗乳腺癌细胞的噬菌体单链抗体<WP=74>库，旨在筛选出与人乳腺癌细胞特异结合的单链抗体，以期有助于乳腺癌的导向诊治。首先用人的乳腺癌细胞MCF-7免疫BALB/c小鼠，从MCF-7乳腺癌细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA，设计简并引物，RT-PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因，用(Gly4Ser)3连接肽基因，经重叠延伸反应，在体外将VH和VL连接成scFv。scFv回收纯化，用SfiⅠ、NotⅠ进行酶切，与经同样双酶切反应的表达载体pCANTAB5E连接，电转化大肠杆菌TG1，并经辅助噬菌体M13KO7超感染，scFv展示在重组噬菌体表面，构建噬菌体单链抗体库。扩增的VH大小为340bp，VL大小为320bp左右，scFv基因大小为750bp左右。构建了库容为1.2×106的抗乳腺癌细胞的噬菌体单链抗体库。以MCF-7乳腺癌细胞为靶标对抗体库进行吸附、洗脱、扩增”的富集筛选，ELISA法鉴定各单克隆与乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞、宫颈癌Hela细胞的结合活性。经过5轮筛选，从中筛选出一株与人乳腺癌细胞系MCF-7特异性结合较的噬菌体单链抗体phage scFv-507。经序列分析，此基因全长732bp，编码244个氨基酸序列，通过Blast检索，此scFv重链与轻链可变区基因与鼠的IgG同源性达到95%以上。将重组的scFv-507转化非琥珀抑制的菌株E.coli TOP10，IPTG进行诱导表达，多肽链的翻译终止于E-tag，scFv-E-tag在信号肽引导下分泌到壁膜间隙，成为可溶性的scFv-E-tag融合蛋白，可以用抗E-tag抗体来检测scFv的表达情况。诱导表达的菌液作SDS-PAGE和Western blot分析，发现在相对分子量32kDa处有一条清晰的显色条带，为能与anti-E tag抗体特异性结合的pⅢ signal-scFv-E tag，与文献报道相符，说明scFv-507在E.coli TOP10得到了正确表达。为深入研究特定单链抗体(scFv)的功能，将识别MCF-7乳腺癌细胞的<WP=75>单链抗体scFv-507克隆入原核表达载体pET24a，构建高效表达载体pET-24a-scFv-507，转化E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，scFv-507基因表达产物在大肠杆菌以不溶性包涵体形式高效表达。超声破碎细菌细胞得包涵体，经2mol/L 尿素洗涤后，6mol/L盐酸胍溶解包涵体，利用其产物末端携带6个连接的组氨酸标签与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性，应用Ni-NTA金属螯合层析在蛋白质变性条件下进行纯化，纯化蛋白细胞直接稀释复性，探索复性条件(温度、时间、GSSG及GSH的浓度等)。SDS-PAGE分析蛋白的纯度，ELISA检测复性蛋白的活性。诱导表达的scFv占全菌蛋白的20%，变性纯化的蛋白在5mM氧化型谷胱甘肽（GSSG），0.5mM的还原型谷胱甘肽（GSH），400mM L-Arg条件下稀释复性，复性的scFv纯度大于90%，浓度达到75μg/mL，复性率达到50%。ELISA检测纯化复性后的scFv-507活性。实验结果表明scFv可与乳腺癌MCF7细胞、231细胞有效结合，而与正常细胞系L02则呈阴性反应。本研究获得的与人乳腺癌细胞系MCF-7结合特异性结合的单链抗体为进一步进行乳腺癌导向治疗的研究奠定了基础。
