张晓东[1]2000年在《人和大鼠精子发生相关基因的克隆及其基因结构和功能分析》文中研究指明精子发生过程中经历了从形态到生化的复杂变化，在这一过程中有一系列的特定基因按严格的时空顺序转录和翻译，因此寻找和研究不同发育阶段的差异表达的基因，将有助于最终阐明精子发生的机理，并为控制生育和不育机理的探索提供新的线索。 本文的研究策略是利用本组通过大鼠曲细精管分段分离结合DDRT-PCR所得的代表差异表达基因的EST和根据基因组信息学的数据分析并设计的EST为探针，采用常规方法筛选大鼠和人睾丸cDNA文库，共完成了8个新的全长cDNA的克隆及测序(HSD-4，RSD-4，RSD-5，RSD-6，RSD-7，DNA J样蛋白，tSH3p13及HSD-3)，在此基础上进行基因表达谱分析和部分基因的原核表达及其免疫组化定位。 HSD-4和RSD-4是以基因组信息学的数据分析并设计的引物扩增人睾丸RT-PCR产物所得的cDNA片段为探针，从人和大鼠的睾丸cDNA文库得到的两个新的全长cDNA。其中HSD4 cDNA序列全长2497bp，含一个738bp的完整开放阅读框，编码245个氨基酸，分子量为28.2KD。将HSD-4 cDNA序列送GenBank，登录号为AF162680。RSD-4全长779bp，编码209个氨基酸。GenBank登录号为AF315468。通过序列比较，发现HSD-4／RSD-4与小鼠TRIF(ID：AB025010)明显同源，同源性高达85％以上，故认为这三个基因互为同源基因，迄今尚未见对TRIF基因的具体描述。用SMART(v．3.1)对HSD-4进行结构分析，提示在氨基酸残基18-57位以及157-180位分别含有一个RING Finger和一个ZnF结构域。 对HSD-4／RSD-4基因进行多种组织表达谱Northern blot分析显示：在8种大鼠和11种成人组织中，RSD-4只有在睾丸组织有表达，HSD-4也主要在睾丸组织中有高水平的表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern Blot分析结果显示：以组成性表达的β-actin
梁刚[2]2003年在《应用激光捕获显微切割技术进行人和大鼠不同阶段生精细胞差异表达基因的研究》文中指出精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程，是相关基因严格受时空调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行，曲细精管截面上不仅可以看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合，还可以看到支持细胞、间质细胞等其它类型的细胞。它们分别具有自己的基因时空表达规律。多年来人们采用了重力沉降法、密度梯度离心以及曲细精管分段分离等多种方法试图获得处于不同阶段纯净的各类细胞，但均存在着组织异质性问题。因此分离得到单一的生精细胞群并建立单一细胞类型的cDNA文库，就可以特异性地研究单一细胞的基因表达和有效地筛选不同精细胞群之间差异表达的基因。 我们利用激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection，LCM)技术，成功地捕获和分离了人和大鼠的初级精母细胞和圆形精子细胞。在此基础上从分离的两种细胞中提取RNA，合成双链cDNA，并进一步通过抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization，SSH)方法构建了人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库、大鼠初级精母细胞(RSA)和圆形精子细胞(RSB)的双向cDNA消减文库。其中所构建人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库的滴度高达5.6×10~7／ml，重组质粒克隆阳性率为88.89，插入片段大小分布主要集中于500bp～750bp。所构建文库的滴度高达8.3×10~9／ml，重组质粒克隆阳性率为91.67％，插入片段大小分布于250bp～1.7kb，主要集中于500bp～1kb。大鼠初级精母细胞(RSA)和圆形精子细胞(RSB)的双向cDNA消减文库的滴度达8.3×10~7／ml，重组质粒克隆阳性率为91.67％，插入片段大小分布于250bp～1.7kb，主要集中于500bp～1kb。 根据SSH的结果，在人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库中选择421个PCR纯化产物进行斑点杂交(Dot Blotting)分析，以验证差异表达并分析其表达差异的强度。结果得到390个克隆在两种细胞之间表达差异相差大于2倍。对斑点杂交筛选出的390个克隆进行部分测序，共产生了329个质量满意的ESTs，测序成功率达到84.40％。在大鼠初级精母细胞
