吕浩
（河北省保定市第一医院 河北保定 071000）
【摘要】目的：探讨人紫杉醇耐药细胞株LOVO/TAX的建立及其耐药机制。方法：建立紫杉醇耐药细胞株LOVO/TAX，并且对其生物学和耐药特点进行初步研究。结果：和亲本细胞对比，耐药细胞株的细胞周期变化更为明显，表现为GO/G1期的细胞比例增加明显，P<0.05；S期细胞减少，但是无差异，P>0.05；G2/M期细胞比例明显减少，阻滞明显低于LOVO，P<0.05。结论：本研究成功建立人紫杉醇耐药细胞株LOVO/TAX，证实CDKI基因过表达是导致结肠癌细胞对紫杉醇耐药的重要原因，初步证明人紫杉醇耐药形成的机制，为紫杉醇耐药机制的逆转研究提供一定的参考依据。
【关键词】人紫杉醇耐药细胞株；LOVO/TAX；耐药机制
【中图分类号】R735.35 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）12-0346-02
双萜类天然产物紫杉醇来自于短叶紫杉和红豆杉的树皮，是一种广谱抗肿瘤的药物，对微管起作用，目前应用于晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌中疗效明显；但是由于耐药的产生，紫杉醇的应用受到了限制[1]。紫杉醇的耐药机制比较复杂，和多种机制有关，并且不同的肿瘤其作用机制有所不同。因此，需要建立不同的多药耐药细胞模型进行耐药机制分析，寻找抗耐药的靶点。目前为止，乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、非小细胞癌等紫杉醇耐药细胞模型已经得以建立，并且正开展相应的耐药机制研究[2]。本研究建立紫杉醇耐药细胞株LOVO/TAX，并且对其生物学和耐药特点进行初步研究，探讨人紫杉醇耐药细胞株LOVO/TAX的建立和耐药机制。现报告如下。
1.资料与方法
1.1 基本资料
采用人结肠癌LOVO细胞株（中国科学院上海细胞库），细胞培养液包括以下：RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶（0.25%），CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所），PI细胞凋亡双染试剂盒（美国BD），SYBR染料法荧光定量试剂盒（日本）。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 使用胎牛血清（10%）、青霉素（50U/ml）、链霉素（100U/ml）培养亲本细胞LOVO和耐药细胞LOVO/TAX，放在RPMI1640培养液中，在室温下放在二氧化碳培养箱（5%）进行培养，使用胰蛋白酶进行消化传代，3天1次，取对数细胞进行试验。
1.2.2耐药细胞诱导 使用体外浓度梯度递增方法进行诱导，建立LOVO/TAX耐药细胞株。初始紫杉醇浓度为0.05umol/L，对LOVO细胞起作用，24小时后，更换培养液，脱药培养2周。选择生长状态良好的LOVO细胞，使用浓度较高的紫杉醇进行诱导，稳定生长后，提高药物浓度，重复传导的操作步骤。10个月后，建立起LOVO/TAX耐药细胞株。
1.2.3体外试验 试验前需对耐药细胞株进行脱药培养2周。把对数生长的亲本细胞和耐药细胞进行接种，放置于96孔培养板内，每孔5*103个细胞，24小时后把稀释的药物分别加入LOVO细胞株和LOVO/TAX细胞株内，药物包括：紫杉醇、阿霉素、5-FU。48小时后根据说明书操作，观察吸光度值，计算药物的半数抑制浓度和耐药指数。重复操作3次。
1.2.4流式细胞仪监测细胞周期和凋亡率 试验前耐药细胞株需脱药培养2周，收集对数期生长的LOVO细胞和LOVO/TAX细胞，各1ml，使用乙醇固定过夜，加入PI染料，水浴处理，30分钟使用尼龙筛过滤。使用流式细胞仪检测和使用计算机软件分析细胞周期分布的变化。使用紫杉醇（1.5umol/L）干预，24小时后收集亲本细胞和耐药细胞，严格按照细胞凋亡双染试剂盒的说明书计算mRNA的相对表达量。试验操作重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析，对正态分布的数据进行t检验，对非正态分布的数据进行卡方检验，采用平均数±标准差的形式表示数据的分布趋势，P<0.05表示数据的比较差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 耐药细胞株建立效果见表
本研究建立紫杉醇耐药细胞株，在药物诱导的过程中，取其中含有0.7umol/L紫杉醇的RPMI1640中稳定增长的细胞株，命名为LOVO/TAX0.7，并且同样获得LOVO/TAX1.5耐药细胞株。MTT法获得LOVO/TAX0.7和LOVO/TAX1.5的耐药指数分别为31和42。经过反复传代和复苏测定LOVO/TAX耐药稳定。同时对5-FU和青霉素的耐药也存在强烈的交叉耐药。耐药指数为180和800。
2.2 细胞周期变化特点
和亲本细胞对比，耐药细胞株的细胞周期变化更为明显，表现为GO/G1期的细胞比例增加明显，P<0.05；S期细胞减少，但是无差异，P>0.05；G2/M期细胞比例明显减少，阻滞明显低于LOVO，P<0.05。
3.讨论与结论
通过浓度梯度递增法建立耐药细胞株对紫杉醇存在高度耐药，对作用不同的青霉素和5FU则存在明显的交叉耐药。经过反复传代、冻存和复苏，耐药细胞株稳定增长，并且耐药无明显变化，由此可见，LOVO/TAX耐药细胞株所建立的多药耐药细胞模型稳定，可作为人紫杉醇耐药机制探索的研究对象。和亲本细胞对比，耐药细胞株的细胞周期变化更为明显，表现为GO/G1期的细胞比例增加明显，P<0.05；S期细胞减少，但是无差异，P>0.05；G2/M期细胞比例明显减少，阻滞明显低于LOVO，P<0.05。由此可见，LOVO/TAX耐药细胞中的CDKI基因作为细胞周期G2/M期检控点的关键分子，其表达上调和G2/M期阻滞降低有关，并通过凋亡抵抗产生耐药[3-4]。
综上所述，紫杉醇耐药机制比较复杂，并且和多方面影响因素有关。这些因素相互影响，相互协同，其机制作用仍需要进一步研究。本研究成功建立人紫杉醇耐药细胞株LOVO/TAX，证实CDKI基因过表达是导致结肠癌细胞对紫杉醇耐药的重要原因，初步证明人紫杉醇耐药形成的机制，为紫杉醇耐药机制的逆转研究提供一定的参考依据。
【参考文献】
[1]陈一帆,张燕,王强,等.人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因mRNA表达的研究[J].宁夏医科大学学报,2017,(5):545-549,封2.
[2]张善锋,王志举,崔景彬,等.靶向阻断LRP提高肺腺癌细胞对紫杉醇的敏感性[J].基础医学与临床,2016,(3):370-374.
[3]刘群,李锐锐,眭蕊,等.紫杉醇耐药卵巢癌细胞系的建立及耐药机制研究[J].癌症进展,2014,(2):199-204.
[4]张正华,梁晓华,吴学勇,等.人乳腺癌细胞株MCF-7及其紫杉醇耐药株中紫杉醇结合的差异蛋白质分析[J].中国药理学通报,2010,(2):217-221.
论文作者:吕浩
论文发表刊物:《心理医生》2018年12期
论文发表时间:2018/5/22
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