罗琛[1]2002年在《利用荧光原位杂交技术进行胚胎种植前遗传学诊断的研究及初步临床应用》文中提出目的：1．建立安全、可行的胚胎活检方法；2．建立准确、可靠、稳定的可以应用于胚胎种植前遗传学诊断的FISH技术；3．利用荧光原位杂交技术对多元核发育而成的胚胎进行研究，分析多元核发育而成的胚胎染色体的异常性；4．利用荧光原位杂交技术对发育迟缓和胚胎碎片多的胚胎进行21号染色体分析，探讨21号染色体非整倍性与胚胎形态学指征的相关性；5．将荧光原位杂交技术应用于临床的胚胎种植前遗传学诊断。 方法：1．以小鼠8-细胞期胚胎为材料，利用酸性Tyrode's法或机械切割法打孔，进行活检吸出1个卵裂球细胞，观察活检后小鼠胚胎的发育情况和囊胚形成率，比较两种方法是否有差异；2．收集受精后第叁天的细胞数≤3的胚胎，进行固定和荧光原位杂交。3、将多原核发育成的受精后第二天的胚胎收集起来，用X染色体计数探针(CEPX，SpectrumGreen)和Y染色体计数探针(CEPY，SpectrumOrange)探针进行荧光原位杂交，观察IVF受精和ICSI受精的两组胚胎性染色体异常情况。4．将发育迟缓组和胚胎碎片40％组的胚胎，用21号染色体特殊位点探针(LSI21，SpectrumOrange)探针进行荧光原位杂交，观察两组胚胎21染色体异常情况；5．对具有PGD的临床医学指征的患者进行PGD周期治疗，挑选相适应的探针，将IVF-ET、胚胎活检和FISH技术叁者结合起来，开展临床应用。 结果：1．酸性Tyrode's打孔法和机械切割法两种活检方法，酸性Tyrode's打孔法活检成功率高于机械切割打孔法，两者活检的成功率有显着性差异；酸性Tyrode's打孔活检方法、机械切割打孔活检方法和未活检对照组的囊胚形成率，两两比较无显着性差异。2．胚胎固定杂交后，固定率为95．gi％，杂交率为93．62％；3．多原核发育成的胚胎IVF受精和ICSI受精的两组，IW受精后的3PN与ICSI受精的3PN的两组胚胎性染色体异常率进行比较，有显着性差异。4PN发育而成的胚胎很少，两组比较无统计学意义。4．发育迟缓组和胚胎碎片40％组的胚胎与正常胚胎的ZI染色体异常率有显着性差别。5．利用FISH技术共进行9个周期的PGD治疗，活检成功率96％，FISH杂交成功率为95．83％，妊娠成功2周期，成功率为22．22％。 结论：1．酸性Tyrode、打孔法活检成功率高于机械切割打孔法，而且酸性Tyfodeb打孔法操作较机械切割打孔法简单易掌握，决定在以后实验中以酸性Tyodeb打孔活检方法为主要的活检方法。2．在所选用和改进的方法步骤进行荧光原位杂交，结果显示，其方法稳定、杂交率高，与国外报告文献结果相似，可以作为PGD研究和临床应用的方法。3．IVF受精和 ICSI受精的3PN胚胎发育有差异，证明＊F受精和 ICSI受精的3PN中的原核的来源是不同，导致胚胎第一次卵裂的方式也不同。IVF受精和 ICSI受精的3PN胚胎的性染色体的异常率非常高，正常H倍体出现的比例极低，分别为：3I7％和 2．94％。因此，在胚胎移植时多原核发育成的胚胎必须淘汰4．胚胎卵裂的速度和胚胎碎片的多少与胚胎内部染色体的非整倍性存在着相关性。目前在不损伤胚胎的前提下还不能对胚胎的染色体进行全面的分析时，在选择胚胎移植，有必要选择形态和卵裂速度都正常的胚胎。5．利用FISH技术进行PGD治疗9周期，获得2例妊娠，说明本中心也具备了开展PGD临床应用的基础和能力。
郝燕[2]2012年在《两轮荧光原位杂交技术在种植前遗传学诊断中的应用》文中指出第一部分两轮荧光原位杂交技术应用的初步研究目的：在废弃胚胎中应用一快速、简便的单细胞核固定和两轮FISH检测技术，探究其可行性，同时分析植入前胚胎中非整倍体和嵌合体的发生情况。方法：收集本中心行IVF或ICSI不适合移植的第3天废弃胚胎24枚，每枚胚胎的卵裂球数目不少于4，在显微操作采用激光打孔法在胚胎透明带上打出合适的孔，然后用活检针对胚胎进行活检，使培养皿液滴中出现单个分散卵裂球。每个胚胎活检2～3个卵裂球转移至防脱载玻片上，采用HCL/Tween20方法进行核固定，核固定后，应用两轮FISH方法对8种关键染色体：13，15，16，18，21，22，X和Y进行分析，计算杂交成功率并分析非整倍体和嵌合体的发生情况。