滕州市中医医院 山东枣庄 277500
摘要：目的：通过观察恩替卡韦治疗前后慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞亚群和IFN-γ、IL-21的变化情况，希望能够了解抗病毒治疗对机体的免疫作用的影响和意义，以及抗病毒治疗引起HBeAg血清转换的可能机制。方法：50例患者从基线时间点开始服用恩替卡韦（ETV）0.5 mg/d，共48周，分别在基线点、治疗的第4，12，24，36，48周检测CHB患者乙型肝炎病毒血清标志物（HBV-M）、乙型肝炎病毒核苷酸定量（HBV DNA）、丙氨酸转移酶（ALT）、T淋巴细胞亚群、血清IFN-γ、IL-21浓度。ALT采用全自动生化仪检测，HBV-M采用酶联免疫吸附法检测，HBV DNA采用荧光定量PCR法检测。流式细胞仪检测T细胞亚群，双抗体夹心ELISA法检测血清IFN-γ、IL-21浓度。结果：CHB患者应用ETV治疗后ALT水平及HBV DNA在第四周出现下降，至第48周时患者ALT水平降至正常范围以内，HBV DNA下降至最低检测值（5×102 copies/ml）以下。ALT水平及HBV DNA定量在治疗48周与治疗前基线值相比差异显著，有统计学意义（t=8.43，t=5.64，P<0.01）。患者CD3+T、CD4+T细胞、CD4+/CD8+在第4周开始出现升高，至48周时与治疗前相比，差异有统计学意义（t=4.89，t=6.42，t=5.69，P<0.01）。CD8+T细胞在第4周时出现下降，至治疗48周时与治疗前相比，差异有统计学意义（t=6.42，P<0.01）。血清IFN-γ浓度在治疗第4周时出现上升，与基线比差异有统计学意义（t=7.54，P<0.01）。其后随着抗病毒治疗时间的延长逐渐降低，至48周与治疗前相比下降有统计学意义（t=9.48，P<0.01）。血清IL-21浓度在治疗第4周开始出现下降，至48周时与治疗前基线值相比下降有统计学意义（t=8.51，P<0.01）。结论：恩替卡韦抗病毒治疗能恢复CHB患者肝功能、抑制HBV复制。恩替卡韦治疗可以改善CHB患者的免疫功能；T细胞反应增强及血清IL-21高表达可促使HBeAg/HBeAb血清转换。
关键词：肝炎；乙型；慢性；恩替卡韦；肝炎e抗原；免疫细胞
全球约有3.5亿人为乙型肝炎病毒（hepatitis B，HBV）慢性感染[1]，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭和原发性肝细胞癌。目前认为核苷类药物能够有效地控制乙型肝炎的进展，其中具有代表性的药物恩替卡韦（Entecavir，ETV）是一种强有力的抗病毒药物，具有高效性及良好的耐药性，适应于各种情况的乙型肝炎患者[2，3]。美国、欧洲及亚太肝病学会将其列为一线抗病毒药物。有人提出恩替卡韦可能具有免疫调节作用[4]，我们应用ETV治疗50例HBeAg阳性CHB患者，观察其在治疗48周时的病毒学、血清学应答反应，及治疗前后T淋巴细胞亚群和血清IFN-γ、IL-21的变化情况，希望能够了解抗病毒治疗对机体的免疫作用的影响及相关机制。
对象与方法
1.1 研究对象：收集2011年2月-2012年8月在我院感染科住院治疗的50例HBeAg阳性CHB患者，男，34例，女，12例，年龄18-65岁，平均（31.56±5.23）。其中慢性轻度12例，中度18例，重度9例，肝硬化11例，诊断符合2010年制定的慢性乙型肝炎诊断标准。全部患者至少6个月内未进行抗病毒治疗，排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人体免疫缺陷病毒等病毒重叠感染以及已知遗传或代谢性肝病、胆汁淤积性肝病、肥胖或自身免疫性肝炎等患者。另外收集10名健康体检者（HC）作为对照组。