刘涛, 李因传, 刘以训[3]2005年在《新基因Trs85的克隆和表达检测》文中研究指明本文利用我们在隐睾模型芯片中所发现有明显变化的一个寡聚核苷酸基因片断Unigen,,该寡聚核苷酸基因片断在芯片检测中表达量有明显下调,推测它可能与精子发生相关。利用Genescan、Genefinder及该Unigen基因片断信息,我们克隆得到该序列的全长1851 bp DNA,并据其DNA序列推导出其蛋白序列。经NCBI的Genebank BLAST检索,发现人和大鼠中存在与Trs85同源的基因序列,在人、小鼠及大鼠中,该基因均没有任何注释,没有命名,功能也未知,因此该基因是一全新的基因。
林雯[4]2002年在《人睾丸特异表达基因HSD-3.8编码蛋白质的功能研究》文中进行了进一步梳理受精是雄性和雌性生殖细胞之间极为复杂的相互作用过程，有赖于一系列事件在正确的时间准确地按部就班地完成。体内正常成功的受精离不开功能完整的精子，后者的成熟对于受精不可缺少。此外，成熟精子还需克服一些障碍并且经历许多动态变化才能到达其最终的目的地，在那里将其自身的DNA释放入卵。在精子成熟和参与受精过程中，有许多睾丸特异表达的基因在调控因子的作用下，以既定的时空秩序开放或关闭。多年来许多生殖学家致力于精子发生、受精等过程的分子机理研究，寻找与之相关的分子开关。HSD-2.4就是本实验室既往发现的人睾丸特异表达并与受精和／或精子发生有关的基因。 HSD-2.4是以不孕妇女血清先后筛选人睾丸λgt11表达文库和人睾丸cDNA文库所获得的人睾丸特异表达的基因。其开放阅读框架为2447bp，编码548个氨基酸。本论文工作在以往的基础上，对HSD-2.4的全长进行了扩增，得到其全长cDNA序列，命名为HSD-3.8。利用重叠区扩增基因拼接法成功获得了HSD-3.8编码区cDNA片段，为以后全面研究该基因奠定了基础。HSD-3.8基因全长3818bp，编码蛋白质全长926个氨基酸，GenBank接收号为AF311312。根据基因组信息学分析显示该基因定位于8号染色体上，由19个外显子和18个内含子组成。亲疏水性分析提示HSD-3.8全长cDNA编码蛋白质是一个亲水性较强的蛋白质，没有明显的疏水区域。SMART和Prosite软件对该蛋白质进行结构域分析，确认HSD-3.8编码蛋白质具有糖基化位点、PKC磷酸化位点、CK-2磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、豆蔻酸化位点、酰胺化位点、ATP／GTP结合位点基序A(P—loop)，以及三个TPR区，每个TPR区又分别由三个TPR基序构成。氨基酸同源分析发现HSD-3.8编码蛋白质与小鼠的TPIS具有较高的同源性，氨基酸相同性为67％，相似性达到75％。此外，HSD-3.8编码蛋白质羧基端第448位～第740位氨基酸与人线粒体外膜转位酶34(hTOM34)氨基酸有48％相同，66％相似。利用以往制备的抗HSD-0.7的多克隆抗体检测在人和大鼠睾丸中表达的HSD-3.8编码蛋白，结果发现在这两种组织中仅有一大小约为55～60kDa的蛋白质能与多克隆抗体特异反应，显示HSD-3.8及其同源基因所编码蛋白质在生理状态下约为55～60kDa。推测HSD-3.8编码蛋白质的功能正常发挥需要翻译水平或翻译后水平的修饰过程。 以往的工作表明HSD-3.8编码蛋白质中的一个片段：HSD-0.7对大鼠具有比较好的抗生育效果，该片段能与GTP特异结合，且其结合具有可饱和性。酶学活性测定分析证明HSD-0.7具有GTPase酶活性。同时证明HSD-0.7编码蛋白在体外能够被PKC磷酸
吕东媛[5]2008年在《Ghrelin在乌珠穆沁羊雌性生殖道内的表达及其真核表达载体的构建》文中研究指明Ghrelin是1999年发现的生长激素促分泌素受体(GHSR)的内源性配体,其最主要功能是通过与GHSR结合刺激生长激素的释放。最近发现生殖器官中有Ghrelin分布,提示其与生殖周期的调节和妊娠有重要关系。雌、孕激素对雌性生殖系统具有重要的调节作用,二者与Ghrelin表达之间是否有关尚无定论。目前未见有关于Ghrelin在乌珠穆沁羊生殖道内的研究报道。本文在获得乌珠穆沁羊Ghrelin (usGhl) cDNA全序列的基础上,对生殖道各组织Ghrelin mRNA进行定位;系统研究了Ghrelin基因在不同发情期和妊娠期的乌珠穆沁羊雌性生殖道各组织内的相对表达量及其与外周血中雌激素和孕酮之间的相互关系;利用体外培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞研究雌、孕激素对Ghrelin基因表达量的调节作用;建立usGhl真核表达体系,初步证实构建的重组质粒对动物生长有促进作用。本论文为反刍动物生产性能的提高奠定基础。1.根据GenBank报道的Ghrelin cDNA序列设计特异性引物,运用RT-PCR技术和RACE技术成功克隆了usGhl cDNA全序列。本研究扩增的usGhl cDNA序列全长634bp,包含由116个氨基酸编码的前原乌珠穆沁羊Ghrelin肽。