徐超超[6]2017年在《抗B7-H4单链抗体的人源化改造、表达及其生物学功能鉴定》文中认为本研究旨在将抗B7-H4单链抗体与人IgG1 CH3进行连接,对抗B7-H4单链抗体进行人源化改造,希望得到对肿瘤生长有抑制作用的融合蛋白。本实验室的先前研究中,已构建出抗B7-H4单链抗体库,并且利用核糖体展示技术筛选出一株鼠源性抗B7-H4的特异性单链抗体。可是,因为该株单链抗体缺少Fc段,造成其在体内的半衰期短、在血液中容易被清除,且也造成了其在鉴定方面的繁杂。因此,我们将anti-B7-H4-scFv基因与人IgGlCH3基因相连,以此对单链抗体进行人源化改造。具体结果如下:1 Anti-B7-H4-scFv-CH3 基因的克隆从人外周血单个核细胞中提取总RNA,然后用RT-PCR扩增出人IgG1 CH3基因;利用SOE-PCR技术将anti-B7-H4-scFv基因和人IgGlCH3基因进行连接来获得重组基因;再通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序鉴定重组基因。结果表明:重组的anti-B7-H4-scFv-CH3基因序列和期望的一致。2 Anti-B7-H4-scFv-CH3蛋白的表达、纯化及活性检测将重组基因克隆到原核表达载体pET43.1a中,转化至E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达出抗体蛋白;抗体蛋白再经镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化,纯化后的蛋白经Western blot鉴定;用ELISA和Western blot鉴定抗体蛋白和B7-H4抗原结合的特异性和亲和性。结果表明:成功构建了抗B7-H4人源化单链抗体的表达体系,获得与B7-H4抗原亲和性和特异性高的可溶性蛋白。3 Anti-B7-H4-scFv-CH3蛋白的生物学功能检测为了检测抗体蛋白的生物学功能,用C57BL/6小鼠建立了 Lewis肺癌皮下移植瘤模型;将荷瘤鼠随机分成两组,注射生理盐水的为模型组,注射anti-B7 -H4-scFv-CH3蛋白的为受试药组,并从此刻开始记录两组小鼠肿瘤体积和小鼠体重的变化,实验结束时处死小鼠剥离瘤块进行称重,并对肿瘤组织进行苏木精-伊红染色观察组织病理学形态。结果表明:对照组的肿瘤体积和瘤重普遍大于实验组;光镜下观察,实验组肿瘤细胞排列密度较对照组低且见病灶性坏死;抗体蛋白可以抑制Lewis荷瘤小鼠肿瘤的生长,显示出良好的生物学功能活性。Anti-B7-H4-scFv-CH3这一功能蛋白为肿瘤的靶向治疗等方面的研究提供了基础。
陈葳, 李旭, 王莹, 张利平[7]2005年在《抗人肝细胞癌单链抗体基因的构建和表达》文中认为目的:构建抗人肝细胞癌单链抗体基因,并在大肠杆菌中表达.方法:采用RTPCR法扩增抗体重链和轻链可变区基因,用(Gly4Ser)3肽段连接VH基因和VL基因,构建克隆载体,将测序完全正确的ScFv基因克隆到分泌性表达载体pCANTAB5E中诱导表达转化的TG1和HB2151细胞.用SDSPAGE和免疫组化方法分析检测表达产物.结果:DNA测序证实ScFv基因结构正确,可在大肠杆菌中成功表达,游离ScFv相对分子质量大约为30ku,与HC108,HepG2和SMMC7721肝癌细胞有特异性的结合反应.结论:重组制备的抗人HCD78分子单链抗体在人肝癌的基础和临床研究中具有潜在的应用价值.
