（1南昌大学第一附属医院 330006，2华东交通大学理学院 330013，3江西奉新县人民医院 336000）
项目基金：江西省教育厅科技计划课题（GJJ13133）
[摘要] 目的 探讨BMP-2基因防治大鼠卵巢摘除骨质疏松的作用及其初步机制。方法 雌性SD大鼠均行手术彻底摘除卵巢，术后连续10d以阴道涂片检测动情周期，随机分为4组，BMP-2低、中、高剂量组分别皮下注射BMP-2（ 剂量依次为 2.5ug，5.0ug，7.5ug），1次给药，对照组不给药。连续观察20d，检测骨密度、骨抗压强度，以及血清碱性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（ACP）的变化。结果 与对照组相比，BMP-2能明显提高去卵巢大鼠骨密度（P ＜0.01）、股骨三点弯曲最大弯应力（ P ＜0.01）和Ｌ５ 腰椎压缩载荷（ P ＜0.01），提高血清ALP（P ＜0.01），降低血清ACP（ P ＜0.01）。结论 BMP-2基因治疗能促进成骨细胞增殖、抑制破骨细胞功能，明显改善大鼠卵巢摘除骨质疏松症。
关键词 骨形态形成蛋白-2， 基因治疗， 骨质疏松， 卵巢摘除
Experiment study of BMP-2 gene therapy on osteoporosis in ovariectomized rats
CHEN Ming1 ,LEI Yu2 ,LI Qing-liang3 ，LI Zhi-yun1 MIN Yan1
1. Department of Orthopaedics and Traumatology, the First Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang Jiangxi, 330006, P.R.China
2. Department of physics, College of Science, East China Jiao Tong University, Nanchang Jiangxi, 330013, P.R.China
3. Department of Orthopaedics and Traumatology, the people’s Hospital of Fengxin county, Fengxin Jiangxi, 336000, P.R.China
Corresponding author: CHEN Ming
E-mail: manchan8@126.com
Abstract： Objective To investigate the effect of BMP-2 on osteoporosis in ovariectomized rats and its preliminary mechanism．Methods All the female SD rats were ovariectomized．The vaginal smear was observed to detect the estrous cycle of rats during consecutive 10 days after the operation,in order to screen rats．The rats were divided into 4 groups：low concentration BMP-2 with ovariectomized group( LD）,middle concentration group （ MD），High concentration group（HD）and control group.The rats in LD group，MD group and HD group were treated with BMP-2 by subcutaneous injection with the dosage of 2.5ug，5.0ug，7.5ug respectively． The period of observetion lasted for 20 days．The changes of bone mineral density ( BMD），bone biomechanics characteristics，and the serum levels of ALP， ACP were observed．