使用Blast网页和DNAStar软件对得到的usGhl cDNA全序列进行分析,无论是cDNA序列还是预测的成熟肽序列都与其它哺乳动物具有较高同源性。本研究结果表明Ghrelin基因在不同动物间表现出较高保守性。2.将乌珠穆沁羊子宫体Ghrelin RT-PCR产物回收并进行地高辛探针标记,用于原位杂交技术检测Ghrelin mRNA在乌珠穆沁羊子宫体、输卵管、宫颈、阴道中的表达位置。结果为:Ghrelin mRNA在内(黏)膜层的上皮细胞和腺体中大量表达,在固有层和肌层少量表达;肌肉组织、结缔组织和外膜层不表达。说明在绵羊雌性生殖道各组织中,Ghrelin mRNA主要表达于内(黏)膜表层细胞。3.运用RT-PCR技术证实Ghrelin基因在乌珠穆沁羊子宫体、输卵管、子宫颈、阴道组织内均有表达且表达量不同:子宫体表达量最高,输卵管次之,子宫颈和阴道内的表达量最少。采用实时荧光定量PCR技术及激素电化学发光测定法研究了乌珠穆沁羊发情及妊娠期生殖道各组织Ghrelin基因表达量与体内雌、孕激素之间的关系。本研究中血清雌二醇和孕酮在发情及妊娠期的浓度变化符合家畜生理周期的一般规律。乌珠穆沁羊生殖道各组织Ghrelin基因的表达量随发情周期及是否妊娠发生规律性改变。其中子宫体、子宫颈和输卵管内Ghrelin基因的表达与雌二醇及孕酮浓度的变化基本呈正相关。阴道内Ghrelin基因的表达与雌二醇及孕酮浓度的变化没有相关性。4.将机械法、细胞沉降及密度梯度离心结合使用,成功获得了原代和传代培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞。传一代的输卵管上皮细胞分别添加不同浓度的17-β-雌二醇和孕酮,分别培养24h、48h、72h后用RQ-PCR方法检测Ghrelin基因表达情况。结果显示:17-β-雌二醇和孕酮对体外培养的绵羊输卵管上皮细胞具有促进贴壁和促生长作用;培养时间对Ghrelin基因表达无影响;一定浓度的17-β-雌二醇和孕酮对培养的输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达有促进作用。5.培养的输卵管上皮细胞添加不同浓度他莫昔芬或米非司酮后再用17-β-雌二醇或孕酮刺激输卵管上皮细胞生长24h、48h、72h。使用RQ-PCR方法检测各组细胞Ghrelin基因表达情况。结果表明:他莫昔芬和米非司酮能够抑制培养的乌珠穆沁羊输卵管上皮细胞的生长;一定浓度他莫昔芬能降低17-β-雌二醇刺激的输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达,一定浓度米非司酮能降低孕酮刺激的输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达,且二者的抑制作用均呈现剂量依赖性;培养时间对输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达量无影响。说明雌、孕激素能够促进培养的绵羊输卵管上皮细胞内Ghrelin基因的表达,雌、孕激素是通过与其受体相结合发挥作用。6.本论文成功构建了Ghrelin真核表达质粒(pcDNA-usGhl),该质粒能在小鼠肌肉组织中特异性表达,并能维持约20天。按1μg质粒/g体重注射pcDNA-usGhl能促进小鼠生长。注射后第10～20天内,pcDNA-usGhl组体重均显着高于空质粒组(P<0.05),PcDNA-usGhl组小鼠的料重比与空质粒组小鼠相比有增加的趋势,但差异不显着。实验中没有发现Ghrelin重组质粒DNA整合到宿主染色体上。观察心脏、肝脏、肾脏、脑及肌肉均没有发现异常肿大及病变现象。
朱海东[6]1997年在《一种新的睾丸组织特异性核孔蛋白cDNA BS-63的克隆、特性分析及表达》文中提出精子的发生与成熟是一个十分复杂的过程，受多种蛋白的调节。越来越多的编码精子相关蛋白的基因已经被克隆、鉴定，它们在睾丸组织中的转录和翻译是十分复杂的，在精子发生中的作用也正在深入研究中。本课题组在以前的工作中曾从兔精子尾部分离、纯化了一种分子量为20KD的蛋白，命名为rSMP-B，用这种纯化蛋白去免疫成年雄兔，发现精子生成停滞于精子细胞阶段，rSMP-B的单克隆抗体可以抑制人精子穿透去透明带仓鼠卵，并可与人和大鼠睾丸细胞质中的一种特异性蛋白发生交叉反应，提示rSMP-B具有种属同源性，是一种在精子发生过程中发挥重要作用的蛋白。以rSMP-B的单克隆抗体筛选大鼠睾丸λ gt11 cDNA表达文库，得到一全长为2069bp的cDNA片段，命名为RSD-1，已被GenBank接收，接收号为U26723。 本论文工作即在此基础上，筛选得到了一相应的编码人精子相关蛋白的基因，并对其进行了深入的研究。首先以RSD-1 2.0kb为探针分别筛选人睾丸λ gt10 5′-stretch和λ ZAPⅡ两个cDNA文库，得到12个阳性克隆，又经过Southern blot的进一步验证。对其中三个较大的克隆H0620(2703bp)，H0609(1730bp)，H0324(1933bp)进行了核苷酸序列测定及同源性比较分析，发现这三个克隆之间存在着区域性同源、变异与缺失，可能是同一基因产物的不同转录形式，是由于mRNA的变位剪接引起的，这种多形式变位剪接的mRNA在特定生理条件下均有一定功能，可能与睾丸组织中精子发生具有严格的周期、阶段性有关。其中H0324号克隆全长1933bp，开放阅读框架为1824bp，编码608个氨基酸，计算编码蛋白的分子量为67KD，命名为BS-63，已经被GenBank收录，接收号为U64675。进一步查询GenBank进行同源性比较发现，BS-63的N端近2／3区域与从人Hela细胞表达文库中筛选出的核孔蛋白RanBP2(Nup358)高度同源。它们都具有脊椎动物核孔蛋白的典型特征，既含有XFXFG或FG重复序列，又有潜在的O-连接的GlcNAc糖基
