李燕舞[1]2004年在《D28k钙结合蛋白基因真核表达质粒的构建及其表达效果的研究》文中指出D28k钙结合蛋白(CaBP-D28k)是受活性维生素D调节的细胞内蛋白质，它与CaBP-D9k统称为维生素D依赖性钙结合蛋白(CaBP-Ds)，与钙有高亲合力，在小肠和肾脏钙的细胞内转运过程中起着非常重要的作用。对CaBP-D28k进行深入、细致的研究是营养与生理等学科的重要课题，有着极高的学术价值与实用前景。本研究拟利用分子生物学技术构建鸡CaBP-D28k的真核表达质粒，在鸡体内进行表达并以此来对禽体内钙的营养调控机制进行研究，并进一步寻找利用基因注射来解决生产中由于钙的营养不足而引起的各种缺乏病的可行性。本研究是对CaBP-D28k作用的初步探讨，旨在为CaBP-D28k的进一步研究、开发奠定基础，通过RT-PCR的方法从蛋鸡小肠组织RNA扩增出789bp完整的鸡CaBP-D28kcDNA。通过TA克隆，我们将所扩增的cDNA克隆入载体pGEM-T内，经酶切和PCR初步鉴定后，再测定分析其序列的正确性。 为了验证克隆的鸡CaBP-D28k cDNA的编码情况，本研究通过将鸡CaBP-D28k cDNA亚克隆入真核表达载体pCEP4内，构建了真核表达构件pCEP4-CaBP-D28k，用所获得的真核表达构件pCEP4-CaBP-D28k转染COS-1细胞，进行暂态表达，用免疫荧光法检测到表达产物。用真核表达构件pCEP4-CaBP-D28k注射老年蛋鸡，经血液中降钙素、甲状旁腺素、雌二醇和血钙血磷的测定分析，检验重组真核表达质粒在蛋鸡体内的表达情况。 本研究得到的结果显示： 1．鸡CaBP-D28k cDNA的全序列分析表明，RT-PCR方法克隆得到的CaBP-D28k cDNA与国外已发表的序列相比仅有1个碱基的差别，中间没有缺失和插入现象，证明所得到的是鸡的D28k钙结合蛋白。DNA。 2.对构建的真核表达构件pCEP4一CaBP-D28k进行酶切和PCR鉴定，证明得到了重组的鸡D28k钙结合蛋白基因真核表达质粒。 3.免疫荧光法检测真核表达质粒转染COS一l细胞后的表达情况，图形清晰可见，证明重组真核表达质粒能够正常表达，且表达产量较高。 4.蛋鸡体内表达实验结果表明，在整个实验过程中，注射重组表达质粒的实验组动物其血钙水平明显上升，血液中降钙素显着上升;血磷水平稍有降低，血液中申状旁腺素、雌二醇明显下降，且变化幅度明显大于对照组动物。
孙杰, 赵宗胜, 姚秀娟, 杨鑫, 任士朋[2]2010年在《钙结合蛋白d28k基因在鸡子宫中表达变化的研究》文中研究表明[目的]研究鸡子宫中钙结合蛋白d28k基因的变化规律。[方法]采集不同产蛋阶段蛋鸡的子宫组织,利用RT-PCR方法检测钙结合蛋白d28k mRNA在子宫的表达情况。[结果]蛋进入子宫前2、1 h检测到钙结合蛋白d28k的表达,随着蛋壳的形成和钙化程度的加速,蛋进入子宫后5、15 h钙结合蛋白d28k的表达量逐渐增加,在蛋进入子宫后15 h达到最高水平,在产蛋后1、2 h没有检测到该基因的表达。[结论]钙结合蛋白d28k是影响蛋壳钙化的重要基因。
朱孝荣[3]2009年在《脑组织特异表达钙结合蛋白-D28k转基因小鼠的制备与鉴定》文中认为钙结合蛋白-D28K(Calbindin D-28k, CaBP-D28k)是钙结合蛋白家族重要成员,广泛分布于神经系统,能通过与钙离子、胱天蛋白酶-3、细胞膜叁磷酸腺苷二脂酶和P38等结合调控其活性。在帕金森病(Parkinson's disease, PD)患者脑黑质致密区存在少量抗变性能力很强的DA能神经元细胞,其共同特征是胞浆内都含CaBP。在遇到缺血和神经兴奋性毒性时,CaBP阳性神经元细胞能够存活,提示CaBP对神经细胞具有保护作用。细胞凋亡是包括PD在内的许多神经系统疾病中神经元细胞退行性病变的重要方式,而胞内钙离子超载是神经元细胞发生凋亡的诱因之一。作为一种钙离子快速缓冲蛋白,CaBP通过与钙离子结合对各种生物化学信号发生反应,限制细胞内游离钙离子浓度的过度升高,作为酶激活剂激活Ca2+-ATP酶调节钙离子的浓度,通过调节离子通道来促进钙离子的扩散,在神经元细胞出现长时间高强度神经活动时保护细胞免受钙超载的损害。