海南医学院附属医院 病理科 570102
【摘 要】 目的：探讨优化胃癌HER2基因扩增FISH检测法的条件。方法：收集40 例手术切除的胃癌标本，采用NaSCN（80℃）预处理30min以及10mM PH6.0柠檬酸微波高档火15min处理组织切片，观察比较组织脱片情况，选择最优的消化前处理方法；胃蛋白酶37℃下进行酶消化处理，分别观察5分钟、10 分钟、15分钟和 20分钟不同的消化时间对 FISH结果的影响。结果：NaSCN预处理后，40例胃癌组织标本切片中有15例不同程度的掉片，其中有5例掉片严重；10mM PH6.0柠檬酸预处理有6例出现局部少量掉片现象，两者比较，差距有显著性意义（P <0.05）。酶消化 5min，所有切片标本大部分细胞轮廓不清晰，影响荧光信号观察，提示消化时间不足；酶消化 10min，所有切片内大部分细胞轮廓清晰，荧光信号好，提示消化时间适合；酶消化15min，所有切片内部分细胞内有小空泡现象（约20%），提示消化稍过但不影响结果判读；酶20min，切片内大部分细胞出现大空泡（约70%），形态毛糙不规则，荧光信号强度弱，提示消化过度。40例的胃癌标本组织杂交检测的扩增率为 12.5%，与其他多中心研究结果9% ～18%一致。结论：在本实验室的条件下，FISH检测胃癌HER2基因扩增步骤中采用10mM PH6.0柠檬酸微波高档火预处理组织切片15min，胃蛋白酶消化10-15min能取得较好的观察效果。
【关键词】 FISH；基因扩增；胃癌；HER2
The Optimization Of Conditions For Ｄetecting Her2 expression by FISH technology in gastric carcinoma
MENG Qiu-ping XUE Feng-gui LUO Zhi-fei Zheng YI-fei
（Department of pathology；the Affiliated Hospital of Hainan Medical College；Haikou 570102；China）
【Abstract】Objective：To obtain the Optimization Of Conditions For detecting Her2 expression by FISH technology in gastric carcinoma. Methods：The tissue samples were taken from 40 gastric cancer patients. To establish optimal Enzyme digestion pretreatment，40 paraffin-embedded samples was dispose with NaSCN
30 min（80 ℃）and 10 mm ph6. 0 citric acid 15min respectively .The enzymatic digestion was stopped at 5-minites interval with optimal Enzyme digestion pretreatment . 40 cases were evaluated for FISH with this optimal Enzyme digestion pretreatment and digestion time. Results：The results showed that 15 cases were slice off after dispose with NaSCN 30 min（80 ℃），6cases were slice off after dispose with 10 mm ph6. 0 citric acid 15min，there had significant difference between them（P<0.05）；the duration of digestion of 5 minutes was not enough and 20 minutes was over digested. Then the optimum time was 10 to 15 minutes，with which the hybridization signals were stronger than the others. The hybridization amplification rate of 40 cases of gastric cancer tissue was 17.8%，were identify with other multicenter study（9% ～18%）.Conclusion：We found the optimum enzy-matic digestion pretreatment in FISH on paraffin-embedded tissues of gastric cancer was 10 mm ph6. 0 citric acid 15min，with the enzy-matic optimum digestion time was 10 to 15 minutes in our lab.
