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【摘 要】目的：分析评价溶解曲线法检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药的临床应用价值。方法：收集结核病患者痰液、胸腹腔积液、脑脊液、灌洗液、脓液等经培养证实为结核分枝杆菌的阳性标本70例，对分离的结核分枝杆菌菌株同时用溶解曲线法和培养法进行异烟肼和利福平耐药性检测。结果：溶解曲线法检测异烟肼的灵敏度为94.44％，特异度为96.15％，与培养法检测的符合率为97.14％；检测利福平的灵敏度为100％，特异度为92.16％，与培养法检测的符合率为94.29％。结论：溶解曲线法检测在快速检测结核患者异烟肼、利福平耐药方面具有较高的临床应用价值。
【关键词】结核分枝杆菌；耐药；溶解曲线法
世界卫生组织在1992年将同时耐异烟肼和利福平的结核病定义为耐多药结核病，耐多药结核病存在治疗周期长、高治疗成本和低治愈率等问题[1]。快速地对分枝杆菌异烟肼及利福平耐药性测定，对治疗方案的制定和结核病流行非常重要的意义。随着分子生物学的发展，开发出了多种快速、客观、准确的耐药基因检测新诊断方法，如线性探针技术、基因芯片技术及探针熔解曲线技术等[2]。近年来已有一些实验室的研究分析熔解曲线技术对结核分枝杆菌耐药性的测定。本文从临床应用角度观察，对PCＲ熔解曲线法结果总结，以培养法药敏试验作为金标准，分析熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药性的敏感度和特异度，探讨其在耐药结核病的诊断意义和应用价值。
1资料与方法
1.1一般资料
收集我院2017年1-2018年12月结核病患者痰液、胸腹腔积液、脑脊液、灌洗液、脓液等经培养证实为结核分枝杆菌的阳性标本70例，对分离的结核分枝杆菌菌株同时用溶解曲线法和培养法进行异烟肼和利福平耐药性检测。
1.2方法
研究设计：以传统培养法为金标准，通过计算灵敏度、特异度、符合率等指标评价溶解曲线法检测异烟肼、利福平耐药的临床价值。
检测方法：培养法药敏试验是采用世界卫生组织/国际防痨和肺病联合会（WHO/IUATLD）推荐的比例法，所用对照和基础培养基为无淀粉改良罗氏培养基，分别对异烟肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampin，RFP）开展药物敏感性试验。含药培养基中药物终浓度为：INH：0。2μg/ml，RFP：40μg/ml。用标准接种环分别取１满环（即0。01ml）10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面。接种后的培养基置于３６℃恒温培养箱内培养，４周后报告结果。计算耐药百分比，耐药性以在临界药物浓度生长菌落的百分数来表示，即试验管（含药培养基）菌落数与对照管（不含药培养基）菌落数之比＞１％为耐药。耐药突变检测：采用荧光PCR溶解曲线法，所用标本为经PNB生长试验鉴定为结核分枝杆菌复合群的菌种。按试剂说明书提取DNA并进行扩增，同时设立阴性和阳性对照。检测的Tm值由仪器自动判读，通过比较所检测样品与阳性对照之间溶解曲线的熔点（Tm值）的差异判断样品是否发生突变。当四个通道中样品的点与阳性对照的熔点均一致（误差不超过１℃）时判定为野生型，试验菌株对异烟肼（或利福平）敏感；四个通道任一通道中样品的熔点低于阳性对照２℃及以上时（△Tm=２℃）判定为突变型，试验菌株对异烟肼（或利福平）耐药。
1.3统计学方法
采用SPSS19．0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2.1异烟肼耐药检测结果比较
70株结核分枝杆菌分离株中，培养法药敏试验显示，18株对异烟肼耐药，52株对异烟肼敏感；经溶解曲线法检测，对异烟肼耐药的19株，敏感的51株。以培养法为金标准，溶解度曲线法检测异烟肼的灵敏度为94.44％，特异度为96.15％。异烟肼经两种方法检测相符的68株，符合率为97.14％，不符的2株，其中1株培养法检测为敏感而耐药突变检测为耐药，另１株培养法检测为耐药而耐药突变检测为敏感。
表1 2种方法检测异烟肼耐药结果比较（n）
3.讨论
结核分枝杆菌耐药性呈逐年上升趋势，异烟肼和利福平作为主要抗结核一线药物，其耐药性检测对于临床结核病药物治疗具有重要意义[3]。根据本文临床观察分析，在初治患者中，PCＲ溶解曲线法与培养药敏法相比，熔解曲线法在分枝杆菌检测利福平和异烟肼耐药上具有很高的灵敏性和特异性，检测异烟肼、利福平耐药性的结果具有较好的一致性，PCＲ熔解曲线法可应用于临床利福平和异烟肼耐药的快速检测和筛查。
作为一种实验方法，溶解曲线法也有其局限性：（１）该实验只筛选核酸序列而不是氨基酸序列，因此，有可能不引起氨基酸改变的突变也会被判为突变，如本研究中出现的培养法显示敏感但溶解曲线法检测到突变；（２）该产品从方法学上不能区分具体突变位点，因此，报告为突变的结果并不绝对表示耐药。溶解曲线法作为一种新兴的耐药结核病检测方法，其检测结果与传统培养法具有较好的一致性，但大大缩短了检测时间，将检测时间由原来的４周缩短至３h，为耐药结核患者的及时治疗赢得了宝贵的时间，同时对控制耐药结核病的传播具有重要的意义。
参考文献：
[1]孙勇，李传友，许绍发．结核分枝杆菌耐药机制的研究进展[J]．国际呼吸杂志，２０１０，３０（２４）：１５０１-１５０５．
[2] 陆峰，王小平，符剑，等．241例耐多药肺结核患者未治疗原因分析[J]．江苏预防医学，2016，27（3）：313—314．
[3] 沈鑫，潘启超，肖和平.结核病研究新进展［J］.上海预防医学，2016，28（3）：143-146.
论文作者:杜巍
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2019年2月上第3期
论文发表时间:2019/5/17
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