“DNA的粗提取与鉴定”实验优化和研究，本文主要内容关键词为：鉴定论文,DNA论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
“DNA的粗提取与鉴定”是高中生物学中分子生物学的实验，安排在人教版《选修1·生物技术实践》的“DNA和蛋白质技术”的专题5中。根据教材的介绍，该实验的材料可以选择动物材料（如鸡血），也可以选择植物材料（如菜花、洋葱等）。实践表明：鸡血取材不方便、成本高、实验操作步骤多、耗时长，且成功率低；菜花含水量少、细胞破裂情况及DNA溶出量少[1]；洋葱有刺激性气味，学生操作时眼睛难以睁开，且在实验中不易研磨[2]。因此，选择一种合适的实验材料显得十分重要。另外，高中实验受条件限制（如无EDTA、Tris和离心设备，氯仿-异戊醇具有毒性等），如何在普通高中实验室条件下做好这个实验，一直是不少中学教师研究的重点。 笔者查阅大量资料，并利用校本课程时间分别采用香蕉和人体口腔上皮细胞进行“DNA的粗提取与鉴定”实验并进行优化，收到了良好教学效果，可以让更多的学生从简单材料中提取DNA，增加了学生的感性认识，提高了学生的动手能力。 一、香蕉DNA的粗提取与鉴定 1.制取香蕉研磨液 ①取一段约2cm长的去皮香蕉，剪碎置于研钵中。 ②加入10mL温水、2g食盐，研磨5min～10min。 ③用单层纱布过滤研磨液，并收集于小烧杯中。 2.粗提取DNA ①向装有香蕉研磨液的烧杯中加入2mL洗手液，按一定方向轻摇5min。 ②沿玻璃棒从杯壁缓慢加入两倍体积的95%的冰酒精。 ③静置5min后，有白色絮状物漂浮于上层（见图1）。 ①取两支试管，分别编为1号和2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液3mL。 ②用木筷子缓缓卷起所得上层漂浮白色絮状物（见图2）放入2号试管，搅拌使其充分溶解。 ③分别向两支试管中加入4mL二苯胺试剂。 ④混合均匀后在沸水浴中加热5min～10min，并冷却一段时间，观察颜色的变化。
4.结果及说明 为了减少DNA的损失，粗提取DNA时采用了木筷子倾斜引流和挑出沉淀物。在加入2倍体积95%冰酒精时，立即产生大量白色絮状沉淀，效果相当明显。且这些白色絮状沉淀，能溶解于2mol/L的氯化钠溶液，说明其中含有DNA。但鉴定DNA时，试管中出现的颜色并非蓝色而是浅蓝色，说明含DNA量较少、纯度较低，可能还含有蛋白质等杂质。学生提议用双缩脲去鉴定白色絮状物，果然呈紫色。如何提取到更多的DNA，并去除滤液中的杂质，获取较为纯净的DNA呢？学生提出问题，并根据教材尝试优化结果方案。 二、香蕉DNA的粗提取与鉴定优化方案 优化方案中首先将洗手液加入的时间改为研磨中。由于洗手液中含有SDS（十二烷基磺酸钠），能够裂解细胞膜，使蛋白质变性，利于蛋白质和DNA的分离。如果在研磨时加入适量的洗手液，既促进DNA释放，又有助于DNA提取。另外根据DNA和蛋白质在高温和酶处理时耐受力的差别，尝试在粗提取液中加入含蛋白酶的嫩肉粉，并在55℃～60℃（嫩肉粉中木瓜蛋白酶最适温度）处理10min～15min，不仅使蛋白质被分解，且高温能使部分蛋白质变性，达到纯化DNA提取物的效果。 1.制取香蕉研磨液 ①取一段约2cm长的去皮香蕉，剪碎置于研钵中。 ②加入10mL温水、2g食盐和2mL洗手液，研磨5min～10min。 ③用单层纱布过滤研磨液，滤液于小烧杯中。 2.粗提取DNA ①向滤液中加入2g嫩肉粉，轻摇小烧杯，让嫩肉粉和滤液充分接触。 ②把小烧杯置于60℃的水浴锅中加热10min。 ③待小烧杯冷却后，沿木筷子从烧杯壁缓慢加入2倍体积的95%的酒精。这步是关键，需小心缓慢加入酒精。 ④静置5min后，用木筷子缓缓卷起上层漂浮的白色纤维状黏稠物（见图3）。 3.鉴定（同上） 结果表明，空白对照组不变色，加入嫩肉粉组实验结果呈蓝色，比不加嫩肉粉组颜色稍深，见图4（从左依次为：1对照组、2不加嫩肉粉组、3加嫩肉粉组）。
