1南华大学附属第二医院消化内科 湖南 衡阳 421001
2南华大学附属第二医院肝胆内科 湖南 衡阳 421001
第一作者简介：刘艳萍(1980-)，女，湖南邵阳人，主治医师，医学硕士，主要从事消化系肿瘤的防治研究
*通讯作者：李国庆，教授，医学博士，主任医师，硕士生导师
【摘要】：目的 在胃癌组织中筛查参与调控EGFR和miR-7的lncRNA；探索lncRNA、miR-7和EGFR的调控网络作用机制；明确该信号网络在胃癌细胞侵袭转移中的调控作用。方法 收集南华大学附属医院3年内经病理证实的胃癌标本200例，检测miR-7和EGFR表达水平改变；观察miR-7和EGFR表达水平与肿瘤分期、分化与侵袭转移的关系，两者之间表达的相关性；筛查参与调控miR-7和EGFR表达的lncRNA。结果 观察组与对照组的EGFR蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义（P>0．05）。相比较对照组而言，观察组的miR-7表达阳性率缺失率均较高，组间比较差异具有统计学意义（P<0．05）。结果显示，miR-7与EGFR在胃癌组织中的表达具有相关性，相关系数为0．587。结论 lncRN A 在恶性肿瘤组织中异常表达的特性，使其成为很好的肿瘤生物标志物，可在肿瘤早期诊断中发挥重要作用。
【关键词】：lncRNA；胃癌转移；miR-7/EGFR信号；机制研究
【中图分类号】R605.975【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0413-02
全球每年新发胃癌934000例，5年生存率不足20%，研究表明胃癌的发生发展、侵袭转移与细胞内信号网络通路异常有关[1]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录长度超过200nt不含起始和终止密码子的RNA，因具有较长的一级结构，可作为平台，与其他DNA、RNA相互整合，自身又能形成复杂多样的二级空间结构与蛋白因子相互作用而发挥生物学功能[2]。本项目拟采用高通量测序技术在胃癌组织和癌旁组织筛查参与调控miR-7/EGFR的lncRNA；并继续扩大临床病例，检测胃癌发生发展过程中EGFR、miR-7和候选lncRNA的表达并分析相互关系；构建上调和抑制候选lncRNA表达的体外细胞模型，揭示候选lncRNA介导胃癌细胞侵袭转移的作用机理。
1材料与方法
1.1临床资料
收集南华大学附属医院2011年6月至2014年6月经病理证实的胃癌标本200例及配对癌旁正常组织。患者术前均未行放、化疗，年龄38--79岁，中位年龄63岁；组织病理类型的判断参照WHO胃癌的病理学分类标准，TNM分期参照UICC／AJCC2002年标准。每例标本留取肿瘤组织及对应的距肿瘤5cm以上的癌旁正常胃黏膜组织(经组织病理切片检测证实)，离体后l0min内置于液氮中保存待做后续分析。
1.2试剂
Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；DNaseI、RNase—free试剂购自美国Thermo公司；ReverTraAce⑧qPCRRTKit、SYBR~GreenRealtimePCRMasterMix等购自日本Toyobo公司；CCK一8(CellCountingKit一8)细胞增殖／毒性检测试剂盒购自日本同仁研究所；人胃癌AGS细胞购自中科院上海细胞库； ArraystarHumanLncRNAMieroarrayV3．0芯片购自上海康成生物技术有限公司；LncRNAsiRNA和NegativeControl由上海吉玛公司合成；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.3实验方法
1.3.1总RNA的提取
取液氮保存的胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织标本，在液氮中碾碎至粉状，按Trizol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。为去除可能污染的DNA，抽提的RNA溶液按DNaseI说明书步骤进一步纯化。采用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo公司)检测RNA溶液OD260／OD280，计算RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。
1.3.2免疫组织法
运用10％中性福尔马林对标本进行固定，石蜡常规包埋，制作成4μm切片，常规HE染色，将细胞状态较好的切片作为研究对象。运用SP法对所有标本进行免疫组织化学检测，在同一条件下，严格按照SP免疫组织法对标本进行染色，DAB显色，并将已知的miR-7、EGFR蛋白染色阳性组织切片作为阳性对照组，而PBS取代一抗则为阴性对照。
判断标准：随机选取每张切片的5个高倍镜下视野，对细胞染色强度进行仔细观察并记录结果：0分为细胞不着色；1分为浅黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。阳性细胞所占百分比与染色强度的乘积结果为最终得分：阳性为得分>3分；阴性为得分≤3分[3]。
1.3.3Real-time PCR检测