Results Compared with that in the Control group， BMP-2 could significantly improve BMD，the maximum bending stress，and the loading force of the ５th lumbar vertebra （P ＜0.01），increase serum ALP（P ＜0.01）， and lower the serum levels of ACP（P ＜0.01）．Conclusion BMP-2 can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts and inhibit the function of osteoclasts, so as to relieve symptoms of osteoporosis in ovariectomized rats significantly．
Key words： BMP-2； Gene therapy；Osteoporosis；Ovariectomy
骨质疏松症是一种以骨密度下降，骨组织微结构和超微结构破坏，导致骨脆性增加的全身性疾病。预防和治疗主要在于，增加骨组织量，提高骨矿质含量，减少脂肪成分生成，使骨骼承重能力增强，降低骨质疏松导致的骨折发生率。BMP-2在调控 MSCs 成骨分化中起关键作用[1,2]，但是否可以治疗骨质疏松症的体内研究相对较少。目前尚未见采用BMP-2基因防治骨质疏松症进行的相关实验研究。本研究通过摘除大鼠卵巢，制造骨质疏松模型，观察BMP-2基因治疗后大鼠骨量及骨生物力学的变化，为临床应用BMP-2基因治疗骨质疏松症提供依据。
1 材料和方法
1.1 动物：6月龄雌性Sprague-Dawley大鼠，体重250～300ｇ，由江西中医药大学实验动物中心提供（许可证号：SCXKC赣2009-0012）。实验期间动物恒温、恒湿，自由运动，饮食、水，皮下注射BMP-2[3], 连续观察30ｄ，采血前12ｈ禁食。
1.2药物与试剂：BMP-2, 血清碱性磷酸酶（ALP） 检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法，批号：E90191Ra，L110818076），血清抗酒石酸酸性磷酸酶（ACP）检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法，批号：E90902Ra，L110903047）均购于Uscn Life Science Inc．
1.3 仪器： ELX800uv酶标仪（ 美国Bio-TEK公司），双能Ｘ线吸收骨密度仪（DXA，美国Lunar DPXIQ）,微机控制电子万能试验机（WDW-200D，北京众晟华业科技有限公司）。
1.4 大鼠骨质疏松症模型的造模：以２％戊巴比妥钠40mg/kg对SD大鼠进行腹腔注射，麻醉成功后从脊柱近肋骨处切开肌肉和腹膜，剥离脂肪层，彻底切除两侧卵巢。术后第2ｄ起进行阴道涂片检查，连续观察10ｄ，判断卵巢切除是否彻底的依据--是否有动情周期，有动情周期则排除，不进入实验。
1.5 分组和给药：造模成功后，经严格筛选后的40只彻底切除卵巢的雌性大鼠，共分成4组，皮下注射BMP-2，按低、中、高剂量分别计为 2.5ug组，5.0ug组，7.5ug组，每组10只,不给药组为对照组。
1.6 血清 ALP 和 ACP 检测：给药后自然饲养，不限制运动，观察20d，然后采用脱颈法处死动物，处死前，以心脏取血，血清常温静置２ｈ，离心取血清。 参照ELISA试剂盒方法，分别检测ALP 和 ACP。
1.7 股骨骨密度检测：动物处死后，分离大鼠的右下肢，切开下肢皮肤，轻轻剥离肌肉（不伤及骨膜），再以生理盐水浸润的纱布包裹，置-20℃冰箱保存，实验前先室温放置6h,再采用双能Ｘ线吸收骨密度仪对股骨进行整体扫描，检测股骨整体骨量 （BMC）及单位面积骨密度（BMD）。
1.8 股骨三点弯曲试验和Ｌ５腰椎压缩试验：动物处死后，同样方法分离大鼠左下肢和Ｌ５ 腰椎，切开下肢皮肤，轻轻剥离肌肉（不伤及骨膜），以生理盐水浸润的纱布包裹，置于-20℃冰箱保存，实验前先室温放置6h再采用采用微机控制电子万能试验机进行骨生物力学检测，其中左股骨的三点弯曲试验，设置跨长度为12mm，最大量程为1000N，加载速度为1mm／min ，计算最大应力（Femur Stress，MPa）。Ｌ５ 腰椎的压载实验设置加载速度为1mm／min，计算最大载荷（The fifth lumbar compress，N）。
2 统计学处理
所有数据均采用（ x±s） 表示，采用SPSS13统计分析软件 t 检验进行分析比较，P＜0.05 为有统计学意义，P＜0.01为有极显著意义。
3 结果