增加DA神经细胞内CaBP量可防止其产生退行性病变,达到治疗PD的目的。对于如何增加DA神经细胞内CaBP的量,目前主要局限于体外细胞水平和以病毒为载体的体内短暂表达,而CaBP-D28k在DA神经细胞内表达的转基因动物模型未见报道,对DA神经细胞保护机制还需进一步研究。本研究用脑组织特异酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)基因启动子构建CaBP-D28k表达载体,用二甲基亚砜(DMSO)处理精子制备转基因小鼠,建立用于PD研究的转基因动物模型。首先,根据发表的小鼠TH启动子序列设计引物,用重迭PCR扩增小鼠TH启动子,测序正确后构建重组表达质粒pTH-EGFP,用脂质体分别转染TH+MN-9D细胞和TH-ECV细胞,根据EGFP报告基因的表达与否来验证TH启动子的调控能力。在此基础上,用PCR克隆5个不同的TH启动子基因片段,用相同策略获得能驱动外源基因在脑组织中特异表达的TH启动子核心序列。然后,用RT-PCR从小鼠脑组织中扩增CaBP-D28k cDNA,将其克隆入含TH启动子的表达载体,获得的重组载体pTH-CB经脂质体包裹后转染MN-9D细胞,用RT-PCR、免疫沉淀法检测CaBP-D28k的表达,用6-羟多巴胺复制细胞凋亡模型,用细胞原位免疫印迹法检测转染细胞中抗凋亡因子bcl-2的表达,用Hoechst染色、胱天蛋白酶-3活性检及钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin V/PI检测法,评价CaBP的抗细胞凋亡作用。进而将DMSO处理的精子与pTH-CB孵育,将体外受精获得的胚胎移植小鼠,用Western blot等试验检测PCR检测转基因阳性鼠黑质部CaBP-D28k表达,用MPTP复制PD模型,通过自主活动、游泳实验、悬挂实验等研究转基因鼠的行为学以及黑质致密部TH阳性细胞数的改变,来验证CaBP的抗MPTP对神经细胞的损伤作用。结果表明,克隆的TH启动子为3650bp,其序列与发表的TH启动子序列完全一致,能驱动EGFP报告基因在MN-9D细胞中表达。用PCR扩增的450bp、1500bp、2000bp、2400bp、3650bp TH启动子序列构建报告载体,其转染的MN-9D细胞培养中EGFP阳性细胞的比例无统计学显着性差异(分别为8.01%、7.97%、7.85%、7.72%、7.74%),但在其转染的THECV细胞培养中,EGFP阳性细胞比例分别为6.51%、6.35%、6.71%、0.89%、1.02%,3650bp和2400bp启动子在TH-细胞中的表达调控能力受到明显抑制,初步证明TH启动子中组织特异性调控元件主要位于2400bp～2000bp区域。用RT-PCR从小鼠脑组织中扩增的785bp CaBP-D28k cDNA与已报道的序列完全一致,用TH启动子调控的CaBP-D28k表达载体转染MN-9D细胞,其CaBP-D28k mRNA及蛋白表达量显着高于对照组,表达的CaBP能显着促进细胞内bcl-2表达,能抑制Caspase—3活性,并能显着降低细胞的凋亡数。用DMSO处理的精子共获得96只后代小鼠,其中4只为PCR检测阳性,2只能稳定传代目的基因,其脑黑质部、腹侧被盖区的CaBP-D28k表达量显着高于正常小鼠,而其海马、大脑皮层的CaBP-D28k表达量与正常鼠无明显差异,初步说明TH启动子能驱动外源CaBP-D28k基因在DA神经细胞中表达,获得了脑组织特异表达CaBP-D28k的转基因小鼠品系。MPTP造模试验结果表明,转基因鼠黑质致密部TH阳性细胞数和行为学变化差异不显着,而正常鼠黑质致密部TH阳性细胞数和行为学变化差异显着,表明脑内DA神经细胞中CaBP-D28k的过量表达具有抗MPTP损伤能力。
参考文献：
[1]. D28k钙结合蛋白基因真核表达质粒的构建及其表达效果的研究[D]. 李燕舞. 扬州大学. 2004
[2]. 钙结合蛋白d28k基因在鸡子宫中表达变化的研究[J]. 孙杰, 赵宗胜, 姚秀娟, 杨鑫, 任士朋. 安徽农业科学. 2010
[3]. 脑组织特异表达钙结合蛋白-D28k转基因小鼠的制备与鉴定[D]. 朱孝荣. 扬州大学. 2009