结果：两轮FISH均能见到较清晰的杂交信号；24枚胚胎共活检72个卵裂球，固定到69个核，核的固定成功率为95.8%，69个核中65个核信号诊断明确，其FISH杂交成功率为94.2%；24枚胚胎中，正常胚胎6枚，异常胚胎18枚，18枚异常胚胎中，多倍体胚胎2枚，单倍体胚胎1枚，非整倍体胚胎8枚，嵌合体胚胎7枚。结论：两轮荧光原位杂交方法在植入前第3天的废弃胚胎中成功地被应用，具有简单、快速、准确等特点。第二部分两轮FISH技术在植入前胚胎遗传学诊断中的应用目的：探究此两轮FISH技术、卵裂球活检以及核固定方法应用于临床16个PGD周期的可行性。方法：采用本中心常规控制性超排卵方案排卵，取卵后行卵母细胞浆单精子注射，受精第3天对胚胎发育情况进行观察，选择正常受精来源、胚胎卵裂球数目在6细胞以上，胚胎碎片20%以内的胚胎行卵裂球活检。采用HCL/Tween20方法进行核固定。根据患者染色体情况选择相应探针进行荧光原位杂交，活检后的胚胎转入囊胚期胚胎培养液（Cook，USA）中继续培养。最后根据FISH结果和第5天胚胎发育情况选择合适的胚胎移植。结果：16个周期共对染色体组成正常或平衡的27个胚胎进行宫腔内移植，共获得4例妊娠，妊娠成功率为25%。1例14天测尿HCG（+），现正在等待35天B超结果；另3例除1例为异位妊娠外，另2例均为正常单胎妊娠：1例患者尚在妊娠之中，另1名患者现已足月分娩一健康女婴，体重2800g，该婴儿为安徽省第一位通过“FISH法”种植前遗传学诊断技术诞生的染色体易位患者的后代。结论：说明通过此方法帮助具有高遗传风险夫妇获得健康后代是可行的，同时也说明本中心已具备开展PGD的能力。
黎青, 孙筱放, 陈欣洁, 孔舒, 郑育红[3]2005年在《同步多色荧光原位杂交技术的建立及临床应用》文中进行了进一步梳理目的 :建立同步多色荧光原位杂交技术在外周血、羊水及单个胚胎细胞及骨髓细胞等样本中的实验方法 ,探索其在细胞遗传学、产前诊断、胚胎种植前诊断以及在血液病中的应用。方法 :取外周血淋巴细胞、羊水细胞和不适于胚胎移植及冷藏的受精胚胎细胞、骨髓细胞分别制片 ,用相应的荧光标记的探针进行原位杂交 ,荧光显微镜取图分析。结果 :建立获得稳定可行的各类标本的实验方法。结论 :应用多色荧光原位杂交技术可对染色体进行快速准确的诊断 ,并可应用于产前诊断和胚胎种植前诊断及血液病的诊断。
史秋雯[4]2013年在《染色体非整倍体精子荧光原位杂交及胚胎植入前筛查的基础与应用研究》文中研究表明早期胚胎中普遍存在染色体非整倍体现象是导致辅助生殖技术(Assisted reproductive technology, ART)治疗结局不理想的主要原因。目前,ART主要通过胚胎形态评分法选择优质胚胎进行移植,但不能排除非整倍体胚胎。胚胎植入前染色体非整倍体筛查(preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening, PGS)在体外受精(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF/Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)过程中借助荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技术,对第3天胚胎进行活检分析,筛选出遗传正常的胚胎移植入母体子宫,将提高胚胎种植率,降低流产率,并能减少生育叁体患儿的风险。目前,国内的相关研究报道较少,且多数仅选用X、Y或21号染色体探针,进行胚胎性别和叁体诊断,而提高种植率及降低流产率则至少需选用8条染色体(即13,15,16,18,21,22,X和Y染色体)探针。另外,分析精子中的非整倍体率,可为正确评估患者生育子代的遗传风险提供依据。关于克氏征嵌合型患者精子非整倍体的研究报道较少,另外,关于ART中常用的精液优化处理方法能否降低性染色体非整倍体患者精子中的非整倍体率,目前尚未见报道。本研究拟建立用11种不同的染色体探针(在8条探针基础上,增加1,7,17号染色体探针)对单卵裂球进行FISH分析的PGS技术,并对第3天胚胎中的嵌合体现象进行探讨。