赵泽文[8]2008年在《抗人Endoglin单链抗体的制备及其在荷人卵巢癌裸鼠体内放射免疫显像初探》文中指出研究背景:Endoglin又名CD105,是一种细胞膜糖蛋白,是内皮细胞增殖的标志物之一。它在增殖的内皮细胞和肿瘤组织的新生血管内皮细胞中呈过表达,而在正常成熟的血管内皮细胞中不表达或弱表达。Endoglin还是转化生长因子-β(TGF-β)受体复合物的成分之一,具有调节内皮细胞对TGF的反应、促内皮细胞增殖和促血管形成等功能,与肿瘤血管生成有关。依据肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新生血管形成的观点,大量研究表明,通过靶向肿瘤新生血管内皮表达的Endoglin,在动物实验中实现了对移植瘤的放射免疫显像和治疗作用,证实了Endoglin可以作为体内肿瘤显像诊断和治疗的理想靶标。提高早期卵巢癌检出率是降低卵巢癌患者高死亡率的关键,但目前尚无理想的筛查或/和早期诊断卵巢癌的方法,因此建立特异的早期卵巢癌诊断方法显得尤为迫切和重要。卵巢癌是一高度血管化的恶性肿瘤,所以抗人Endoglin抗体有可能在其诊断及治疗中发挥重要作用。抗Endoglin抗体的研究中,以单克隆抗体的报道最多。但是单克隆抗体由于自身的一些缺点使得它的临床应用效果不佳。如单克隆抗体的分子量大,穿透力较弱,因有Fc段,在体内容易与正常组织的Fc受体发生非特异性结合,多为鼠源性,易致机体产生人抗鼠抗体反应,制备过程烦琐等。比较而言,单链抗体分子小、穿透力强、体内清除快、缺乏Fc段、异源性低、易于在大肠杆菌中重组表达获得足够量,易于用基因工程方法制备和修饰,通过构建双价或双特异性单链抗体来增加抗体的稳定性和亲和力,单链抗体是将药物、毒素和放射性物质导向肿瘤的很有价值的小分子抗体,因而在肿瘤诊断和治疗方面的应用越来越广泛。噬菌体表面呈现技术,是利用噬菌体表达外源基因的一项技术。它以改建的噬菌体为载体,把目的基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区,使外源多肽或抗体表达并展示于噬菌体表面,进而通过亲和富集筛选表达有特异肽或抗体的噬菌体,然后进行DNA序列测定。它将基因型和表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起,是一种高效的筛选系统。在抗原表位的模拟、蛋白质工程的改造、单链抗体的制备、药物筛选及疫苗研制等方面,具有广泛的用途。基于以上分析,本研究拟应用噬菌体表面呈现技术制备特异性抗人Endoglin单链抗体,并研究其生物学活性和体内靶向肿瘤新生血管内皮的作用,为探索早期卵巢癌诊断方法的研究奠定基础。研究目的:制备抗人Endoglin单链抗体,并检测其生物学活性;初步探讨抗人Endoglin单链抗体在荷人卵巢癌裸鼠体内肿瘤放射免疫显像中的应用。研究方法及结果:研究共分四部分。第一部分:以rhEndoglin(即重组人Endoglin胞外段)蛋白免疫Balb/c小鼠,纯化免疫成功小鼠脾脏的mRNA,用RT-PCR方法扩增出抗人Endoglin抗体的可变区基因,1%琼脂糖凝胶电泳示,重链和轻链可变区基因大小分别为约340bp和约325bp,与预期相符;用重叠延伸PCR经Linker序列把重链和轻链可变区基因连接成单链抗体基因,1%琼脂糖凝胶电泳示,该基因大小约750bp,与预期相符,并用SfiⅠ和NotⅠ双酶切该基因;第二部分:把双酶切的抗人Endoglin单链抗体基因克隆入经同样双酶切的噬菌粒载体pCANTAB5E中,转化大肠杆菌E.coli TG1,再经辅助噬菌体M13KO7感染,成功构建抗人Endoglin单链抗体噬菌体呈现文库,库容量约为3.98×106;用rhEndoglin抗原对文库进行5轮吸附-洗脱-富集panning淘筛,继之用噬菌体ELISA筛选鉴定具有抗原结合能力的阳性重组噬菌体克隆,结果一次性从随机挑选的94个重组噬菌体克隆中筛选到37个阳性克隆,阳性克隆检出率约为39.36%;据噬菌体ELISA结果,对抗原亲和力最强的重组噬菌体克隆测序,获得单链抗体基因序列;经比对分析发现,该基因全长为738bp,共编码246个氨基酸残基。