何晓兵[7]2002年在《与大鼠受精相关的两种受体分子-GABA_BR和大鼠sp56的研究》文中提出β-氨基丁酸(GABA)能够模仿并强化孕酮（progesterone）诱发哺乳类精子发生顶体反应(Acrosome Reaction, AR)，说明哺乳类精子上存在有GABA样的受体。我们实验室以往的研究证明大鼠精子中确实表达了有功能的GABAAR，它负责介导了GABA和孕酮引发的顶体反应。本研究发现，在大鼠精子及睾丸中还表达了另外一种类型的GABA受体—GABABR。GABABR由GABABR1和GABABR2两种亚基才能形成有功能的受体。通过RT-PCR的方法，对GABABR在大鼠睾丸中的表达及其GABABR1的亚型进行了鉴定。结果显示，GABABR1及GABABR2在睾丸中均有表达；在睾丸中表达的GABABR1的剪切拼接体有GABABR1a、GABABR1c。GABABR1d在睾丸可能不表达；GABABR1b的表达与否还不能确定。Western Blot的结果显示，在大鼠睾丸组织和附睾尾精子中都有GABABR1a，GABABR1c/GABABR1b蛋白的表达，其分子量分别为130 KD 和100 KD；同时，GABABR2在大鼠睾丸和附睾尾精子也都有表达，但是GABABR2在成熟精子中的分子量比睾丸和大脑中的略大（~120 KD）。应用间接免疫荧光技术发现GABABR1和GABABR2都特异定位于大鼠精子的头部。睾丸中GABABR2的转录本与脑中的大小不同，缺失了后者3'非编码区最末端的2.2 Kb。GABA通过激活GABABR而负向调控了GABA或孕酮诱发的、由GABAAR介导的大鼠顶体反应。说明了GABA的两种受体在GABA或孕酮诱发的顶体反应的过程中存在着相互作用。这是哺乳类精子中第一次有关GABABR的组成和功能的研究报道。
李静[8]2006年在《前体mRNA剪接蛋白ZNF265的表达、调控及功能研究》文中研究指明锌指蛋白ZNF265(ZNF265,Zfp265,zis)于1997年由Karginova等人从大鼠的JG细胞(renal juxtaglomerular)中克隆到。JG细胞是位于肾动脉和肾小球紧密连接处的一类特化的肌内皮细胞,其主要功能是合成,分泌与储存肾素(renin)。作为肾素-血管紧张素系统(RAS)中的重要活性物质,肾素对于血管内血压及盐离子浓度的维持十分重要,然而关于JG细胞维持分化状态分泌肾素的分子机制却鲜有报导。ZNF265的mRNA存在于分化状态的具有分泌肾素功能的JG细胞中,但在非分化状态并且无分泌肾素功能的JG细胞中其表达消失。因此,ZNF265可能与JG细胞的分化状态和肾素分泌的功能相关。对ZNF265编码的序列分析表明,ZNF265具有两个新型的锌指结构,一个Ser-Are(SR)富集区,一个谷氨酸富集区和一个核定位信号(NLS)(图1),这些特征可能与前体mRNA剪接或成熟mRNA结合相关。2001年,Adams等人的研究发现,随着转染到细胞内的ZNF265表达质粒浓度的递增,ZNF265可以促使Tra-2β1前体mRNA第二、三个外显子的选择性剔除,导致截短型Tra-2β3剪接体增加。因此,ZNF265可能是一个参与选择性剪接的多功能蛋白,包括通过直接调节肾素前体mRNA的后加工过程或者通过对其他基因的调控间接影响JG细胞分化状态。本文的主要目的是检测ZNF265在细胞、组织中的表达及ZNF265在具有局部肾素-血管紧张素的组织中的表达调控,研究ZNF265对于肾素及其它相关基因前体mRNA剪接影响并探索ZNF265在JG细胞的去分化过程中的功能。首先我们通过RT-PCR等方法分析了ZNF265在人及小鼠各个组织中的表达谱,在小鼠的组织里,发现并克隆了ZNF265的一个新的亚型mZNF265-2,它在人体当中具有高度同源的对应体hZNF265-2。对ZNF265在不同组织的表达量的分析表明,ZNF265的两个亚型在人体及小鼠的各个组织当中均有表达,在20周的人胎组织中,ZNF265-1及ZNF265-2普遍表达,但表达水平随组织不同而有差异,如在大脑、小脑和肝组织中,两个亚型的转录体表达量基本相当(ZNF265-1/ZNF265-2的比值在0.9～1.1之间)。在心、肺、肠组织中,ZNF265-2的表达明显高于ZNF265-1的表达(ZNF265-1/ZNF265-2的比值在0.45～0.7之间);而在肾组织中,ZNF265-1的表达明显高于ZNF265-2的表达(ZNF265-1/ZNF265-2的比值为1.48)。