同时,对克氏征嵌合型患者的精子进行染色体非整倍体分析,并比较分析嵌合型克氏征患者及超雄综合征患者精液未经优化处理及经密度梯度离心法、上游法处理后的精子非整倍体率。研究分为叁个部分进行。第一部分FISH在性染色体非整倍体患者外周血标本中的检测目的：建立应用叁组杂交对11种染色体(1,7,13,15,16,17,18,21,22,X,Y染色体)进行检测的淋巴细胞FISH技术；比较克氏征嵌合型患者的外周血FISH结果与G现代核型分析结果。方法：培养收获正常男性外周血淋巴细胞,将11条探针分为叁组混合,即PB探针(含13,16,18,21,22号染色体探针)、混合探针1(含X,Y及17号染色体探针)及混合探针2(含1,7,15号染色体探针),进行FISH杂交,若信号不理想,则调整探针浓度或实验条件；培养收获叁例克氏征嵌合体患者的淋巴细胞,应用叁色FISH分析17、X、Y染色体,并与G显带核型分析结果进行统计学比较。结果：PB探针的细胞信号率为98.7%(512/519)；混合探针1的混合探针1的细胞信号率为99.0%(502/507)；混合探针2的细胞信号率为98.6%。3例患者的外周血FISH结果与G显带核型分析结果相比,嵌合体比例均无统计学差异(P=0.868,0.755,0.644),但FISH诊断发现病例1存在小比例的47,XYY细胞系。第二部分FISH在性染色体非整倍体患者精液标本中的检测目的：探讨嵌合型克氏征患者(XY/XXY)及超雄综合征患者(XYY)精子中的非整倍体率,评估其子代遗传风险；比较克氏征嵌合型和超雄综合征患者未经优化处理及经密度梯度离心法、上游法处理后的精子非整倍体率,为其在IVF/ICSI治疗中选择精液处理方法提供依据。方法：3例XY/XXY患者、2例XYY患者及1例对照者手淫法取精,待液化后将每份患者精液标本分成3份,分别用离心浓缩、密度梯度离心及上游法处理,制片固定,并进行叁色FISH杂交对精子17、X、Y染色体进行分析。将每例患者精子离心浓缩处理后FISH结果与对照者进行统计学比较；比较XY/XXY患者精子经叁种方法处理后的非整倍体率；比较XYY患者精子经叁种方法处理后的非整倍体率。结果：与对照组相比,叁例嵌合型克氏征患者的X：Y与对照组相比差异均无统计学意义(P值均>0.05),精子染色体异常率增高、XY精子比例增高,病例1差异无统计学意义(P>0.05)；病例2、3差异有统计学意义(P值均<0.05)；两例超雄综合征患者的X：Y与对照组相比差异均无统计学意义(P值均>0.05),总精子异常率、YY精子及XY精子比例增高,病例4的XY精子与精子异常率增高明显(P值均<0.05),病例5的YY精子与精子异常率增高明显(P值均<0.05)。精液处理前及分别经两种优选方法处理后,精子染色体异常率无统计学差异(P>0.05)。第叁部分FISH在植入前胚胎非整倍体筛查中的应用目的：建立用11种不同的染色体探针(1,7,13,15,16,17,18,21,22,X,Y号染色体探针)进行叁轮FISH杂交检测单卵裂球的技术,同时探讨第3天胚胎中的嵌合体现象。方法：收集IVF/ICSI治疗周期中,受精后第3天的废弃新鲜胚胎44枚,及捐赠的冷冻胚胎16枚。蛋白酶消化透明带,从32枚废弃新鲜胚胎和12枚捐赠冷冻胚胎中吸取单卵裂球,剩余16枚胚胎中吸取≥2个卵裂球,用0.2%Tween-20/0.01N HCl+甲醇/冰醋酸(3：1)法固定,用11种染色体探针分叁轮杂交对固定的细胞核进行FISH分析。结果：共获112个卵裂球,成功固定核108个,成功率为96.4%；FISH杂交后,103个核信号完整,杂交成功率为95.4%；分析单卵裂球的44枚胚胎中,应用5条、8条、11条探针的胚胎异常检出率分别为29.5%、54.5%和65.9；应用11条探针检测胚胎的正常率为34.1%,其中捐赠冷冻胚胎的正常率为41.7%,废弃新鲜胚胎的正常率为31.3%,两者相比无统计学差异(P>0.05)。分析≥2个卵裂球的16枚胚胎中7个为嵌合型,嵌合体率为43.8%,且都为二倍体嵌合型。结论：1.克氏征嵌合型患者及超雄综合征患者精子多数为整倍体精子,且X与Y精子数量相近,精子非整倍体率轻度增高,主要为XY精子增多。2.梯度离心法和上游法均不能降低克氏征嵌合型和超雄综合征患者精子中的非整倍体率。3.建立了应用11色探针进行叁轮FISH杂交诊断单卵裂球的实验技术。4.在PGS诊断中,使用8条染色体探针(在5条基础上,增加15、16、22号染色体探针)较使用5条探针(13、18、21、X、Y染色体探针)明显提高胚胎异常检出率,使用11条探针(在8条基础上,增加1、7、17号染色体探针)可进一步提高异常胚胎的检出率。5.以形态学为标准的优质胚胎仍具有较高的染色体非整倍体率,以形态学指标为胚胎选择标准具有局限性。6.嵌合体现象在第3天胚胎中广泛存在,且以二倍体嵌合型为主。