其中重链可变区基因编码122个氨基酸残基,位于单链抗体的N端,轻链可变区基因编码109个氨基酸残基,位于单链抗体的C端。两个可变区之间通过(Gly4Ser)3组成的15肽连接。经数据库查询,未发现任何与该单链抗体基因相同的序列;用ANTHEPROT V5.0软件对单链抗体蛋白的氨基酸序列进行分析,计算出目的蛋白的分子量为25925.818 Da。在重链和轻链可变区各有2个半胱氨酸,可形成2个二硫键。预测其等电点pI=9.015。并在生物医学网站,自动建模获得该基因编码蛋白的二级结构和三级结构的预测模型;第三部分:把第二部分测序正确的重组噬菌体感染大肠杆菌E.coli HB2151,经IPTG诱导,成功表达了可溶性单链抗体蛋白,用SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析,蛋白分子量约为29×103,集中在大肠杆菌的周质和培养上清中,且周质中蛋白表达量最高。确定最佳培养条件为:温度30℃,振摇速度250rpm,IPTG浓度1mmol/L,诱导培养5h;用HiTrap Anti-E Tag Column亲和层析纯化经IPTG诱导培养5h的细菌周质提取物中的单链抗体,用HiTrap Desalting Column更换单链抗体的缓冲液为中性磷酸盐缓冲液,SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度大于95%;用PEG 8000浓缩纯化的单链抗体,之后Bradford法测抗体浓度为1.12mg/ml;用竞争性ELISA检测单链抗体相对于抗rhEndoglin单抗的抗原结合活活性,结果表明,该单链抗体能与抗rhEndoglin单抗竞争性结合rhEndoglin抗原表位,且竞争作用随单链抗体浓度增加而增强;用间接ELISA测定单链抗体的功能性亲和常数为(2.14±0.84)×107M-1;间接免疫荧光实验表明,该单链抗体能检测到HUVEC胞膜上表达的Endoglin,激光共聚焦显微镜下表现为胞膜上散在分布的绿色荧光点;第四部分:用瘤细胞悬液皮下注射法接种SKOV3人卵巢癌细胞于裸鼠皮下,经病理组织学证实,成功建立了荷人卵巢癌裸鼠动物模型;石蜡切片的免疫组化结果发现,单链抗体能使移植卵巢癌的血管内皮胞膜呈阳性着色,表明该单链抗体与移植卵巢癌中鼠源性血管内皮有交叉反应;用预亚锡直接标记法完成单链抗体的99mTc标记,用纸层析法测定标记率为83%;从鼠尾静脉将99mTc标单链抗体注入荷瘤鼠体内,Spect仪器观察,对照组的肿瘤部位始终未显像,而实验组中,在注药后1h即可见肿瘤部位显像,注药后3h肿瘤显像最清晰;γ放射免疫计数器检测各组织的放射性计数,计算肿瘤组织放射性计数/非肿瘤组织放射性计数的比值,该比值反应了抗人Endoglin单链抗体在荷瘤鼠体内的分布特点,最高为2.96±1.71。结论:利用噬菌体表面呈现技术成功制备了抗人Endoglin单链抗体;体外实验证实该单链抗体具有较强的抗原结合能力;体内实验证实,通过该单链抗体靶向肿瘤新生血管内皮的作用,实现了荷瘤鼠体内移植卵巢癌的放射免疫显像。所以我们认为,该单链抗体有望作为靶向卵巢癌新生血管内皮的导向载体,为卵巢癌早期诊断方法的研究奠定了基础。