相比之下,在小鼠的各个组织当中都以ZNF265-1的表达方式为主,且ZNF265-1相对与ZNF265-2的表达比例差异不大,大体为4:1左右。实验结果提示,ZNF265 mRNA的表达与所在组织的特异性密切相关,相对于小鼠,ZNF265 mRNA在人体当中的表达可能受到更复杂的调控。为了分析ZNF265在人及小鼠不同组织中的蛋白表达,我们首先针对ZNF265及其两个亚型制备了特异的抗血清并通过ELISA、GST融合蛋白原核表达等实验鉴定这些抗血清的特异性。Western blot结果显示,ZNF265-1蛋白在受检的人及小鼠各个组织中均有表达,并且在小鼠不同发育阶段具有不同的表达特征:初生小鼠各个组织ZNF265蛋白表达差异较小,而在成年小鼠中,ZNF265在肾、肺和心肌组织中表达量较高,在脑、肝等组织中的表达量较低。此外,在受检的人胎儿及小鼠组织中,我们没有检测到ZNF265-2蛋白的表达。实验结果说明,在人类及小鼠组织中以ZNF265-1蛋白表达为主,ZNF265-2可能仅作为转录体存在并不表达蛋白,或表达量低于可检测范围。作为一个参与选择性剪接的SR相关蛋白,ZNF265主要功能场所应该在细胞核内。用制备的兔抗ZNF265抗血清及Histag抗体,我们检测了内源性ZNF265蛋白及过表达ZNF265融合Histag蛋白在细胞内的表达,并观察了GFP融合ZNF265蛋白在COS1细胞内的表达分布。以上实验结果均表明,ZNF265主要在细胞核内分布,也验证了我们制备的兔抗ZNF265抗血清能用于免疫组化的检测。由于ZNF265可能与肾素分泌相关,本文检测了ZNF265在具有局部肾素-血管紧张素的小鼠生殖系统内的表达分布及所受调控。通过免疫组织化学、精子免疫细胞化学等的方法对ZNF265在生殖系统中的分布进行检测,研究结果表明,ZNF265蛋白特异性地分布在雌鼠卵巢的透明带,黄体和髓质细胞的核内,雄鼠精子尾部的中段和附睾主细胞近腔面的紧密连接处。这些分布与肾素-血管紧张素系统中的血管紧张素Ⅱ的表达分布具有相似性。另外,以正常小鼠为对照,在去势小鼠内的附睾中,ZNF265表达大大降低,而补加了睾酮后,ZNF265的表达恢复到正常水平。这一调控现象,和已报道的血管紧张素及其受体在附睾内的调控表达具有类似性。研究结果提示,ZNF265可能参与了对肾素-血管紧张素系统中相关基因的调节,此可能性尚有待进一步研究。相关报导表明,肾素在人体内有多个选择性剪接产物,分别为分泌型的肾型(Renin a)和不分泌型的脑型(Renin b)及肺型(Renin c)成熟转录体。作为前体mRNA的选择性剪接蛋白ZNF265,有可能通过对肾素前体mRNA的选择性剪接调控而参与调节肾素表达。因此我们构建了肾素小基因(ReninExon1-3)用于研究ZNF265是否对其具有选择性剪接的功能。其中外显子ReninExon1a和Renin Exon1c的选择性剪接为二者取一的模式,分别只存在于肾型和肺型的成熟转录体中。通过对肾素小基因剪接模型的研究表明,肾素小基因在体内的选择性剪接模式和细胞类型相关,ZNF265过量表达对肾素前体mRNA剪接模式没有影响。说明肾素的表达具有复杂的调控机制,与决定细胞类型的多种蛋白的综合作用相关。考虑到ZNF265在体内各个组织中均有表达,可能具有广泛作用。本文还构建了FGF-2R、GluR-B、hZis、mZis等小基因,并研究了ZNF265对SMN2、CFTR等疾病相关基因的选择性剪接的影响,其中FGF-2R、GluR-B为神经系统特异表达基因;SMN2和CFTR在体内广泛表达,SMN2外显子7的选择性剃除与脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)临床表型的严重程度密切相关,CFTR的成熟转录体缺少Exon9会引起先天性双侧输精管缺失(Congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD);hZis、mZis小基因则包含了人或小鼠ZNF265的9～11外显子的基因组DNA片段,用于研究ZNF265的自调控功能。研究结果表明,ZNF265的过量表达对于FGF-2R前体mRNA剪接没有明显影响。对于GluR-B、SMN2、CFTR等小基因,ZNF265的过量表达分别能促进GluR-B外显子14、SMN2外显子7和CFTR外显子9的选择性剃除,即促进它们的前体mRNA的截短型剪接并且这些截短型剪接产物的比例增加为ZNF265蛋白浓度依赖型。此外,我们的研究发现,ZNF265-2的过量表达可改变对hZis、mZis小基因的剪接方式,提示该剪接蛋白可能参与对自身前体mRNA的剪接调控。鉴于ZNF265具有典型的RNA结合结构域,以前的研究认为ZNF265可能与成熟mRNA结合。若ZNF265和JG细胞分化状态及肾素-血管紧张素系统的相关基因有表达调控的关系的话,ZNF265有可能通过与目标基因的mRNA结合调控目标基因的表达。