牛子儒[5]2013年在《马凡综合征植入前遗传学诊断技术初步研究》文中提出【背景】马凡综合征是一常染色体显性遗传性病，主要累及纤维结缔组织，其病变的微纤维主要牵累叁个组织器官系统：骨骼、眼和心血管,患者常因心血管因素致死，杂合子患者有50%的可能性将这种疾病遗传给后代，希望通过辅助生殖技术来避免患儿的出生。1978年英国剑桥的Steptoe和Edwards教授通力合作，应用体外受精-胚胎移植技术孕育了世界上第一例“试管婴儿”。30多年来，随着生殖医学及其相关学科研究的不断深入，辅助生殖技术应用日渐广泛，植入前遗传学诊断逐渐推广，减少了基因类疾病的遗传，实现优生优育。【目的】初步建立马凡综合征的胚胎植入前遗传学诊断技术体系。【方法】1.通过对一例马凡综合征患者家系进行调查，找到致病突变位点及其在家系的遗传情况。2.对已经证实为马凡综合患者的外周血单个核细胞和行IVF/ICSI后夫妻双方同意捐献的异常受精和发育不良的废弃胚胎，进行外周血单细胞，单卵裂球及MⅡ卵母细胞应用MDA方法进行全基因组扩增，并对扩增产物进行已知突变位点的特异性PCR，产物进行测序，分析测序结果，探讨单细胞水平进行突变位点检测的可行性。3.利用患者自身的SNP和STR位点分析，找到与突变位点连锁的多态性遗传学标记。【结果】1.本例马凡综合征患者的突变位点为一新生突变c.2647T>C(Trp883Arg)。2.其外周血单细胞WGA产物进行PCR后测序可以测出与患者外周血DNA测序发病位点一致的碱基突变。非马凡综合征患者胚胎的单卵裂球及MⅡ卵母细胞未测得相应的碱基突变。3.可以采用患者自身的SNP位点及D15S123，D15S978和D15S1028叁个STR位点作为遗传连锁标记。【结论】1.通过对本例马凡综合征患者的家系调查，发现本患者的突变极有可能为一新生突变。对于新生突变的多态性连锁标记寻找需要依靠单倍型分析。2.本研究为探讨马凡综合征PGD的可行性，根据单基因遗传病PGD常用的遗传学与分子生物学技术，运用WGA及PCR技术初步建立了单细胞全基因组扩增技术和扩增产物的测序技术，构建了较为稳定的单细胞单基因疾病诊断的方法体系。3.初步分析可以作为目的基因的多态性连锁标记：单核苷酸多态性位点和微卫星位点，为进一步研究及临床应用打下了基础。研究还需进一步进行单个精子的扩增分析，获得患者的单倍型信息，找到与患者突变位点连锁的多态性标记。
田立霞[6]2006年在《单细胞荧光原位杂交技术应用于植入前胚胎非整倍性筛查的研究》文中研究指明单细胞荧光原位杂交技术应用于植入前胚胎非整倍性筛查的研究 为验证早期胚胎活检卵裂球的染色体构成在胚胎发育过程中是否具有代表性,以及活检是否影响其后胚胎发育。本研究以解冻的冷冻胚胎为研究对象,从D3胚胎中活检两个卵裂球,然后把活检的胚胎继续培养到第5天,对活检的卵裂球和D5胚胎的卵裂球分别进行五色荧光探针的FISH分析(13、18、21、X和Y)。活检两个卵裂球D3胚胎的中,第5天得到确认分析的有15枚,其中10枚胚胎的诊断结果得到确认。早期胚胎卵裂球活检未见影响该活检胚胎的发育潜力,D3胚胎分析两个卵裂球得到的诊断结果的确认率从不同的角度解释是不一样的,原始诊断的确认率从临床角度高于从细胞遗传学角度。