王栋[9]2005年在《多价抗前列腺癌/抗人CD3双特异性单链抗体的构建及表达》文中认为目的：分别构建人转录因子p53四价功能域／IgG3上游铰链区融合基因和抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体，然后，将两段基因序列依次克隆入pUC18质粒中，构建可自动装配成四聚体的多价双特异性单链抗体，真核表达后经Ni~(2+)-NTA superflow亲和柱纯化，获得具有生物学活性的多价抗体，为进一步的体内实验奠定了基础。 方法：利用递归聚合酶链式反应(recursive poiymerase chainreaction R-PCR)，扩增人IgG3上游铰链区／p53四价功能域融合基因，将融合基因克隆入pUC18载体中，酶切鉴定及序列测定正确后，命名为Ip-pUC18。利用PCR方法分别扩增出编码抗前列腺癌单链抗体和抗人CD3单链抗体的基因序列，并在抗前列腺癌单链抗体基因序列3’端引入预先设计好的Linker序列，分别依次将两段基因序列克隆入pUC18及Ip-pUC18质粒中，得到双特异性单链抗体及多价抗体融合基因，分别命名为BsAb-pUC18及MAb-pUC18，测序正确后，利用EcoR和Hind Ⅲ酶切位点，将两段融合基因分别克隆入真核表达载体pSectag2-β中，得到 第四军医大学硕士学位论文 一 BsAb－psectagZ－B及 MAb－psectagZ－B，将上述质粒分别转染 Hela细胞， 进行表达，利用SDS－PAGE和Western印迹实验鉴定融合蛋白的表达，表 达产物经N广－wAsupo汁二。w亲和柱纯化后，利用流式细胞仪进行上述两 种抗体的活性测定。 结果：（1）递归 PCR扩增出约 160hP大小的片段，提取 IP－PUC18质粒 进行酶切鉴定，得到一段约160hP大小的片段，与PCR结果相符，测序结 果证实：序列与设计完全一致。（2）抗前列腺癌单链抗体和抗人CD3单链 抗体的PCR扩增产物大小均为750hP左右，将BSAb－PUCIS及eb－PUC18 质粒进行 EcoR与 Hnd Ill酶切后，分别得到大小为 1．skb及 l．7kb左右 的片段，测序结果证实：序列与设计完全一致。（3）将BsAb－psectagZ亿 及 MAb－pseCtagZ亿质粒进行EcOR与 Hnd Ill酶切后，分别得到大小为 1．skb及 1．7kb左右的片段，结果表明：抗前列腺癌／抗人CD3双特异性 单链抗体及多价抗体的表达载体构建成功。（4）SDS－PAGE和Western印迹 实验证明：BsAb－psectagZ士及hb－psectagZ仑质粒表达产物中分别含 有约6kD及盯M大小的特异蛋白条带；表达产物经N广－叮比u昨r门。w 亲和柱纯化后，经凝胶灰度扫描证实两种蛋白的纯度均可达到90％以上。 （5）流式细胞仪结果显示：多价抗体及双特异性抗体均可以特异性的结合 PBMC及PC－3细胞，具有较好的生物学活性，并且多价抗体与PBMC及PC－3 细胞的亲和力明显高于双特异性抗体。 结论：门）成功的构建了人IgG3上游铰涟区冲3四价功能域融合基 因，为进一步构建多价抗体奠定了实验基础，并为提高抗体亲和活性开辟 了新的思路；Q）用基因工程方法制备了具有生物学活性的抗前列腺癌／ 抗人CD3双特异性单链抗体及多价抗体，为进一步的体内实验奠定了基 础，同时，探索治疗前列腺癌的新方法。 ．4－ 第四军医大学硕士学位论文一
王金鹏[10]2017年在《旋毛虫7TR蛋白人源单链抗体抗A549肿瘤作用研究》文中研究指明目前国内外许多研究已经证实,旋毛虫感染对动物体内的肿瘤生长具有抑制作用,但其具体抗肿瘤机制尚不明确。本实验室先前通过对旋毛虫c DNA文库的筛选,已发现旋毛虫与乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌等多种癌细胞存在相关抗原,并且针这些相关抗原所制备的鼠源高免血清和单克隆抗体均在裸鼠荷瘤模型的治疗实验中取得了较好的抗肿瘤作用。其中本实验室前期以旋毛虫与A549肺癌细胞相关抗原旋毛虫7TR蛋白为抗原制备的鼠源高免血清,在裸鼠荷A549的肿瘤动物模型的治疗实验中,取得了64.77%的抑瘤率。左绍志等利用旋毛虫与肝癌的相关抗原制备的单抗,也在H7402的肿瘤动物模型的治疗实验中获得了良好的治疗效果。但是,鼠源抗体因为高昂的成本而难以大规模生产应用。