汪爽[1]2001年在《地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中提出第一部分 双袖套法大鼠原位肝移植 模型制作的改进 目的：探讨建立简便实用的双袖套法大鼠原位肝移植模型。 方法：在Kamada及孙君泓方法的基础上进行了改进。按照动物大小、血管粗细选择各种口径市售塑管棉棒自制成血管套管，用硬膜外麻醉导管制成胆管支架管，供受体均取腹部横切口，用输液器滴注经门静脉低压灌洗供肝，受体无肝期前在门静脉分叉上端两侧用缝线预置牵引线，肝上下腔静脉采用血管膜端端“叁定点”吻合法，门静脉及肝下下腔静脉采用袖套吻合法，用自制“小针钩”驱除气泡并协助套管插入，胆管吻合采用单管插管吻合，不分离周围组织，肝脏及肠管保持原位，术后补充少量肝素生理盐水。 结果：共行SD→SD大鼠原位肝移植手术96例，其中预备手术56例，正式实验40例。改进后正式实验，供体手术时间平均29min，袖套准备时间平均10min，受体手术时间平均51min，无肝期平均17min；2d存活率95％（38/40），1 wk存活率92.5％（37/40）。 结论：（1）改进的双袖套法大鼠原位肝移植术可在单人直视下进行，安全确切实用，简化了操作，提高了手术成功率。（2）自制血管套管简单易行；与直切口相比，腹部横切口可使暴露更加充分；肝上下腔静脉“叁定点”缝合法吻合确切，成功率高；所有吻合均应无张力、保持原位；自制“小针钩”排气效果确切迅速。（3）肝上下腔静脉吻合是受体手术的难点，良好的胆管吻合是受体长期存活的保障，耐心细致的手术操作是模型成功的关键。第二部分 地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注 诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究 目的：探讨通过地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注诱导大鼠肝移植特异性免疫耐受的可能性，为对成年动物不作常规的免疫抑制处
谢金敏[2]2007年在《供体凋亡淋巴细胞预输注诱导猪肝移植免疫耐受的实验研究》文中认为研究背景目前,原位肝移植(Orthotopic liver transplantation,OLT)是治疗终末期肝病最有效和常规措施。然而,尽管由于外科技术的标准化、免疫抑制剂的不断研发和应用,移植物的长期存活率没有明显提高。器官移植术后的排斥反应仍是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。免疫抑制剂的应用,虽然有效地抑制了急性排斥反应,但长期应用免疫抑制剂必然会给移植病人带来许多副作用和潜在的危险性,如增加感染、肿瘤的发生率,也不能有效地控制可导致移植物失功的慢性排斥反应的发生。因此,诱导受者对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施,相对免疫抑制疗法,诱导免疫耐受的优势是从根本上避免了排斥反应,又不影响机体的正常抗感染和免疫监视功能,同时避免了药物毒性。而且,耐受的诱导对于最终克服异种移植免疫学障碍也许是最佳途径,因为异种移植免疫抑制需长期高水平的、非特异性的免疫抑制剂来维持。因此,诱导移植免疫耐受性,控制移植物排斥反应,保护移植器官的功能,这无论在同种移植和异种移植中都是十分重要的课题。目前在啮齿类动物,已有许多可行的策略成功诱导出血管化移植物的长期存活。但应用这些策略过渡到临床,由于在大动物模型中得不到相同的结果,却受到了限制。国内外学者对诱导免疫耐受的尝试甚多,但结果均不甚理想,机制尚不明确,更没有成熟可应用于临床的方案。因此,如何成功地在成年大动物和临床诱导免疫耐受成为免疫学家和移植学家的主攻方向和目标。细胞凋亡是机体内普遍存在的一种生理和病理现象。近来越来越多的研究表明凋亡细胞能够主动调节机体的免疫功能,并能通过调节机体细胞免疫和体液免疫的途径诱导免疫耐受。我们已成功的建立小动物移植模型并验证了供体凋亡细胞预处理受者能够诱导免疫耐受,并提出了一个新的观点:肝脏是特异性吞噬凋亡细胞的场所,凋亡细胞有局部免疫抑制的作用,吞噬了凋亡细胞的肝脏抗原递呈细胞在局部免疫抑制的环境下递呈抗原给T细胞,而诱导对被吞噬抗原的免疫耐受。现进行大动物实验来验证我们的发现,同时进一步探索凋亡细胞诱导免疫耐受的机制。第一章非转流小型猪原位肝移植模型的建立目的:探索建立简便稳定的小型猪原位肝移植模型,为我们大动物免疫耐受的实验提供平台。