吴畏[7]2005年在《染色体异常者的胚胎植入前遗传学诊断研究》文中研究指明近二十余年来,随着辅助生育技术(ARTs)和分子生物学技术的蓬勃发展,人类对自身生殖过程的认识有了巨大进步,尤其是分子遗传学技术与辅助生育技术的有机结合,开辟了一项产前诊断的新领域即植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)。胚胎植入前遗传学诊断是遗传缺陷者产前诊断的新方案,也是产前诊断的最早期形式,它将常规产前诊断提早到胚胎在子宫腔着床之前,可以避免反复流产,也避免了常规的产前诊断所面临选择性流产的窘境及伴随的伦理道德观念的冲突。 染色体异常是产前遗传学诊断的重要内容,也是不孕不育的重要原因之一。染色体异常包括染色体数目异常和染色体结构异常。1)染色体数目可分为整倍体和非整倍体,非整倍体是染色体数目异常中较特殊的一类,同时也是最常见的人类染色体异常,在新生儿中至少有0.3%,在死产中有4%,而在自然流产中接近50%。另外,随着母亲年龄的增长,非整倍体胚胎比例也增高。人群中染色体数目异常以13,18,21,X和Y染色体为最多见。2)在染色体异常中染色体结构异常占了很大一部分,包括易位(translocation),倒位(inversion),染色体内部重组(intrachromosomal rearrangements)和微缺失(microdeletion)等。人群中染色体异常主要是易位和倒位,是平衡易
徐艳文, 庄广伦[8]2004年在《植入前遗传学诊断技术研究的新进展》文中认为近二十余年来人类对自身生殖过程的认识有了巨大的进步。而同期发展起来的辅助生殖技术与分子遗传学技术的有机结合，使人们能够在种植之前的早期胚胎中取出部分细胞检测疾病，从而筛选出正常胚胎进行宫腔内移植，即植入前遗传学诊断(pre(?)mplantation genetic diagnosis,PGD)。PGD 是产前诊断的最早期形式，但与产前诊断不同，
孟金来[9]2008年在《孕妇血浆中胎儿DNA和比较基因组杂交技术在产前诊断中的应用研究》文中进行了进一步梳理第一部分孕妇血浆中胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用研究产前诊断分为有创性和无创性两种,传统的产前诊断取材方法包括绒毛取样和羊膜腔穿刺以及脐带穿刺均属创伤性手段,容易造成流产、胎盘出血、宫内感染等并发症。无创性产前诊断已成为当前研究热点。无创性产前诊断的取材以往多以母血中胎儿细胞为研究对象,但其数量极少,难以有效地分离纯化和富集。近年来孕妇外周血中游离胎儿DNA的发现为无创性产前诊断开辟了新领域。目前,游离胎儿DNA已经广泛用于性染色体连锁疾病、胎儿RhD血型的检测、妊娠相关疾病、胎儿染色体病等的产前诊断研究中。然而,有些研究结论如孕妇外周血中胎儿DNA含量与常见染色体病的关系尚不完全一致,特别是对国内孕妇群体的研究报道很少,并且对于孕妇外周血中游离胎儿DNA的组织来源和释放机制尚不清楚。另外,目前利用游离DNA产前诊断胎儿血型的研究均为RH系统,而在我国ABO母儿血型不合发病率高,是新生儿溶血病的主要原因,ABO血型的产前诊断对于血型不合的预防和治疗等具有重要意义。本研究分为二部分。第一部分为定性研究。通过对O型血孕妇血浆中游离胎儿DNA进行定性检测,以探讨利用孕妇外周血中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿ABO血型的可行性。第二部分为定量研究。利用实时定量PCR技术,对妊娠21叁体孕妇和唐氏高危孕妇及正常孕妇的血浆中DNA进行定量检测,目的是寻找一种无创性、快捷、经济的产前筛查唐氏综合征胎儿的新方法;同时探讨游离胎儿DNA的来源和含量变化的机制,以便为游离胎儿DNA更好地应用于无创性产前诊断奠定基础。论文Ⅰ利用孕妇血浆中游离DNA进行无创性产前诊断胎儿ABO血型背景和目的:ABO母儿血型不合虽发病时较轻但在我国发病率高且可导致各种不良妊娠结局,是新生儿溶血病的主要原因。产前诊断胎儿ABO血型能够为血型不合的预防和治疗提供依据。由于种族的不同,国外对胎儿血型的无创性产前诊断多集中于RH血型方面,但有关ABO血型的无创性产前诊断尚未见相关报道。为此本研究通过提取O型血孕妇血浆中的游离DNA,利用PCR-SSP(polymerasechain reaction with sequence-specific primers)技术对胎儿ABO血型基因型进行了无创性产前诊断的研究,目的是探讨这一无创性产前诊断方法的可行性和准确性。方法:选择孕中晚期单胎O型血孕妇105例,其丈夫血型为非O型。