更重要的是,鼠源抗体在疾病治疗中还没达到满意的效果,多克隆抗体和单克隆抗体都会在人体引起较强的人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)反应;而嵌合抗体和CDR移植抗体等改型抗体也存在着治疗效果有限、排斥反应和技术复杂等问题。Huston J S等和Bird R等采用DNA重组技术制备的单链抗体(sc Fv),具有完整的抗原结合位点,分子量只有常规抗体的约1/6,穿透组织能力强,在血液中代谢清除快,全部筛选过程可在体外进行。更重要的是sc Fv能在工程菌中表达,易于基因改造和规模化生产,并可连接抗肿瘤效应分子,构建抗肿瘤融合蛋白,从而将药物导向肿瘤,在肿瘤显像和肿瘤靶向性治疗中具有广阔的应用前景。近几年报道中,已有人将单链抗体直接用于实体瘤治疗的动物实验中,并取得了较好的治疗效果,这也证明了单链抗体药物新的应用潜力。本实验首先对旋毛虫与肺癌A549细胞相关抗原旋毛虫7TR蛋白进行原核表达,表达后的重组蛋白经纯化、复性后,进行了Tomlinson(I+J)人源单链抗体库的的筛选,并用ELISA验证筛选所得阳性抗体分泌菌株。对阳性抗体分泌株所分泌抗体进行纯化后,采用间接免疫荧光抗体检验阳性抗体与A549细胞的结合活性,并采用CCK-8法度检测不同浓度的抗体对A549细胞的生长抑制活性。最后通过荷瘤裸鼠的治疗实验评价抗旋毛虫7TR蛋白人源单链抗体对A549肺癌肿瘤细胞的治疗效果,通过免疫组化分析单链抗体抑制A549细胞的机制。旋毛虫7TR蛋白的原核表达、纯化与复性根据NCBI公布的旋毛虫7TR基因,设计特异性引物,以旋毛虫c DNA为模板,PCR扩增目的基因,并将目的基因克隆到p ET-32a载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。对表达蛋白进行DEAE弱离子交换柱柱上复性,并对复性后蛋白进行Cu2+螯合柱亲合层析,最后得到纯化并复性的重组旋毛虫7TR蛋白。Tomlinson(I+J)人源单链噬菌体抗体库的筛选经过四轮针对7TR蛋白的噬菌体抗体富集后,随机挑选2000个侵染了噬菌体的E.coli HB2151单菌落,通过IPTG诱导后取得的上清,经ELISA检验,当样品OD490试≥3OD490阴时,视样品为阳性,进过三轮平行验证以及对p ET-32a标签抗体和奶粉抗体的去除,此过程中最终共筛选出9株阳性克隆:1A2、2B1、2B8、4C7、5D1、6D2、7H5、7H9、8G5。经ELISA初步检测,其中只有8G5具有较好的A549结合活性。7TR阳性抗体的A549结合活性检测纯化8G5抗体后,通过激光共聚焦观察间接免疫荧光结果,发现8G5单链抗体具有较好的A549结合活性。经Ig blast分析,8G5为完整的人源单链抗体。7TR蛋白人源单链抗体体内外抗A549肿瘤作用采用CCK-8法检测抗旋毛虫7TR蛋白人源单链抗体的体外抗A549肺癌作用,结果发现当单链抗体对A549细胞的最高生长抑制率为23.29%。体内抗A549肿瘤实验结果显示,单链抗体的最高抑瘤率为59.10%。利用免疫组化分析抗旋毛7TR人源单链抗体治疗后肿瘤组织癌细胞增殖凋亡相关基因PCNA、VEGF、Bcl-2的表达情况,结果表明经旋毛虫7TR人源单链抗体治疗后,PCNA、VEGF表达均下调,Bcl-2基因表达无明显变化。并且,HE染色结果显示,7TR单链抗体在治疗A549肿瘤后,裸鼠的心、肝、脾、肺、肾均未出现病理组织学变化。
参考文献：
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[9]. 多价抗前列腺癌/抗人CD3双特异性单链抗体的构建及表达[D]. 王栋. 第四军医大学. 2005
[10]. 旋毛虫7TR蛋白人源单链抗体抗A549肿瘤作用研究[D]. 王金鹏. 吉林大学. 2017
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