1.2 药物治疗及临床指标检验：50例患者从基线时间点开始服用 ETV0.5mg（中美上海施贵宝药业），每日1次，持续24周，对照组不服用药物，CHB患者在基线点、治疗的第4，12，24周当天检测乙型肝炎病毒表面标志物（HBV-M）、乙型肝炎病毒核苷酸定量（HBV-DNA）、丙氨酸转移酶（ALT）。ALT、HBV-M均采用酶联免疫吸附法检测，HBV-DNA采用RT-PCR法检测。
1.3 流式细胞仪检测T细胞亚群：所有受试者均清晨抽取空腹外周血2 mL，肝素抗凝（1 h 内进行检测）。按T细胞亚群免疫荧光检测试剂盒说明进行操作（购于美国BD公司），测定CD4+、CD8+，结果采用FloMax专用软件进行分析。
1.4 血清IFN-γ、IL-21检测：于清晨空腹抽取患者外周静脉血3mL，室温放置2h后分离血清，置PC管中，于-20冰箱保存，同批检测。采用双抗体夹心ELISA法，检测仪器为Thermo Corporation电脑酶标分析仪，试剂盒由Bender公司提供，严格按照试剂盒说明书的程序进行操作。
1.5 统计方法：应用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析，所有数据采用均数±标准差表示，组内总体均数比较采用方差齐性的单因素方差分析，组内治疗前后两时段均数比较采用配对样本t检验，两组之间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、ETV治疗后患者临床指标的变化
应用ETV治疗后，所有患者血清中的HBV DNA在第4周明显下降，在第12周时已接近检测低限值，至36周时已达到检测低限值（<100 IU／mL）；相应的AILT在第4周开始出现明显下降，在第12周时已接近正常值的高限（40 U／L），至第36周已经和正常值无明显差异（见表1）。
二、ETV治疗中患者外周血T淋巴细胞亚群的变化
患者CD4+T细胞、CD4+/ D8+在第4周开始出现升高，与基线比P<0.05，第12周开始明显上升，P<0.01；CD8+T细胞在治疗后第4周开始出现升高，第12周后出现下降（见表2）。在血清学转换方面，所有患者在治疗前均为HBeAg阳性，在第48周9例患者出现抗-HBe转换。我们根据治疗效果，分为HBe转换组与HBe未转换组。两组治疗前T淋巴细胞亚群比较无统计学意义，两组抗病毒治疗第48周时，CD3+、CD4+T细胞、CD4+/ D8+均较治疗前升高，但HBe转换组升高显著，且在治疗12周时CD4+T细胞（t=2.06，p=0.04）、及CD4+／CD8+均较HBe未转换组明显升高，差异有统计学意义。CD8+T细胞较治疗前降低，两组差异无统计学意义。（见表3）。
三、ETV治疗中患者血清IFN-γ、IL-21的变化
血清IFN-γ浓度在治疗第4周时出现上升，与基线比差异有统计学意义（t=7.54，P<0.01）。其后随着抗病毒治疗时间的延长逐渐降低，至48周与治疗前相比下降有统计学意义（t=9.48，P<0.01）。血清IL-21浓度在治疗第4周开始出现下降，至48周时与治疗前基线值相比下降有统计学意义（t=8.51，P<0.01）。
血清IL-21浓度在治疗第4周出现下降，其后随着抗病毒治疗时间的延长逐渐降低，至48周仍高于正常组（见表2）。血清IL-21浓度在治疗第12周HBe转换组明显高于HBe未转换组（t=2.04，p=0.04），不显著高于其他时间点（见表3）。
讨论
乙型肝炎是一种免疫相关性疾病，HBV病毒本身并不直接对肝细胞造成损伤，而是通过诱发机体的免疫反应间接损伤肝细胞[5]。国内外研究显示，宿主的免疫因素尤其是细胞免疫反应介导了HBV的清除，特别是HBV特异性CD4+T细胞反应和CD8+T细胞反应对HBV的清除和疾病的转归有重要的影响[6]。有研究认为，过高的HBV DNA载量可能会抑制患者机体的免疫应答，引起免疫耐受，而一旦这种平衡被打破，往往会引起机体强烈的免疫应答。