鉴于诸多研究表明细胞周期蛋白调节因子和细胞分化状态有密切关系,本文用免疫共沉淀结合RT-PCR的方法不仅筛选了与ZNF265蛋白可能相结合的肾素-血管紧张素系统的相关基因的mRNA还筛选了与ZNF265蛋白可能相结合的多种细胞周期蛋白调节因子的mRNA。我们的研究表明,虽然ZNF265蛋白与肾素-血管紧张素系统的相关基因的mRNA没有直接结合的关系,但和细胞周期蛋白调节因子Cyclin B1、Cyclin D2的mRNA具有明显的结合关系,提示ZNF265对于细胞周期蛋白调节因子B1、D2的表达有调控关系。有证据表明,ZNF265蛋白家族的C4SR(爪蟾源)及Zfp265(大鼠源)在体外能和Cyclin B1转录体结合,这与我们的研究结果是一致的。细胞周期调节蛋白Cyclin B1和Cyclin D2与细胞的生长及分裂密切相关,在很多癌细胞和去分化细胞中都会过表达。因此ZNF265很可能通过参与对这些细胞周期调节蛋白mRNA稳定性或后加工等过程的调节而影响了JG细胞的去分化过程。综上所述,本论文围绕ZNF265在前体mRNA剪接中的功能和机制这一大方向,进行了初步的探索,对ZNF265的亚型,发育调控,在细胞及组织内的表达,在具有局部肾素-血管紧张素系统内受到的调控,在前体mRNA选择性剪接中的功能及作用的下游基因进行了研究。研究结果提示,作为一个有多个功能域的锌指蛋白,ZNF265对于基因的选择性剪接、细胞的分化及癌症、个体的发生及发育均具有重要的生理意义。
杜晨光[9]2008年在《绵羊卵巢及早期胚胎中Ghrelin的表达》文中研究表明Ghrelin是由日本科学家Kojima于1999年发现的目前为止第一个内源性的生长激素促分泌素受体( GHS-R)的配体。Ghrelin作为神经内分泌系统新发现的成员之一,其在刺激GH分泌和能量平衡调节中的地位已被肯定,而生殖活动作为动物机体代谢的特殊活动形式,与机体的能量代谢密不可分;促使我们重新认识Ghrelin在生殖活动中的作用。无论卵泡的生长、发育、成熟、退化和闭锁,黄体的形成以及退化,还是卵母细胞受精后早期胚胎的发育均与能量代谢密不可分,Ghrelin生物学功能在这一方面的积极作用,使我们自然而然的想到,Ghrelin是否参与了上述过程的转录和蛋白水平的剧烈变化并扮演了相应的角色。本论文以绵羊卵巢表达Ghrelin与否为切入点,首次系统的研究了绵羊卵巢以及早期胚胎发育过程中Ghrelin的表达情况,结果如下:1.Ghrelin在卵巢上的表达(1)首先,运用RT-PCR技术证实了Ghrelin mRNA在卵巢上的表达;(2)然后,将绵羊胃组织RT-PCR产物回收,经地高辛探针标记,应用原位杂交技术,检测了Ghrelin mRNA在卵巢中的定位情况,结果显示:Ghrelin mRNA在卵巢上呈广泛性分布,主要定位在原始卵泡、初级卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡中的颗粒细胞及卵母细胞,以及发情周期黄体和妊娠黄体,同时在卵巢表面上皮细胞原位杂交信号强烈;(3)最后,通过免疫组化技术证实,卵巢中Ghrelin在未孕羊卵巢中,卵泡处于早期、生长、发育阶段的卵泡均有Ghrelin的表达。卵泡内卵母细胞Ghrelin免疫染色信号明显强于颗粒细胞。颗粒细胞随着卵泡的发育,免疫组化阳性信号有所增强,而卵母细胞在各级卵泡中持续表达,同时卵巢表面上皮细胞免疫组化染色结果成强阳性。发情周期和妊娠黄体亦成强阳性表达,其中大黄体细胞表达量较高,且集中于各期黄体的大黄体细胞的胞质内,小黄体细胞表达量较少。为防止技术原因造成颗粒细胞表达的偏差我们还通过免疫荧光染色技术,进一步证实了有腔卵泡内卵丘细胞和壁层颗粒细胞是表达Ghrelin的,综合免疫组织化学的结果表明颗粒细胞免疫染色信号弱于卵母细胞。2.Ghrelin mRNA在有腔卵泡内各类型细胞以及各时期黄体的表达变化(1)首先,应用实时荧光定量RT-PCR技术检测了Ghrelin mRNA在有腔卵泡中(3-5mm)卵母细胞、卵丘细胞和壁层颗粒细胞在排卵/闭锁/退化前的表达变化,结果表明,Ghrelin mRNA表达水平没有显著性差异;(2)然后,应用体外成熟培养技术,每8h检测卵丘细胞Ghrelin mRNA的变化,结果表明Ghrelin mRNA随着卵丘细胞复合体成熟的进程而逐渐下降;(3)最后,通过实时荧光定量RT-PCR分析了发情后第3、9和15天卵巢上的黄体以及妊娠初期、早期、中期和晚期的黄体Ghrelin mRNA变化,结果表明在发情周期和妊娠黄体在形成初期和发育过程均具有较高Ghrelin mRNA表达水平,而在退化阶段均表现出了显著下降的结果(P<0.05)。这种变化与黄体在各时期所展现的功能相适应。3.Ghrelin在绵羊卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的表达(1)本实验通过实时定量RT-PCR技术和免疫荧光染色技术分别对mRNA水平和蛋白水平进行了分析,结果表明,Ghrelin mRNA表达水平在体内外所获得卵母细胞和早期胚胎均呈持续性表达,并呈现出一定动力学变化;Ghrelin亦成广泛性分布。