【Key words】FISH1；gene amplification；gastric carcinoma3；HER-2 gene4
近年来，随着对胃癌分子生物学机制研究的不断深入，胃癌的靶向药物治疗初见进展。原癌基因Her-2定位于人类染色体17q12-21.3上，编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性，是表皮生长因子受体（Epidermal growth factor re-ceptor，EGFR）家族成员之一. Her-2蛋白过表达和（或）基因扩增不仅是制定胃癌有效治疗方案如分子靶向治疗、激素治疗和化疗的重要依据[1，2]，同时与胃癌复发、转移和不良预后密切相关。2009年，ToGA研究结果［3］显示，曲妥珠单抗联合化疗已经成为目前临床对HER-2/neu阳性进展期胃癌患者进行治疗的一个标准。因此实现HER-2/neu 检测操作程序和结果判读的标准化，对胃癌患者能否接受曲妥珠单抗治疗具有重要的临床意义，是胃癌患者从曲妥珠单抗靶向治疗中获益的前提。目前认为，FISH 技术是检测HER2 基因是否活化的金标准。最初组织的处理、固定情况、石蜡包埋的过程以及样本的年限等［4］切片本身的因素和酶的浓度及消化时间、溶液pH 值、变性条件、杂交后洗涤、结果判读以及操作者的经验等石蜡包埋切片的处理因素均会影响FISH 技术检测胃癌Her-2 基因的结果。因此有必要优化胃癌FISH检测的操作程序，实现对胃癌 Her- 2基因的准确检测。为此，本文通过在大量的文献报道中所推荐的胃癌HER-2检测条件的基础上对酶消化前的处理方法以及酶的消化时间进行优化研究，同时根据工作经验，总结出一套完整、可靠的Fish检测胃癌组织HER-2扩增的方法，为医生判断提供扎实基础，同时为临床靶向治疗提供可靠的实验依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1标本 收集海南医学院附属医院病理科2015 年 7 月 ～2015 年 12 月40例胃癌石蜡组织标本；所有标本均来源于胃全切或大部切除胃癌组织，未行术前放化疗，所有病例均经两位副高以上病理医师复核确诊。其中男性 28 例，女性12 例，年龄 26～80岁，中位数为60.5岁。
1.1.2 主要仪器与试剂 Path Vysion Her-2基因检测试剂盒（基因科技上海公司，货号：02J01-030）；Pepsin 1：1000（solarbio，货号：P8160）；橡胶水泥（中杉金桥，货号：2LI-9730）；盖玻片（PanPath，货号Z000S.0005）；OLympus BX53荧光显微镜；ThermoBrite原位杂交仪。
1.2 方法
1.2.1 胃癌切片准备 新鲜胃癌组织标本离体后立即切开，用 10% 中性福尔马林固定，经过 8 ～24h 后进行脱水、浸蜡、包埋；4-6μm 连续切片8张，切好置于60 ℃的恒温箱中烤片过夜；取出恢复常温后按下列步骤进行脱蜡：（1）二甲苯脱蜡15min两次。（2）无水乙醇5min，90%乙醇5min，75%乙醇5min。（3）切片置于去离子水中3min。（4）取出后常温彻底干片。
1.2.2 预处理 切片干燥后，按如下步骤进行消化前分组预处理：（1）40例胃癌组织，每例4张切片在微波炉中用10mM PH6.0柠檬酸高档火处理组织切片15min，去离子水洗两遍，每遍5min。（2）40例胃癌组织，每例4张切片浸没在80℃的预处理液（NaSCN）中30min，去离子水洗两遍，每遍5min。（3）洗净后自然干片，观察组织脱片情况；（4）选择各组消化前预处理较好的40张切片，放入胃蛋白酶工作液中（4mg/ml胃蛋白酶，10mM HCl），37℃下，分别消化5min、10min、15 min、20min。（5）消化结束后，去离子水浸洗3min、0.2M Hcl清洗液中浸泡5min、梯度酒精脱水，常温自然干片后滴加１０ μＬDAPI溶液，荧光显微镜下观察组织消化情况。
1.2.3 探针杂交：探针杂交及清洗过程按基因公司产品说明书进行。简而言之，载玻片上滴加 10 μ L 杂交液；小心将盖玻片放到载玻片上封片，注意加探针与加盖盖玻片时避免产生气泡；78℃ 3min，37℃避光杂交16 h；杂交结束后依次经2xSSC浸泡去除盖玻片，73±1℃ 2×SSC／0.3%NP-40清洗2ｍin、常温2×SSC／0.1%NP-40清洗2min、常温２xSSC清洗2min，取出后置于暗盒中自然干燥。滴加10μＬDAPI溶液，暗室放置5-10min，在荧光显微镜下计数信号。
1．3 结果判读
HER-2基因扩增检测，使用40x物镜以对多个肿瘤细胞区域进行扫描，确定样本是否有异质性。选择细胞核分布良好的区域，在100倍物镜下观察并计数4０个胃癌细胞核，统计Ｒatio值（Ｒatio值＝40个细胞核中红信号总数/4０个细胞核中绿信号总数）。Ｒatio值 ＜2.0为阴性；Ratio值≧2.0为阳性；1.8～2.2之间时，可以选择再计数20个细胞的信号或由另一位医师计数，若比值≧2.0判断为FISH阳性；比值＜2.0判断为FISH阴性。
1.4 统计学分析
应用SPSS19.0软件进行统计学分析，采用四格表χ2检验或Fisher确切概率计算。所有统计学分析均采用双侧检测，P<0.05差异有统计学意义。
2 .实验结果