3.1 BMP-2提高了骨质疏松大鼠的骨密度 骨量的多少反映骨质密度高低，本研究结果显示，SD大鼠去卵巢后骨密度无论是股骨总骨量还是单位面积的骨量均明显降低，表明切除大鼠卵巢作为骨质疏松症模型符合实验要求，而BMP-2高、中、低剂量均可显著改善骨质疏松大鼠骨量减少的情况，且呈现剂量依赖性（见表１）。
3.2 BMP-2提高了骨质疏松大鼠骨抗压载能力和弯曲应力 作为骨质疏松症的检测指标之一，骨生物力学是近些年来发展起来的，主要反映了压缩载荷、扭转、拉伸等力对骨质的影响。 我们研究结果显示，骨质疏松大鼠的股骨三点弯曲应力和Ｌ５ 腰椎压缩载荷明显下降。而BMP-2高、 中、低剂量均显著提高骨质疏松大鼠的股骨三点弯曲 应力和Ｌ５ 腰椎压缩载荷，且呈浓度依赖性（ 见表２）。
4 讨论
骨质疏松症由于病状轻，病程发展缓慢而常被忽视，直至发生骨折，骨折发生后将有80％致残。其生化特点为：骨骼的化学成分正常，单位体积中骨矿含量减少；形态学特点为：骨密度下降；组织学特点为：单位体积内骨组织量减少，骨皮质变薄，海绵骨的骨小梁数量和体积均减低，髓腔增宽，骨骼承受力的负荷能力下降，除临床上发生疼痛外，四肢和脊柱因承重而继发畸形甚至骨折[4]。Salgado AJ等[5]认为，新骨的形成要素包括：细胞、细胞外基质（ECM）、细胞与ECM相互整合、细胞间物质交换、生长因子等。BMPs是转化生长因子- ß超家族的成员，自从纯化于脱矿骨基质，至今已经发现的BMPs超过了20种。BMP-2在多能间充质干细胞分化为成骨细胞的过程中发挥着重要作用[6]。本研究采用雌性大鼠，以去卵巢模拟绝经，针对骨质疏松症采取BMP-2基因进行防治，为揭示BMP-2防治骨质疏松症的机制及扩大BMP-2的临床适应症提供依据。
衡量骨质疏松症的关键指标，是骨密度、骨生物力学的变化，因为后者直接反映骨量和骨质状态[7]。骨密度降低体现骨量减少，骨生物力学指标如骨弯曲应力和抗压载荷下降说明骨质脆弱。Mark M等[3]报道，在小鼠骨折模型中简单皮下注射2.5ug的rhBMP-2，在术后当天及第4天，影像学、生物力学、组织学检测均证明可以对愈合起明显的效果。 既往研究认为[8]，BMP-2可以在ECM中吸引各种细胞，促有丝分裂、促细胞分化，使BMSCs分化为成骨细胞，从而诱导新骨形成。本研究结果显示BMP-2发挥了这些作用，基因治疗随着剂量的增加，防治骨质疏松症的作用增强。骨质疏松症发生的机理是骨形成落后于骨溶解，在骨改建过程中无法完全修复破坏的骨质，使得骨量不断减少，由于广泛溶骨性破坏过程可引起血清ACP升高，因此ACP升高可以作为骨溶解吸收的标志。BMP-2可以诱导骨形成标志物的表达，如ALP, 骨钙蛋白等。郭三萍等[9]发现,骨质疏松造模组与正常对照组比较,血中ACP活性升高,符合大鼠骨质疏松的指标变化，骨小梁数量、宽度减少，骨小梁面积百分比明显减少、骨小梁间隙明显增宽, 形态学也出现了典型的骨吸收性骨质疏松改变。本研究发现BMP-2能促进 ALP 增加，明显降低 ACP 水平，说明BMP-2促进了骨质疏松大鼠的骨形成并抑制骨吸收，与上述报道一致。我们认为，BMP-2理想的剂量取决于多种因素，如组织靶、应用部位及不同载体等，必须根据不同组织类型和环境严格控制。但是，BMP基础上的骨再生在人类究竟需要多大剂量的BMP诱导足够的新骨形成仍未解决，此前的参考量一般为mg量。这是本实验今后临床研究的方向。
参考文献
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[2] 关云， 王琴梅，陈盈 等。负载 BMP-2 质粒的脂多糖胺纳米囊泡转染大鼠 BMSCs 的研究。中国修复重建外科杂志。2014,28（10）：1292-1297.
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[8] 陈明，舒勇，韩智敏等。重组人骨形态发生蛋白2缓释体影响细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达.中国组织工程研究与临床康复，2010,14 (21):3851-3855.
[9] 郭三萍,李晓红,戴晓霞等.镓盐对颌骨骨质疏松大鼠骨代谢的影响.第四军医大学学报 2004 ; 25 (24)：2248-2250.
个人简介：陈明、男、1972.11.副教授。南昌大学第一附属医院。汉族、博士。研究方向:骨科基础与创伤外科。
论文作者:陈明1,雷宇2 李庆樑3,李志云,闵燕
论文发表刊物:《西部医学》2017年5月
论文发表时间:2017/8/24
标签：大鼠论文; 卵巢论文; 骨质疏松论文; 股骨论文; 血清论文; 骨质疏松症论文; 基因治疗论文; 《西部医学》2017年5月论文;