A.在体外成熟后的卵母细胞、2细胞胚胎期和囊胚期胚胎Ghrelin mRNA相对表达量显著高于未成熟卵母细胞,4、8细胞胚胎期和桑椹胚;体内16、32细胞胚胎期和囊胚期胚胎Ghrelin mRNA相对表达量显著高于成熟卵母细胞和2、8细胞胚胎期,未成熟卵母细胞、4,8细胞胚胎期和桑椹胚表达量最低。B.免疫荧光结果表明,Ghrelin在体外未成熟和成熟卵母细胞以及4细胞胚胎期前,绿色荧光信号主要分布于远离胚胎中心的细胞膜及膜下区域;随着早期胚胎的发育,表达量逐渐增加;8细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中绿色荧光信号广泛分布于整个细胞质中;到了扩张囊胚期Ghrelin在内细胞团和滋养外胚层细胞中均丰富地表达。体内所获得的卵母细胞和早期胚胎绿色荧光主要分布于卵母细胞胞质内,并在成熟和卵裂后有所减弱。综合分析,体内所获得的卵母细胞和早期胚胎无论是mRNA水平还是蛋白水平均强于体外所获得的卵母细胞和早期胚胎。(2)进一步检测卵母细胞在成熟过程中Ghrelin mRNA的表达变化,结果表明卵母细胞Ghrelin mRNA随着卵丘卵母细胞复合体的成熟进程而逐渐升高。同时本实验在不同培养基中分别添加LH、FSH和E2,试图追寻是什么导致上述Ghrelin mRNA表达的升高,结果表明,血清和E2对Ghrelin mRNA的表达均有促进作用。本研究利用RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、原位杂交、免疫组织化学和免疫荧光技术检测了绵羊卵巢、早期胚胎Ghrelin的表达情况,研究结果充分表明,Ghrelin存在于卵巢和早期胚胎上,mRNA和蛋白分布均呈现广泛性表达,尤其是在卵母细胞中的表达,为深入研究Ghrelin在卵泡发生、发育以及早期胚胎发育过程中的作用提供了可靠依据,并为人们进一步揭示卵巢功能开辟了又一有益途径。
冯定远[10]2009年在《猪肌肉碱性氨基酸和葡萄糖转运载体cDNA克隆及mRNA表达调控的研究》文中研究说明氨基酸和葡萄糖转运载体表达与肌肉生长和肉质形成有十分密切的联系。氨基酸和葡萄糖转运载体转运的营养底物是骨骼肌生长发育的重要组成部分,品种、日龄、肌肉特性和营养等因素均可能使氨基酸和葡萄糖转运载体表达发生变化。为此,本论文开展了以下五个试验研究,旨在揭示猪骨骼肌部分氨基酸和葡萄糖转运载体发育性变化规律以及遗传因素和营养因素对其的影响,从而从分子水平探讨蓝塘猪和长白猪肌肉生长发育差异和乳酸菌对肉质产生影响的作用机制。试验一猪葡萄糖转运载体GLUT-1的克隆试验以6日龄健康长白猪骨骼肌为试验材料,成功克隆出猪葡萄糖转运载体GLUT-1基因cDNA的部分序列,其长度为792bp,与人和大鼠GLUT-1的cDNA序列比较发现同源性分别为92.7%和90.7%。试验二猪氨基酸转运载体CAT-2和葡萄糖转运载体GLUT-4的分子克隆试验采用RACE方法,根据GenBank中的公布序列或EST序列设计引物,以6日龄长白猪肌肉组织nRNA为模板,成功克隆猪氨基酸转运载体CAT-2和葡萄糖转运载体GLUT-4基因cDNA的全长序列。结果表明：(1)猪CAT-2 cDNA全长3147bp,包含一个1974bp的ORF,5'UTR (untranslated region)长85bp,3'UTR长1087 bp,编码657个氨基酸残基的蛋白质序列与碱性氨基酸转运家族SLC7A2基因有很高的同源性,其和人CAT-2A、CAT-2B以及小鼠CAT-2A、CAT-2B的同源性分别为91.3%、88.1%、92.1%和89.2%。跨膜区分析显示其有14个潜在的跨膜区,和其它物种的一致。(2)猪GLUT-4 cDNA全长2491bp,包含一个1530bp的ORF,5'UTR长34bp,3'UTR长927 bp,和人、兔子以及牛的GLUT-4 cDNA序列具有高度的同源性,尤其CDS区的同源性分别高达90.3%、90.3%和91.0%。CDS编码509个氨基酸,猪GLUT-4氨基酸序列与人、兔子以及小牛的GLUT-4氨基酸序列同源性分别为94.5%,95.1%和93.1%。跨膜区分析显示其有12个潜在的跨膜区,和其它物种的一致。试验三猪葡萄糖转运载体GLUT-1/4及碱性氨基酸转运载体CAT-2mRNA表达的组织特异性采集初生杂交仔猪心、肝、肺、肠、肾、脑和骨骼肌肌肉组织样品,提取组织样品的总RNA并进行反转录；用实时荧光定量PCR方法,检测猪GLUT-1/4及碱性氨基酸转运载体CAT-2在不同组织中的表达丰度。结果表明：(1)CAT-2在新生仔猪脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心都有一定的表达,而在心脏表达最高,其次是在肝、骨骼肌和肺,脑和肠道稍低,肾脏表达量最低。(2) GLUT-1在新生仔猪脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心都有一定的表达,而在心脏表达最高,其次是在肝、肾和脑组织,骨骼肌和肠道稍低,肺组织表达量最低。