2.1 NaSCN预处理后，40例胃癌组织标本切片中有15例出现不同程度的掉片，其中有5例掉片严重；10mM PH6.0柠檬酸预处理有6例出现局部少量掉片现象，两者比较，差异有显著性（p=0.041），表明采用10mM PH6.0柠檬酸预处理切片能较好的控制掉片。选取各组40张预处理切片完整的组织进行FISH检测，结果发现两者消化结果、荧光强度没有明显的差异，表明两种预处理方法对荧光染色没有影响（P=0.737），因而，我们选取10mM PH6.0柠檬酸预处理方法进行下一步实验。
如图所示，消化5分钟，图像模糊，细胞结构不清，荧光信号弱；消化10-15分钟，细胞结构清晰，荧光信号强，但消化15分钟时，细胞内开始出现空泡；消化20分钟，细胞溶解明显。
3.讨论
荧光原位杂交（fluorescence in situ- hybridization，FISH）是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，实现对目的 DNA 片段或基因的定性、定量或相对定位分析。目前，FISH技术普遍被认为是检测 Her- 2 基因是否活化的“金标准”。
2009 年12 月曲妥珠单抗（Herceptin，赫赛汀）联合其他化疗药物正式被批准用于治疗HEＲ-2阳性胃癌，成为首个应用于胃癌的HEＲ-2靶向抗癌药。胃癌的靶向治疗，能有效地改善患者的生活品质和治疗效果，最大程度的延长患者的生存期，为实现患者的“个体化治疗” 迈出重要一步。HER-２基因在部分胃癌患者中过度表达是一个预后不良的因素。由于胃癌组织中不完全的膜染色和HER-2异质性基因表达更常见，HER-2蛋白过表达和HER-2基因扩增在胃癌的评估更值得重视。FISH 技术多用于对HER2 蛋白表达为临界值 2+ 的病例，以明确 HER2 基因是否扩增，使患者可能从 HER2 为靶点的抗肿瘤药物治疗过程中受益。
在进行F I S H检测时常受到多种因素的干扰［7.8］，包括：杂交信号微弱、杂交信号的不一致以及存在高荧光背景导致的杂交结果无法判断。此外，细胞核的缺损或重叠引起的信号缺失或重叠也会影响杂交结果的判断［7］。目前，大部分的科室都是采用10% 中性福尔马林作为标准的固定剂。甲醛溶液能很好地保持组织形态结构的完整，起到良好的固定作用，但影响细胞膜的通透性，阻碍核酸探针的掺入，使杂交信号减弱。因此石蜡包埋组织在进行FISH杂交前的前处理阶段至关重要。胃癌HER-2检测的组织样本要求：外科手术切除标本或者活检标本（选取6-8个高质量，有代表性的样本最为理想）。正确的组织处理有助于HER-2检测的准确性，而组织标本的固定是HER-2检测的关键步骤，以下三点会影响整个胃癌HER-2检测的结果：固定开始时间；固定液的类型；固定持续时间。为保证实验结果，从组织获取至固定开始之间的时间应尽可能短，样本应该被尽快置于固定液中，理想的时间为从患者体内取出后30min内；且所有的样本应在10%的中性福尔马林中固定8-48h。尽 管MU E L L E R等[ 9]，B A R T L E T T等[ 10]以 及 P a t h V y s i o nH E R-2 D N AP r o b eK i t 都推荐使用 0. 2 m o l /L 的 H C l以及 1 m o l /L 的硫氰酸钠进行消化前的处理，以利于酶更好地对蛋白质进行消化增加探针的穿透性以达到更优的杂交效果，但是我们在实验中发现在经过这两步处理后切片易发生脱片现象，而且硫氰酸钠处理过程需要 30 m i n，耗时长；本实验采取10mMPH6.0柠檬酸进行消化前的处理，发现处理后切片发生脱落现象少，所需试剂少，操作时间短，故推荐使用。前处理中的酶消化过程是胃癌HER-2检测中最为关键的一步。许多文献报道称蛋白酶 K和胃蛋白酶都可以用于石蜡包埋组织的酶消化过程【11-13】。然而不同的组织标本具有不同的调节酶类型和消化时间，应在实验前使用显微镜观察其标本和形态类型，从而确定标本的调节酶类型和消化时间。本实验采用37℃0.1mol/LHCL的胃蛋白酶工作液（4mg/ml）进行消化，并通过进行酶消化时间的梯度实验，我们认为 37℃，0.1mol/LHCL的胃蛋白酶工作液（4mg/ml）消化 10 ～ 15min 比较理想，镜下细胞分界清楚，背景干净，杂交后杂交信号好，能够很好地辨别信号点，进行计数。本实验杂交检测的扩增率为 12.5%，与其他多中心研究结果9% ～18%一致，证明本实验所采取的检测方法符合检测要求，可以为临床靶向治疗提供可靠的实验依据。
总之，由于组织标本间的差异性，以及消化前的处理（包埋、固定、切片厚度、预处理液等）不同会导致消化的时间也不一样，因此没有统一限定标准的酶消化时间。我们建议不同实验室在进行 FISH 检测前，应对每个切片进行消化前的处理以及酶的消化时间的摸索，以实现本实验室HER-2/neu 检测操作程序的标准化，提高杂交率和诊断准确率。
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论文作者:蒙秋萍,薛逢贵,罗志飞,郑艺菲
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年6月第5期
论文发表时间:2016/6/24
标签：胃癌论文; 切片论文; 组织论文; 基因论文; 标本论文; 靶向论文; 信号论文; 《中国医学人文》(学术版)2016年6月第5期论文;