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取孕妇血浆中游离DNA;采用QIAamp DNA BloodMaxi Kit提取脐血基因组DNA,PCR-SSP方法检测ABO血型基因型,基因分型采用A~(1,2)BO~(1,2)方法。同时对夫妇双方及其新生儿用传统的血清学方法检测其ABO血型表现型。在利用游离DNA获得胎儿血型结果之前,对新生儿的血型表现型是未知的。结果:(1)利用脐血DNA,105例孕妇新生儿血型经PCR-SSP方法均正确诊断。(2)利用孕妇血浆中游离DNA,93例胎儿血型基因型与脐血DNA血型基因型相符,即诊断符合率为88.6%(93/105)。12例血型产前诊断不符的胎儿均来自于66例妊娠非O型血胎儿的孕妇;39例妊娠O型血胎儿的孕妇的胎儿血型基因型均正确检出。另外,孕中期的诊断符合率低于孕晚期。(3)5例经产妇本次妊娠胎儿血型与以前子女血型不同,但利用孕妇血浆中游离DNA均能准确检测。结论:利用O型血孕妇血浆中游离DNA进行无创性产前诊断胎儿ABO血型是一种可行途径,PCR-SSP方法检测ABO血型基因型结果可靠,且简单快捷,易于操作,值得在母儿血型不合和新生儿溶血病的预防、诊断等应用、推广。论文Ⅱ实时定量PCR检测孕妇血浆中DNA及其在唐氏筛查中的应用背景和目的:唐氏综合征(Down's syndrome,DS)即21叁体综合征,是最常见的染色体病之一,也是产前筛查的重点。虽然利用孕中期母体血清生化指标筛查DS的方法很安全,但是筛查效果并不理想。孕妇外周血中游离胎儿DNA的发现为无创性产前筛查和诊断唐氏综合征开启了一条新思路。实时定量PCR是一种近些年发展起来的不仅能够定性而且能够进行基因定量的新的PCR检测技术。本研究拟采用TagMan探针实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术,通过测定妊娠DS胎儿孕妇和唐氏高危孕妇血浆中游离胎儿DNA含量,寻找一种无创性的产前筛查DS的新方法;同时,通过观察游离胎儿DNA含量与孕妇血β-HCG浓度的关系,对孕妇血浆中游离胎儿DNA的组织来源以及含量变化的机制作深入的探讨,为游离胎儿DNA更好的应用于无创性产前诊断奠定基础。方法:选择妊娠DS男胎孕妇5例;唐氏高危孕妇39例,其中孕男胎孕妇21例;唐氏低危正常孕妇42例,其中孕男胎孕妇22例。QIAamp Blood DNA MiniKit提取孕妇血浆中游离DNA,采用化学发光免疫分析法测定孕妇血清β-HCG值,Real-time PCR定量检测孕妇血浆中游离DNA含量,其中DYS14基因和β-actin基因分别代表孕妇血浆中胎儿DNA和孕妇血浆总DNA。通过组间可比性控制,比较正常妊娠组、妊娠DS组妇女及唐氏筛查高危孕妇血浆中游离胎儿DNA的含量,同时对孕妇的血浆中胎儿DNA含量与血β-HCG浓度进行Pearson相关分析。结果:(1)建立了Real-time PCR检测DYS14基因及β-actin基因定量标准曲线。(2)Real-time PCR方法检测DYS14基因的敏感性和特异性均为100%。(3)妊娠DS男胎孕妇血浆中胎儿DNA含量127.4±58.4 GE/ml是正常男胎孕妇48.5±20.8-GE/ml的3.1倍,是唐氏高危男胎孕妇78.4±28.0GE/ml的1.4倍,唐氏高危男胎孕妇血浆中胎儿DNA含量也明显高于正常男胎孕妇,以上两两比较,经t检验差异具有显着性(P<0.01);妊娠DS男胎孕妇、唐氏高危男胎孕妇和正常男胎孕妇叁组之间,经两两比较,其血浆中总DNA含量无统计学差异(P>0.05)。(4)妊娠DS男胎孕妇血β-HCG浓度96.8±42.9 IU/ml明显高于唐氏高危男胎孕妇58.1±25.3 IU/ml和正常男胎孕妇38.1±19.4 IU/ml,唐氏高危男胎孕妇血β-HCG浓度也明显高于正常男胎孕妇,两两比较,经t检验差异具有显着性(P<0.01)。(5)孕妇的血浆中胎儿DNA含量与血β-HCG浓度两者相关且具有统计学极显着性意义(r=0.86,P<0.0001)。结论:(1)Real-time PCR技术具有敏感、特异、快速、操作简便、高通量等优点,适合于临床大规模产前筛查及诊断,利用其进行无创性产前诊断胎儿性别的灵敏度和特异性可达100%。