按照TOYOBO逆转录说明书将mRNA反转录成cDNA后，在ABI7300扩增仪上进行Real-timePCR验证。反应条件为95℃酶激活3min，稳定；95℃变性2S，60℃延伸30S，进行40个循环。
1.3.4蛋白质印迹法
EGFR的蛋白表达水平通过蛋白质印记法进行检测。用BCA法对蛋白进行定量，10%SDS—PAGE电泳，湿转至PVDF膜上，5牛奶封闭，一抗1：1000孵育过夜，二抗孵育1h，ECL发光液进行显影。经Quantityone软件进行图片分析，计算净光密度值。以Bio—ImageAnalysisSystem进行半定量分析，结果以相对光密度值(relativeopticaldensity，ROD)×面积(S，mm)表示。
1．4统计学方法
采用SPSS17．0统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率(％)表示，采用检验。P<0．05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1胃癌与癌旁组织的 miR-7和EGFR表达对比
观察组与对照组的EGFR蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义（P>0．05）。相比较对照组而言，观察组的miR-7表达阳性率缺失率均较高，组间比较差异具有统计学意义（P<0．05）。见表1。
2.3miR-7对mRNA和蛋白表达的抑制
与空白对照和阴性对照相比，EGFR的mRNA表达水平下调了81.2%（P<0.05）和79.1%（P<0.05），其蛋白表达水平则分别下调了71.0%（P<0.05）和70.0%（P<0.05）。由此表明，miR-7靶向EGFR可负调控EGFR的表达。
3结论
miRNA是一类广泛存在于多种生物体内的长度约22个核苷酸的非编码RNA[4]，miRNA可通过与目标信使RNA(mRNA)完全或不完全配对结合，降解目标mRNA或阻遏其转录后翻译，达到基因沉默的效果，从而发挥其独特的基因表达负调控能力[5]。有学者认为特定mRNA的异常表达与胃癌的发生、分化和侵袭转移密切相关，差异表达的miRNA不仅可反映胃癌组织的来源，还可判断胃癌的组织分型、药物耐药性及临床预后等[4-6]。miR-7是新近报道与肿瘤相关的包含22个核苷酸的miRNA，其基因位于人类第9号染色体异源核糖核蛋白K基因的内含子区域[7]。由于miR-7的核苷酸序列较短，可以完全或不完全结合调控多个信使RNA表达，既往研究证明miR-7通过抑制Pak1、Bcl-2、IGFR等基因的表达参与了人类乳腺癌、施旺细胞瘤、肺癌、胶质瘤、非小细胞肺癌及舌鳞癌等多种肿瘤的发生发展[7-8]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种表达于正常上皮细胞表面的跨膜糖蛋白，是原癌基因cerb-B1的表达产物，在肿瘤细胞中多为过表达，该信号分子广泛参与肿瘤细胞的生长、分化和侵袭转移等[9]。
近年来，miRNA调控网络得到进一步完善，有研究提出一种竞争性内源性RNA模式（competing endogenous RNAS，ceRNA）,而lncRNA是ceRNA的重要成员[10-11]。在ceRNA模式中lncRNA、假基因转录物以及mRNA转录物可以竞争性地结合miRNA的应答元件（miRNA response element，MRE），阻断后者对靶RNA的抑制作用，从而调控miRNA靶标的表达水平，同时也实现了lncRNA、miRNA与目标mRNA之间的对话和交流[12]。首先，lncRNA以自身序列与靶序列互补配对为基础，与miRNA竞争性地结合靶基因的3’UTR，在转录后水平抑制miRNA对靶基因的负性调控作用[13-14]；lncRNA还可以作为一种“海绵”结合miRNA解除其对下游靶基因的负性调控作用[12-13]。异常表达的lncRNA可通过影响相关miRNA表达在肿瘤发生发展过程中起抑癌或促癌的作用[15-16]。miRNA表达水平在发育、细胞分化或肿瘤形成的过渡点时期发生很大的变化，在这些过渡点阶段，可以通过lncRNA的方式清除mRNA-miRNA复合物[17]。已有文献报道长片段非编码RNA（upregulates long non-coding RNA，HULC）是具有miR-372 MRE的lncRNA；在肝癌细胞特殊的内环境下HULC表达显著上调并促使miR-372耗竭，而miR-372可调控致癌基因RAS表达，是初始细胞癌变和肿瘤化的关键因子[18]。最近研究发现多种lncRNA在胃癌组织中表达显著上调，其中的lncRNA BC032469可通过封闭miR-1207-5p部分解除对人端粒酶逆转录酶的负性调控，促进胃癌细胞增殖和迁移[19-20]。目前，完善lncRNA参与mRNA-miRNA调控机制是相关研究的前沿和热点。
综上所述，lncRN A 在恶性肿瘤组织中异常表达的特性，使其成为很好的肿瘤生物标志物，可在肿瘤早期诊断中发挥重要作用。
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论文作者:刘艳萍1,李国庆*, 屈小勇2, 唐芬芬1
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/27
标签：胃癌论文; 细胞论文; 组织论文; 肿瘤论文; 基因论文; 蛋白论文; 统计学论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;