方法:用非静脉转流的方法建立中国小型猪原位肝移植模型。实验过程分为供体手术、供肝修整、受体手术、围手术期处理四部分。供体采用基础麻醉,经腹主动脉取血备受体输血用,采用肝动脉及门静脉双灌注的方法进行供肝灌注。受体采用气管插管+静脉复合全麻,切除受体肝脏,先吻合肝上下腔静脉、门静脉后结束无肝期,然后依次吻合肝下下腔静脉、肝动脉,采用套管法吻合胆总管。结果:共进行中国小型猪原位肝移植手术18例,平均手术时间(179.6±14.3)min,平均无肝期(27.3±3.4)min,术中平均失血量422ml,平均输血量444ml,本组无术中死亡,术后当天死亡1例,死亡原因为急性肺水肿,术后第二天死亡1例,死亡原因为胆总管吻合口胆瘘,术后7天存活率88.9%。术中无肝期门静脉及下腔静脉的阻断,导致血液动力学波动明显,代谢功能发生急剧变化:无肝期平均动脉压、中心静脉压与无肝期前比较有明显下降(P＜0.01);无肝期及新肝期出现酸中毒,PH值及碱剩余下降,手术结束时平均动脉压及中心静脉压恢复,经药物调整后血清钾下降,酸碱逐渐恢复正常。结论:(1)移植肝脏修整时保留肝上下腔静脉周围的膈肌环,并行一周的锁边缝合,保证植入后吻合口无漏血,同时防止血管扭曲引起的回流不畅。(2)在猪肝移植胆道重建中采用套管法,可以简化手术操作,效果可靠,避免了胆瘘,同时明显缩短了手术时间。(3)熟练的手术技巧,并对血管吻合进行技术改进,可缩短无肝期手术时间,是非转流条件下猪原位肝移植成功的关键。(4)无肝期保持血液动力学的稳定是手术成功的重要保证,无肝期前开始扩容,无肝期补液速度加快,此时应用血管活性药物可较好的维持血液动力学稳定,静脉血流完全开放后,则严格限制液体输入,并根据血液动力学变化随时调整输液速度。(5)非转流条件下的小型猪原位肝移植模型具有手术方法简便、易于复制,标准化程度及手术成功率高,稳定性好的优点。第二章~(60)Coγ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植免疫耐受的实验研究目的:探讨通过~(60)Coγ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植特异性免疫耐受可能性的方法,为不作常规免疫抑制处理成年大动物的诱导移植免疫耐受提供可行的途径。方法:在已建立非转流小型猪原位肝移植模型的基础上,供体为中国四川版纳小型猪,受体为中国西藏小型猪,将供、受体组动物随机分为对照组与处理组进行移植手术。应用~(60)Coγ射线体外处理供猪淋巴细胞,AnnexinV/PI双标法检测~(60)Coγ射线处理后淋巴细胞的凋亡率。受猪术前7天经耳静脉输注供体~(60)Coγ射线处理过的淋巴细胞(5×10~8),或不做预输注,观察两组受体猪移植术后的存活时间,术后检测肝功能、T淋巴细胞亚型及病理。结果:(1)~(60)Coγ射线体外处理后的淋巴细胞凋亡率(48.70±6.17%),较正常淋巴细胞凋亡率(0.14±0.09%)明显增高(P＜0.01)。(2)实验结果显示处理组中位存活时间与对照组相同,中位生存时间为7天。(3)移植术后3天,处理组和对照组病理活检均呈急性中、重度排斥反应;术后6天,两组均呈急性重度排斥反应。(4)两组术后肝功能检测ALT、AST、TBil、TB及ALB测定结果均为肝细胞破坏表现。术后1、3、6天两组ALT、AST、TBiL均较术前增高(P＜0.01),TB、ALB较术前降低(P＜0.01),但两组间差异无显着意义(P＞0.05)。(5)术后1、3、6天CD4~+T、CD8~+T、CD4~+CD25~+Tr升降趋势与血常规中LYM的升降趋势大致相同,两组间差异无显着意义(P＞0.05)。结论:~(60)Coγ射线体外照射可以诱导淋巴细胞凋亡。~(60)Coγ射线体外处理过的淋巴细胞预输注未能够诱导猪同种异体肝移植特异性免疫耐受。
姚冰[3]2003年在《供体凋亡细胞预输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中进行了进一步梳理研究目的： 探讨肝硬化大鼠肝移植动物模型的建立方法，及其与正常大鼠肝移植免疫学变化可能存在的不同影响。进一步研究预输注通过处理后的供者凋亡细胞是否可以诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受，为临床诱导肝移植的免疫耐受提供新的思路和可行的方法。 材料与方法： 一、供、受体均为SD大鼠，用四氯化碳蓖麻油溶液制作大鼠肝硬化模型，用双袖套法制作大鼠原位肝移植模型进行实验，建立肝硬化大鼠的原位肝移植模型。