(2)孕妇血浆中的游离胎儿DNA的定量检测可以作为产前筛查DS的候选指标。(3)胎儿DNA含量需联合其它指标才能有效地反映胎儿的发育情况,才可以作为唐氏筛查的有效诊断手段。(4)β-HCG是唐氏筛查的敏感标志物之一。(5)游离胎儿DNA升高与血β-HCG变化密切相关,本文在国内首次提出合体滋养层细胞是孕妇血浆中游离胎儿DNA主要来源,DS妊娠孕妇血浆中胎儿DNA异常升高的发病机制为合体滋养层细胞凋亡增加、破坏后释放进入母血循环所造成。第二部分比较基因组杂交技术的改进及其在产前诊断染色体异常中的应用背景与目的:目前经典的细胞遗传学方法-染色体核型分析和荧光原位杂交在研究染色体畸变方面起了重要作用,但也存在明显的局限性,前者容易因为外部污染、培养失败或母体细胞的选择性生长导致误差,后者应用的探针并不适用于所有染色体不平衡的产前筛查,只局限于染色体特定区域。而新近的比较基因组杂交(Comparative Genomic Hybridization,CGH)技术可应用于各种标本,而且仅需要很少量的细胞或组织成分,不需特殊探针或预先知道畸变发生部位,只需一次杂交实验即可对整个基因组进行检测,能够提供详细的染色体扩增或丢失信息。现在CGH已被广泛应用于分子遗传学研究,在产前诊断方面的研究和应用也逐渐成为热点。本研究通过对CGH技术进行改进,拟建立方便实用的CGH方法路线,即荧光互换CGH。并采用这一技术对部分产前筛查高危病例及畸形胎儿进行产前胎儿染色体检查,通过与传统细胞遗传学结果比较,以检验其敏感性和可靠性。为产前诊断胎儿染色体异常提供一个更好的有益的手段,以提高围产儿优生率,同时为更好的认识和分析畸形胎儿的病因机制奠定基础。同时这一技术平台的建立对于下一步利用CGH更好的开展胚胎植入前遗传学诊断以及应用母体外周血中胎儿细胞进行无创性产前诊断胎儿染色体异常都具有很深的意义。方法:选取唐氏综合征筛查结果为高风险并且细胞遗传学结果异常的孕妇5例,因胎儿畸形、死胎引产的孕妇12例。采用Tiangen DNA抽提试剂盒提取研究对象羊水或脐血基因组DNA,Vysis缺口平移试剂盒标记待测DNA和对照DNA,每份样本均分别标记SpectrumGreen和SpectrumRed。将等量的SpectrumGreen标记的待测DNA、SpectrumRed标记的正常对照DNA与Cot-1 DNA混匀、沉淀、制成混合探针,加至正常中期染色体玻片的杂交区域,73℃共变性,37℃杂交48-72小时,然后洗片、复染,荧光显微镜进行中期染色体分裂相的选择、摄像。同时进行荧光互换CGH:将待测DNA和对照DNA的荧光颜色互换,即SpectrumRed标记待测DNA、SpectrumGreen标记正常对照DNA。最后使用CGH软件进行图像分析,根据绿红两种信号的比值,即每一染色体上的荧光强度比(fluorescence intensity ratio,FR)制作CGH拷贝数核型模式图,以1.0表示平衡比例,FR阈值定为1.25和0.75,叁体或染色体片段的扩增定义为FR>1.25,1.5以上视为高水平扩增;单体或染色体片段的缺失定义为FR<0.75。细胞遗传学结果在CGH实验分析结束后知晓。结果:(1)本实验建立的CGH方法杂交效果好,染色体涂染均匀,背景干净。来自17例入选孕妇的胎儿样本均成功的利用荧光互换CGH方法进行了分析、确认。(2)荧光互换CGH共检出21叁体3例,18叁体和45,XO各1例,与细胞遗传学分析结果完全一致。2例CGH和细胞遗传学分析均未发现染色体缺失或扩增,其中1例为Dandy-Walker畸形。(3)1例细胞遗传学分析仅能判断4号染色体的长臂远端部分缺失,而荧光互换CGH发现该病例是4号染色体4q32-qter的缺失,其核型为46,XY,Del 4q32-qter。(4)9例孕妇由于羊水/脐血太少或死胎致培养失败等原因未能进行细胞遗传学分析,其中3例CGH检测出染色体不平衡并通过荧光互换CGH得到了确认。1例CGH核型为Dup 21,初步考虑该患儿核型为21叁体,但在荧光互换CGH中仅检测到了21q的扩增;1例荧光互换CGH证实核型为Del 2p24-pter,Dup 12p13;1例在排除了22p异染色质区域的杂交偏移后,其CGH核型为Del 1p33-pter,Del 22q11-12,结合临床考虑为腭-心-面综合征。