ETV是一种强效选择性鸟嘌呤核苷类似物，有显著的抗乙型肝炎病毒（HBV）的活性[7]，具有高效性及良好的耐受性的特点[8]。本研究中的50例患者，在研究的48周均达到了血清病毒学的转换，9例实现了HBeAg血清转换，所有患者的ALT均达到了正常，实现了应用ETV的预期结果。也意味着所有患者的免疫状态与治疗前相比发生了显著的变化。在本研究中我们发现应用ETV治疗12周时CD4+T细胞与治疗前比较有明显升高（P<0.05），说明了CHB患者应用恩替卡韦治疗后Thl细胞亚群占优势，促进了细胞免疫反应，增强了CD4+T细胞的活性，从而利于病毒的抑制和清除。在治疗12周时HBe转换组CD4+ T细胞的比值明显高于HBe未转换组亦说明此点。说明了抗病毒治疗后病毒受到抑制的同时机体的细胞免疫功能发生变化，机体细胞免疫应答的增强。
Guidotti等[9]用转基因鼠实验发现，除机体的免疫机制外，还有细胞因子机制。慢性肝病与细胞因子的改变有明显的相关性，不同细胞因子的变化可影响T 淋巴细胞亚群的改变，导致机体免疫功能紊乱，使HBV感染慢性化。本研究发现血清IFN-γ水平在ETV抗病毒治疗初始（4周）出现升高，其后逐渐下降，表明IFN-γ水平的高表达有利于HBV病毒的清除，因此应用ETV治疗初始，HBV DNA快速下降伴有血清IFN-γ水平升高，之后随着治疗时间的延长，患者ALT、HBV DNA的下降，血清IFN-γ亦下降，IFN-γ的下降可降低体内的炎症反应，减轻肝脏的纤维化反应，延缓疾病的进程。IL-21水平在ETV抗病毒治疗过程中总体呈现下降趋势，但IL-21水平与ALT水平之间没有显著的相关性。我们注意到，在48周时，虽然HBV感染患者血清中的IFN-γ及IL-21均较基线点出现明显下降，但仍高于正常对照，这意味着HBV感染患者体内的免疫状态仍异于正常人，体内仍可能存在炎症反应。可能需要配合其他保护肝功能的药物治疗，进一步减轻炎症。
目前的抗病毒药物能够有效地抑制CHB患者乙肝病毒复制到很低水平，尽管肝脏炎症得到控制，但并不总是能诱导e抗原发生血清学转换。当停用抗病毒药物后，会再激活HBV病毒发生高水平的复制，并且肝脏炎症复发。因此HBeAg血清转换是慢性HBV感染演变中的一个重要事件，但病毒的遗传基因和宿主驱动HBeAg血清转换的免疫机制不是很清楚。本研究中50例CHB患者血清IL-21浓度与治疗前相比是随着抗病毒治疗时间的延长而逐渐下降，HBe转换组在治疗12周时血清IL-21浓度显著高于HBe未转换组（t=2.04，p=0.04），这与Ma等[10]报道的结果相一致。这种在第12周时出现的机体免疫环境的变化，可能对抗病毒治疗的效果产生重要的影响，也可能是将来免疫治疗的适当时机。这也说明了抗病毒治疗后病毒受到抑制的同时机体的细胞免疫功能发生变化，机体细胞免疫应答的增强，血清高IL-21浓度水平可能有助于HBeAg发生血清学转换。Publicover J等研究发现IL-21在人类乙型肝炎的小鼠模型中有清除HBV抗原的作用[11]。慢性HBV感染者能否通过补充外源性IL-21恢复机体特异性CTL反应，需要进一步的研究。
恩替卡韦是一种抑制病毒复制的药物，并不能清除病毒，当停止用药或出现耐药时随着病毒载量的升高，体内的免疫环境会再次发生变化，重新引起肝脏炎症发生。因此需要结合其他免疫疗法进一步改善体内的免疫环境，清除病毒避免肝脏细胞的损伤。IL-21目前有应用于肿瘤的治疗，能否应用于慢乙肝患者的治疗，需大量的临床验证。
参考文献：
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论文作者:闫梅,田敏,郭春景,冯梅,赵忠菊
论文发表刊物:《健康世界》2016年1期供稿
论文发表时间:2016/3/25
标签：血清论文; 免疫论文; 患者论文; 抗病毒论文; 细胞论文; 乙型肝炎论文; 病毒论文; 《健康世界》2016年1期供稿论文;