（天水中西医结合医院 甘肃天水 741020）
【摘要】目的：建立金银咽炎颗粒的微生物限度检查方法。方法：采用《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”项下方法进行微生物限度检查方法学验证。结果：金银咽炎颗粒对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有较强的抑菌作用，增加稀释倍数（1:100）后，明显消除了抑菌性；常规法检查霉菌和酵母菌，回收比值均在 0.5～2.0；控制菌的检查采用常规法。结论：本方法确立了金银咽炎颗粒的微生物限度检查方法，为制定微生物限度标准提供了依据。
【关键词】金银咽炎颗粒；微生物限度检查；常规法；稀释法
【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）30-0342-02
金银咽炎颗粒是天水市中西医结合医院临床经验方，由金银花、玄参、麦冬、牛蒡子、桔梗、陈皮、甘草等多味药材组成。具有清热解毒，宣肺利咽之功效。其中金银花和玄参具有抑菌和杀菌作用[1-3]。含有抑菌作用的药物制剂在进行微生物限度检查时，应采用适宜的方法消除抑菌性，从而保证检测结果的准确性。《中国药典》2015年版与2010年版相比，在微生物限度检查方法和指导原则上均有较多修订，本文参考《中国药典》2015年版[4]四部（通则1105、1106和1107）的要求，建立适合金银咽炎颗粒的微生物限度检查法并进行验证，客观地反映药物中微生物的污染状况，确保微生物限度检查方法科学、准确。
1.仪器与材料
1.1 仪器
YM50压力灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）、FA2004电子天平（上海民桥精密仪器有限公司）、SW-CJ-1FD净化工作台（苏州博莱尔净化设备有限公司）、BHC-1300Ⅱ生物安全柜（苏州净化设备有限公司）、SHA-B水浴恒温振荡器（江苏中和仪器有限公司）、SPX-250B生化培养箱（上海博泰实验设备有限公司）、MJP-80霉菌培养箱（西安仪贝尔仪器设备有限公司）。
1.2 菌种
金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC (B) 10104〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC(B) 63501〕、大肠埃希菌〔CMCC (B) 44102〕、白色念珠菌〔CMCC(F) 98001〕和黑曲霉〔CMCC(F) 98003〕购于中国食品药品检验研究院。
1.3 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液均购自北京三药科技开发公司。培养基适用性检查均符合规定。
1.4 样品：金银咽炎颗粒（天水市中西医结合医院制剂室，20170701、20170702、20170703）
2.方法与结果
参照《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度检查法[4]进行验证。
2.1 菌液的制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18～24小时，取此培养物1ml至pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml中，采用10倍递增稀释法，稀释至稀释至l0-3～10-5，制成适宜浓度的菌悬液。
接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取此培养液1ml至pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml中，采用10倍递增稀释法，稀释至l0-3～10-5，制成适宜浓度的菌悬液。
将黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天后，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱产生的孢子，然后用管口有纱布的无菌吸管吸出孢子液置无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-2～10-4，制成适宜浓度的孢子悬液。
2.2 供试液制备
取本品10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，置37℃水浴振摇，混合均匀，静置，制成1:10供试液，备用。为了筛选消除抑菌活性的方法，另将1:10供试液用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1:100的供试液。
2.3 需氧菌总数计数方法适用性试验
试验组：取“2.2”项下1:10和1:100供试液适量分别置于无菌试管中，在试管中分别加入“2.1”项下用于需氧菌总数计数的5种菌液混匀，使每1ml供试液中含菌量≤100cfu，取上述含有菌液的供试液1ml注入平皿中，平行制备2皿，注入胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝，在30～35℃下培养3天。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。计算各菌株回收比值，回收比值=（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）/菌液对照组的平均菌落数，结果见表1。
结果表明，用常规方法进行需氧菌计数检查时，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收比值＜0.5，故方法不可行。当改用增加稀释液（1:100）进行验证时，上述5种需氧菌的回收比值位于0.5～2之间，无抑菌作用，可采用平皿法进行供试品的需氧菌总数计数方法检验。
2.4 霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验
取“2.2”项下1:10供试液置于无菌试管中，在试管中分别加入“2.1”项下霉菌或酵母菌菌液混匀，使每1ml供试液中含菌量≤100cfu，取含有菌液的供试液1ml注入平皿中，平行制备2皿，注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝，20～25℃培养。测定试验组菌落数，同法测定菌液组和供试品对照组菌落数。回收比值结果见表2。
结果表明，本品对霉菌和酵母菌的回收比值位于0.5～2之间，可确定供试液在该检验条件下无抑菌作用，可采用平皿法进行供试品的霉菌和酵母菌总数计数方法检验。
2.5 控制菌（大肠埃希菌）检查方法适用性试验
试验组：取1:10供试液10ml和菌量≤100cfu的大肠埃希菌接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中。
供试品对照组：取1:10供试液10ml接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中。
阳性对照组：取菌量≤100cfu的大肠埃希菌接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中。
阴性对照组：取0.9%无菌氯化钠溶液10ml接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中。
以上各组在30～35℃培养18～24小时后，取1ml培养物分别接种至100ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃培养24～48小时后，取麦康凯液体培养基培养物划线接种在麦康凯琼脂培养基平板上，并于30～35℃培18～72小时。结果见表3。
结果表明，试验组和阳性对照组的大肠埃希菌都生长良好，供试品对照组和阴性对照组均未见菌落生长，说明可采用常规法进行控制菌检查。
2.6 样品检测
取样品，按照“2.2”项下方法制备供试液，应用已验证的微生物限度检查方法进行检验，结果需氧菌、霉菌和酵母菌均符合限度要求，未检出大肠埃希菌。
3.讨论
《中国药典》2015年版中微生物限度检查与2010年版相比有较大的变动[5-6]微生物计数改为需氧菌总数和酵母总数，培养基由营养琼脂和玫瑰红钠琼脂更改为广谱性的胰酪大豆胨琼脂和沙氏葡萄糖琼脂。2015年版药典收录去除供试品抑菌作用的方法有：增加稀释液或培养基体积、加入适宜的中和剂或灭活剂、采用薄膜过滤法或上述几种方法的联合使用[4]，因此用配制不同稀释级别供试液的方法来验证，结果表明，供试品对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等试验菌株有较强的抑菌作用，通过增加稀释液（1:100）进行需氧菌总数计数验证，结果各规定菌株的回收比值均达到药典要求。本方法严格按照2015年版药典中相关要求进行验证，其结果能够真实的反应药品受微生物污染程度，可用于金银咽炎颗粒的质量控制。
【参考文献】
[1]冯秀丽，许庆华，赵晓云，等.金银花及其复方的体外抑菌活性与体内抗炎作用[J].沈阳药科大学学报，2013，30:35-39.
[2]徐荣.基于生物抑菌活性的金银花颗粒效价测定方法[J].中国药师，2016，19(2):369-371.
[3]少英，贾丽娜，刘德发，等.玄参叶的抗菌和毒性作用[J].福建中医药，1986，17(4):57.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典.四部[S].北京:中国医药科技出版社，2015:140.
[5]李趣嫦，江艳芳.《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较[J].中国药品标准，2015，16:86-90.
[6]景荣先，张国林.2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨[J].中国卫生产业，2015(5):184.
论文作者:程晓雪
论文发表刊物:《心理医生》2017年30期
论文发表时间:2017/12/8
标签：培养基论文; 微生物论文; 琼脂论文; 方法论文; 药典论文; 限度论文; 氯化钠论文; 《心理医生》2017年30期论文;