浙江省温州市人民医院病理科 325000
摘要：目的：分析DNA倍体和P53与乳腺浸润性导管癌临床病理学因素（患者年龄、肿瘤大小、临床病理分期、组织学分级、分子分型、淋巴结转移情况、有无癌栓）的相关性，并探讨P53与DNA倍体的相关性，从而为乳腺癌的诊断和治疗提供依据。方法：收集 XX 医院 2015 年 9 月至 2016 年 4 月间乳腺肿瘤患者 112 例，采用细胞 DNA 自动检测分析仪测定细胞核 DNA 含量，采用免疫组化的方法检测 P53，分析 DNA 倍体和 P53 与乳腺浸润性导管癌临床病理学因素的相关性以及 DNA 倍体与 P53 的关系。结果：良性肿瘤、导管内癌、浸润性导管癌三组的 DNA 异倍体率进行比较，差异具有统计学意义（χ2=48.823，P<0.001）。P53蛋白阳性表达与肿瘤组织分级有关（χ2=28.439，P<0.001）。P53 蛋白阳性表达细胞中 DNA 含量高于 P53 蛋白阴性表达细胞（t=2.18，P=0.033） 采用 spearman’s 秩相关进一步分析 P53 蛋白表达与DNA 含量的相关性，结果表明 P53 蛋白（r=0.753，P<0.01）表达与 DNA 含量呈正相关。结论：恶性肿瘤中DNA倍体率明显高于良性肿瘤，提示细胞 DNA定量对肿瘤良恶性鉴别有重要价值。DNA含量与组织分级和分子分型有关，组织分级越高，DNA含量越高，提示肿瘤的恶性度越高。P53阳性表达与组织分级、分子分型及淋巴结转移有关；DNA含量越高和P53阳 性表达与乳腺癌患者的年龄，肿瘤大小、临床病理分期和有无癌栓无关。
关键词：乳腺癌 DNA倍体：P53：临床病理：相关性
DNA 整倍体是指被检测细胞的 DNA 含量是二倍体细胞 DNA 含量的整数倍[1]，而非整倍体则是二倍体细胞的非整数倍。通常将 DNA非整倍体称为 DNA异倍体。P53 基因是一种肿瘤抑癌基因，位于第 17 号染色体长臂 13.1 区域，分子量为 53KD，能够调控细胞周期和诱导细胞凋亡。研究发现 P53 突变基因存在于多种肿瘤组织中，如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等[3，4-7]。据统计国外约有15%-71%的乳腺癌患者存在 P53 基因突变[8]，国内 P53 在乳腺癌患者中的阳性表达率平均约为 45%[9]。然而，乳腺癌患者 P53 基因表达与临床病理的相关性国内外尚无统一结论。鉴于 DNA 倍体和 P53与肿瘤的发生有一定的关联，本研究的目的是分析 DNA 倍体和 P53与乳腺癌临床病理学特征（患者年龄、肿瘤大小、临床病理分期、组织学分级、分子分型、淋巴结转移情况、有无癌栓等）的相关性，并探讨 P53、DNA 倍体的相关性，从而为乳腺癌的诊断和治疗提供依据。
材料和方法
1 病例标本
收集 XX 医院 2015 年 9 月至 2016 年 4 月间乳腺肿瘤患者 112 例，其 中良性肿瘤患者 30 例（乳腺纤维腺瘤 18 例、导管内乳头状瘤 2 例、乳腺增生症 10 例、），恶性肿瘤患者 82 例（导管内癌 16 例、浸润性导管癌 66 例）。其中，66 例乳腺浸润性导管癌患者均有完整的临床病理资料，且术前均未曾接受放疗和化疗。
2.方法
2.1 细胞 DNA 定量分析
术中冰冻送检乳腺标本沿最大面切开，肉眼观察典型的病变区，用载玻片轻触压病变区，制成印片 1 张，将细胞印片风干后进行 Feulgen 染色，染色具体步骤如下：1. 95%无水乙醇 10 分钟；2.无水乙醇 15 分钟；3.B.S 液 15 分钟；4.水漂洗 5-6 次；5.5N 盐酸 60 分钟；6.水漂洗 5-6 次；7.DNA 染液 67 分钟；8.水漂洗 5-6 次；9.无水乙醇 8 分钟 10.晾干，封片，贴标签。将 Feulgen 染色片置于DNA-ICMII 的显微镜载物台上，人工调试到 20X 的物镜上，自动扫描和聚焦，将载玻片上有细胞的部分，划分成 1080 个小区域，逐一区域扫描，并记录扫描数据；以同一玻片上 100 个正常上皮细胞或部分淋巴细胞核 DNA 含量作为正常2 倍体（2c）参照细胞，其 CV（变异系数）值小于 5%，AcCell 系统根据不同细胞成分具有的不同特征参数来自动完成细胞分类和计数过程，如正常上皮细胞、增生或癌变细胞、淋巴细胞、中性白细胞。分析细胞数>1000 个，并在镜下剔除严重退变细胞、重叠细胞和细胞碎片、杂质等非检测目标，完成检测，扫描完成后，系统自动绘制横轴为 IOD（Integrated Optical Density）值、纵轴为细胞核面积分布图，以及横轴为 IOD 值，纵轴为细胞数量的 DNA 含量分布直方图，并同时给出了平均 DI 值（DNA index）、标准差、变异系数，并显示扫描细胞 DNA含量最高的前 20 例细胞的 IOD 值。
2.1.1 结果判读
根据 ACCell 系统诊断软件所做的细胞 DNA 倍体分析结果和建议有如下三种情况：1. 正常 2 倍体（DNA 定量为 2C）细胞为主，未见异倍体细胞及异倍体峰诊断为正常。2. 4C 细胞大于被测细胞总数的 5%，但未见异倍体细胞，诊断为增生。3. 出现 3 个或 3 个以上>5C 的细胞或出现异倍体细胞峰，诊断为阳性。
2.1.2 ICM 分析系统特定的参数：