三、人体口腔上皮细胞DNA的粗提取与鉴定 ①获取口腔上皮细胞：在获取之前先用清水漱口减少杂质。然后取10mL盐水并用其漱口，使盐水尽可能与口腔内壁上皮细胞接触，收集漱口水于小烧杯中。 ②释放DNA：在小烧杯的漱口水中加2mL洗手液，充分振荡。 ③析出DNA：沿烧杯内壁，缓缓加入2倍体积的95%的酒精，静置5min后，观察到白色丝状析出物（见图5）。用牙签轻轻搅动，将丝状沉淀缠绕在牙签上（见图6）。将牙签剪断溶解在3mL 2mol/L的氯化钠溶液中以备鉴定。
④鉴定DNA：方法同香蕉DNA的鉴定。结果如图7（1对照组、2实验组）。由于获取的人体口腔上皮细胞DNA有限，实验组颜色呈浅蓝色，结果和香蕉DNA结果相同。证明口腔上皮细胞中的DNA被成功提取。学生试图纯化提取的DNA，但由于获取的口腔上皮细胞DNA有限，如果再加入嫩肉粉或高温处理，效果不佳且易带入其他杂质无法处理，只好放弃纯化。 四、分析与讨论 1.实验材料 改进后的实验材料易得，价格低廉。如果采用香蕉作为材料，每班只需4斤香蕉，与用鸡血相比，成本降低97.5%以上。如果采用人口腔上皮细胞为材料则几乎零成本。这样就解决了实验经费不足的问题，特别是对经费紧张的农村学校而言更有推广价值，可以保证实验课能够正常开出。另外从自己的口腔上皮细胞的细胞核中提取DNA，容易激起学生的实验探索兴趣。同时，通过这个实验更容易建立细胞核、染色体、DNA之间的联系。 2.实验仪器和药品 改进后的实验不要离心机、铁架台、铁环、镊子、三脚架、滤纸等实验仪器，烧杯数量也减少一半。同时节省了大量的药品，如蒸馏水、柠檬酸钠等，只增加了家用洗手液、嫩肉粉和研钵。通过实验还发现，不同类型的洗涤剂如洗手液、洗洁精、洗发水和沐浴露等实验效果没有明显差异。 3.课前准备和实验用时 采用鸡血提取DNA，课前需要配制抗凝剂、采鸡血、离心、冷藏鸡血24h等。改进后的实验只需到市场购买香蕉即可，不仅简化了制备过程，且保证取材新鲜，操作简便易行。整个实验过程省时省力，学生的兴趣大大增强，人人动手参与。采用香蕉提取需要用时30min，采用口腔上皮细胞提取则只要5min～7min。这样，大部分学生在一节课均能完成两个实验。学生还能有时间比较动植物细胞提取的差别（如植物细胞需要研磨破坏细胞壁，而动物细胞则不需要）及如何改进优化实验，更加符合实验教学的初衷。学生通过实验亲自参与、收集和探索生物学事实，为重要生物学概念的学习提供支撑。 4.实验效果 原实验采用鸡血成功率较低，在30%以下。改进后的实验操作性强，实验效果明显。不管是香蕉还是口腔上皮细胞，学生均可成功提取DNA，成功率达到100%。需要注意的是在香蕉优化组时，加入酒精需缓慢且静置时间可适当延长，以增加DNA的析出量。后面的木筷子卷起漂浮沉淀时也要求动作轻柔，以减少DNA的损失并防止杯底的嫩肉粉等杂质被带入。另外，发现鉴定DNA时，二苯胺溶液容易被氧化变质，必须严格按照比例现配现用。沸水浴的时间必须保证10min或以上，才会有较明显的实验现象。沸水浴后待静置冷却一段时间后蓝色更为明显。 综上，本实验方案与教材和教参书上的相比，材料易得，实验步骤简单，只需要研磨、过滤、二苯胺显色鉴定等简单步骤，方法简便易于操作。另外，所用研磨液、洗手液为日常生活中常用之物，而且实验现象明显，成功率高。本方案能达到预期教学目标，对提高学生的科学素养有一定的价值，因此易于在普通中学中普及和推广。
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