(2) GLUT-4在新生仔猪脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心都有一定的表达,而在心脏表达最高,其次是在肝、骨骼肌和脑组织,在肺、肾和肠道等组织的表达量较低。试验四蓝塘和长白猪骨骼肌GLUT-1/4、IR和CAT-2 mRNA表达发育性变化比较分别采集1、7、26、30、60、90和150日龄的蓝塘和长白两品种猪不同骨骼肌组织样品,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测猪GLUT-1／4及碱性氨基酸转运载体CAT-2mRNA在不同骨骼肌中的表达模式。结果表明：(1)1～150d蓝塘和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌葡萄糖转运载体GLUT-1存在相似的发育变化规律,在1d时表达水平最高。60d时蓝塘猪半膜肌GLUT-1 mRNA表达丰度高于同日龄长白猪(P<0.10)；150d时蓝塘猪半腱肌GLUT-1 mRNA表达丰度显著高于同日龄长白猪(P<0.05)。(2)1～150d蓝塘和长白猪半膜肌和半腱肌GLUT-4 mRNA相对表达丰度随日龄呈波形式变化,变化速度和程度存在品种差异。1d时蓝塘猪背最长肌GLUT-4 mRNA表达丰度低于同日龄长白猪(P<0.10),而在60d时显著高于长白猪(P<0.05)；在7d和60d时蓝塘猪半膜肌GLUT-4 mRNA表达丰度显著高于同日龄长白猪(P<0.05)；1d时蓝塘猪半腱肌GLUT-4 mRNA表达丰度显著低于同日龄长白猪(P<0.05),而在其它日龄时有高于同日龄长白猪的趋势,其中150d时蓝塘猪比长白猪高48.14%(P<0.10)。(3)蓝塘猪和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌胰岛素受体((IR) mRNA表达丰度在1d和30d时表现出较高水平,而在7d、60d、90d和150d时无明显差异；同日龄蓝塘和长白猪之间无显著性差异。(4)蓝塘猪和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌CAT-2 mRNA表达水平从出生1d时开始逐渐上升,在90d时达到最大值,且显著高于其它日龄,随后表现出下降趋势。试验五植物源性乳酸菌对长×大肥育猪骨骼肌葡萄糖和碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响试验选用体重58kg左右的长×大二元杂交阉公猪54头,随机分为两个处理,即对照组(A组)和乳酸菌组(B组),每个处理3个重复,每个重复9头。于试验结束时从每个重复选取2头接近平均体重的阉公猪进行放血屠宰。宰后2h内,按解剖学位置分别从背最长肌胸腰结合处、半腱肌中段和腰大肌中段采取组织样品,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测猪GLUT-1/4及碱性氨基酸转运载体CAT-2mRNA在不同部位骨骼肌中的表达模式。结果表明：(1)猪日粮中添加植物源性乳酸菌,对背最长肌、半腱肌和腰大肌总糖原含量无显著影响,但有提高背最长肌PG含量趋势(P<0.10)。(2)在猪背最长肌、半腱肌和腰大肌中,以腰大肌GLUT-1/4和IR mRNA表达水平最高；猪日粮中添加植物源性乳酸菌,对背最长肌、半腱肌和腰大肌GLUT-1/4以及IR mRNA相对表达丰度无显著影响。(3)猪日粮中添加植物源性乳酸菌,对猪背最长肌、半腱肌和腰大肌CAT-2mRNA表达丰度无显著影响,但有降低腰大肌CAT-2表达水平趋势。研究主要结论(1)猪葡萄糖转运载体GLUT-1基因cDNA的部分序列,与人和大鼠同源性分别为92.7%和90.7%。猪CAT-2 cDNA与碱性氨基酸转运家族SLC7A2基因有很高的同源性,其和人CAT-2A、CAT-2B以及小鼠CAT-2A、CAT-2B的同源性达91.3%、88.1%、92.1%和89.2%。14个潜在的跨膜区,和其它物种的一致。猪GLUT-4 cDNA和人、兔子以及牛的GLUT-4 cDNA序列具有高度的同源性。12个潜在的跨膜区,和其它物种的一致。(2) CAT-2 mRNA、GLUT-1 mRNA和GLUT-4 mRNA均在新生仔猪心脏表达最高。(3)蓝塘猪和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌中GLUT-4 mRNA表达水平明显高于GLUT-1;长白猪骨骼肌CAT-2 mRNA表达量最大值出现在90-150日龄期间；蓝塘猪和长白猪三个部位骨骼肌GLUT-4 mRNA表达丰度高峰期均未表现出与IR一致。(4)猪日粮中添加植物源性乳酸菌,以腰大肌GLUT-1/4和IR mRNA表达水平最高；同时有降低腰大肌CAT-2 mRNA表达水平趋势。
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