结论:(1)在CGH流程中有诸多因素会影响最终的分析结果,荧光互换CGH能够最大程度的排除在实验过程中可能产生的误差,同时对变性方法进行改善,大大增加了染色体异常病例检出的准确性和可靠性。目前这一方便实用的荧光互换CGH路线系本文首次报道。(2)荧光互换CGH可靠准确,为更好地产前诊断胎儿染色体异常提供了一个有益的手段,特别是对于传统细胞遗传学无法进行分析时尤有意义,而且较传统细胞核型分析更加灵敏,可以作为产前诊断中传统核型分析的有益和必要补充。(3)染色体某些片段的异常与胎儿某种畸形有对应关系,染色体异常是胎儿畸形的重要病因之一,但是部分畸形如Dandy-Walker等并非染色体异常。
岳晓静[10]2013年在《深度测序对单细胞21-叁体诊断的可行性研究》文中进行了进一步梳理【背景】非整倍体是最常见的染色体异常，可导致胚胎停育与自发流产，是限制试管婴儿成功率的重要原因之一。胚胎植入前遗传学筛查（preimplatationgenetic screening，PGS）是筛选染色体数目和结构正常的胚胎进行移植，以此期望提高移植成功率与妊娠率。目前PGS技术主要包括:原位荧光杂交技术、比较基因组杂交以及微阵列比较基因组杂交和单核苷酸多态性芯片技术等，但各项技术均存在缺点。为了寻找一种更快速、全面检测非整倍体的方法，我们以二代测序技术为基础，尝试一种新方法完成对单细胞21-叁体的诊断，从而建立该技术平台为后续研究奠定基础。【目的】初步建立深度测序技术在单细胞水平诊断21叁体的技术平台【方法】采用深度测序技术对正常女性外周血DNA进行检测，评估该方法检测的稳定性。对不同浓度DNA的21-叁体样本应用多重置换扩增方法进行全基因组扩增，对其产物进行深度测序，评估该方法对21-叁体诊断的可行性。利用深度测序技术对单细胞21-叁体样本进行检测，初步建立深度测序方法检测单细胞-21叁体的技术平台。【结果】1.采用深度测序方法对14例样本进行检测，各染色体标准差均处于低水平，其中最大标准差为0.078。21-叁体样本21号染色体拷贝数是正常样本21号染色体拷贝数的1.5倍，其余染色体与正常样本相比未发现拷贝数的明显异常。3. cut off值0.5、1、1.5分别代表单倍体、二倍体和叁倍体，21-叁体样本测序结果显示21号染色体cut off均值为1.586，其99%可信区间为[1.537,1.635]。采用深度测序方法检测单细胞21-叁体具有可行性。【结论】1.采用深度测序方法检测正常女性DNA具有稳定性。2.通过对不同浓度DNA模板扩增产物进行深度测序，证实该检测方法对诊断21-叁体具有可行性。3.深度测序方法检测单细胞-21叁体具有可行性。
参考文献：
[1]. 利用荧光原位杂交技术进行胚胎种植前遗传学诊断的研究及初步临床应用[D]. 罗琛. 第一军医大学. 2002
[2]. 两轮荧光原位杂交技术在种植前遗传学诊断中的应用[D]. 郝燕. 安徽医科大学. 2012
[3]. 同步多色荧光原位杂交技术的建立及临床应用[J]. 黎青, 孙筱放, 陈欣洁, 孔舒, 郑育红. 北京大学学报(医学版). 2005
[4]. 染色体非整倍体精子荧光原位杂交及胚胎植入前筛查的基础与应用研究[D]. 史秋雯. 广西医科大学. 2013
[5]. 马凡综合征植入前遗传学诊断技术初步研究[D]. 牛子儒. 中国人民解放军医学院. 2013
[6]. 单细胞荧光原位杂交技术应用于植入前胚胎非整倍性筛查的研究[D]. 田立霞. 第二军医大学. 2006
[7]. 染色体异常者的胚胎植入前遗传学诊断研究[D]. 吴畏. 南京医科大学. 2005
[8]. 植入前遗传学诊断技术研究的新进展[J]. 徐艳文, 庄广伦. 北京大学学报(医学版). 2004
[9]. 孕妇血浆中胎儿DNA和比较基因组杂交技术在产前诊断中的应用研究[D]. 孟金来. 山东大学. 2008
[10]. 深度测序对单细胞21-叁体诊断的可行性研究[D]. 岳晓静. 中国人民解放军医学院. 2013
标签：基础医学论文; 荧光原位杂交论文; 遗传学论文; 宫内诊断论文; 胚胎停育论文; 染色体检查论文; 胚胎论文; 染色体易位论文; 基因探针论文; 染色体异常论文; 畸形精子论文; dna提取论文; 怀孕论文; 孕妇论文;