细胞 DNA 自动检测分析仪（ICM）是通过测定染色细胞核的 IOD 值来判断核的 DNA 相对含量，IOD 也叫吸光光密度。常用 DNA 指数来表示 DNA 含量，DNA 指数（DI）=被测细胞 DNA IOD 值/标准细胞 DNA（G0/G1）IOD 平均值。全自动 DNA 倍体分析系统能自动测出不正常上皮细胞的 DI 均值，并且设定 DI 在 1-2 之间为正常。
2.2 免疫组化检测
2.2.1 EnVision 法染色（P53）采用 EnVision 两步法，DAB 显色。具体步骤如下：（1）切片：石蜡标本经切片机连续 4um 厚切片，阳离子防脱片捞片后置于 60 摄氏度烤箱中 2 小时。（2）脱蜡：依次将切片放入二甲苯及梯度酒精中脱蜡（100%－100%－95%－90%－80%－70%）。每个试剂放 10 分钟。（3）抗原修复：蒸馏水冲洗，加入 3%H2O2浸泡 10 分钟，在蒸馏水中洗 3 次，再 PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。再加入 EDTA，放入高压锅中蒸煮 2 分半。取出后自来水冲洗 10 分钟，蒸馏水洗 3 次，PBS 洗3 次，每次 3 分钟。（4）加一抗：加入一抗后于 4 摄氏度冰箱中保存过夜。（5）加二抗：PBS 中洗 3 次，每次 3 分钟，加上二抗，置于 37 摄氏度温箱中半小时。（6）加显色剂：PBS 中洗 3 次，每次 3 分钟，加上显色剂。（试剂 C1 1 滴加C2 1ml）。期间显微镜下观察切片显色情况。（7）复染：先用清水洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色半分钟。（8）脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将切片放入梯度酒精中，每个放置 2 分钟，最后浸泡在二甲苯中。（9）封片：用中性树胶封片。实验中用已知 P53 阳性的高级别的卵巢浆液性乳头状囊腺癌做为阳性对照。
2.2.2 结果判读
P53 的判读：P53 蛋白定位在细胞核上，出现弥漫强阳性时视为（+），散在细胞阳性或细胞阳性强弱不等时均视为阴性。
2.3 统计学方法
采用以 SPSS13.0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差来表示，两组比较采用 t 检验，多组比较采用方差分析；计数资料以率来表示，多组比较采用χ2 检验。变量间相关性分析采用 Spearman’s 秩相关。P<0.05 为认为差异具有统计学意义。
3.结果
良性肿瘤、导管内癌、浸润性导管癌三组的 DNA 异倍体率进行比较，差异具有统计学意义（χ2=48.823，P<0.001），见表 1。浸润性导管癌组织中的 DNA异倍体率高于导管内癌组织（χ2=7.208，P=0.007）和良性肿瘤组织（χ2=45.672，P<0.001），导管内癌组织中的 DNA 异倍体率高于良性肿瘤组织（χ2=7.109，P=0.008）。
4.讨论
DNA 倍体是衡量细胞核中 DNA 含量的客观指标，一般 DNA 含量越高，染色体越不稳定，细胞恶性程度越高。乳腺癌发生及发展中细胞核内的染色体发生改变，最终形成非整倍体的肿瘤。而依据腺管形成多少、细胞异型性程度、核分裂像多少的变化可将肿瘤组织分为Ⅰ级（低度恶性）、Ⅱ级（中度恶性）、和Ⅲ级（高度恶性）[10]。核的异型性越大，肿瘤的非整体越多，则恶性度就越高，其组织学分级也就越高。Martinez-Arribas[38]等人对 280 例乳腺癌患者进行研究，发现 DNA 含量与组织学分级存在相关性。Michel[11]分析了 607 例乳腺癌患者的 DNA，结果表明 DNA 异倍体与组织学分级显著相关。Cufer[34]等人研究同样发现了 DNA 倍体与组织学之间的相关性（P<0.0001），证实 DNA 含量可反应乳腺癌的分化程度。王成[12]等人分析了 72 例浸润性导管癌患者的 DNA 含量（DI 值）与组织学分级的关系，发现不同分级的浸润性导管癌患者的 DNA 含量差异具有统计学意义（P<0.05）本研究也证实了这一观点。
5.结论
恶性肿瘤中DNA倍体率明显高于良性肿瘤，提示细胞DNA定量对肿瘤良恶性鉴别有重要价值。
DNA含量与组织分级和分子分型有关，组织分级越高，DNA含量越高，提示肿瘤的恶性度越高。DNA含量与乳腺癌患者的年龄，肿瘤大小、临床分期、有无癌栓及腋窝淋巴结转移无关；P53阳性表达与组织分级、分子分型及淋巴结转移有关；与乳腺癌患者的年龄，肿瘤大小、临床病理分期和有无癌栓无关。
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[12]Alimirah F，Panchanathan R，Davis FJ，et al Restoration of P53 expression in human cancer cell lines upregulates the expression of Notch1：implications for cancer cell fate determination after genotoxic stress. Neoplasia，2007，9（5）：427-434.
论文作者:郑张帆1,陈艳梅2,柴晓玲3
论文发表刊物:《健康世界》2017年13期
论文发表时间:2017/9/30
标签：细胞论文; 导管论文; 乳腺癌论文; 含量论文; 肿瘤论文; 患者论文; 阳性论文; 《健康世界》2017年13期论文;