采用自制套管，供受体SD大鼠均取腹部横切口，受体无肝期前预置门静脉缝扎牵引线，肝上下腔静脉采用血管膜端端“叁定点”吻合法，门静脉及肝下下腔静脉采用袖套吻合法，用自制“小针钩”排气。观察肝硬化大鼠7周后的肝脏病理结果，及其行原位肝移植后的成功率。 二、Wistar大鼠10只，随机分2组。正常组：正常Wistar大鼠不作处理，取脾脏分离脾细胞。地塞米松组(Dex)：地塞米松连续3天，第4天取脾脏分离脾细胞。采用AnnexinV联合PI双标法流式细胞仪测定细胞凋亡情况。 叁、供体为Wistar大鼠，受体为SD大鼠。实验分正常组、正常手术对照组伽一Control组)、肝硬化手术对照组(C一Contr01组)，地塞米松体内处理组(Dex组)、脾细胞组(SpC组)和地塞米松体内处理的脾细胞组(Dex一sPC组)。正常组SD大鼠只采尾静脉血作肝功能对照;N一Control组供体和受体大鼠均不作处理;C一Control组供体不作预处理，受体为肝硬化大鼠;Dex组术前10天用地塞米松腹腔注射处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，不输供体大鼠脾细胞;SpC组不用地塞米松处理供体大鼠，受体为肝硬化大鼠，术前7天输供体大鼠脾细胞(5xl夕);Dex一sPc组术前10天用地塞米松腹腔注射预处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，术前7天经阴茎背静脉输注供体大鼠脾细胞(5、107)。观察各组大鼠移植术后的存活时间，术后1周肝功能(ALT、TBIL)及病理变化。 结果: 一、(l)肝硬化大鼠7周肝脏病理结果证实为肝硬化(见附图l:正常肝脏，2:肝硬化肝脏，3:肝硬化病理切片，4:肝硬化病理切片)。病理可见肝细胞变性、坏死，细胞索排列紊乱，纤维组织大量增生，将肝实质分割成大小不同的假小叶。(2)行大鼠原位肝移植术26次，其中正式实验20次。改进后正式实验，供体手术时间25一35 min，平均29 min;袖套准备及肝脏修整时间8一13 min，平均10 min;受体手术时间45~60min，平均5 1 min;无肝期14~23 min，平均17 min。正式实验Zd存活率9oo’0(15/20)，l周存活率85%(17/20)。 二、地塞米松体内处理后的脾细胞凋亡率(33.5肚624%)，较正常大鼠脾细胞凋亡率(0.7肚0.11%)明显增高(P<0.ol)。 叁、(l)各组大鼠术后存活时间:N一Control组(n=7) MST二10天、C一Control组(n=8)MST=17天和Dex组(n=8)MST=16天，术后存活时间无明显差别;Spc组(n一8) MST=28天，较N一Control组、C一Contr01组和Dex组存活时间明显延长;Dex一SpC组(n=8)MST>60天，较其它各组均显着延长。(2)各组大鼠术后1周肝脏急性排斥反应的病理变化:N一Control组、C一Conirol组和Dex组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在6一9之间，排斥反应较SpC、Dex一spC组重;SPC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在4一6之间，排斥反应较前叁组轻，较Dex一SPC组重;Dex一SpC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在3一5之间，排斥反应最轻。(3)各组大鼠术后1周肝功能变化:N一eontrol组、e一eontrol组、oex组、Spe组和nex一spC组肝功能TBIL和ALT较正常组均升高;N一Control组、C一Control组和Dex组肝功能示TBIL和ALT较spc组和Dex一SPC组均明显增高;SpC组肝功能示TBIL和ALT稍低于N一Control组、C一Control组和Dex组，高于Dex-SpC组;Dex一SpC组肝功能示TBIL和ALT明显低于N一Control组、C一eontrol组、nex组和SpC组。 结论: 改进的双袖套法大鼠原位肝移植术可在单人直视下进行，安全确切实用。所有吻合均应无张力、保持原位，耐心细致的手术操作是模型成功的关键。 地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注能够诱导肝硬化大鼠同种异体肝移植免疫耐受。地塞米松诱导供体脾细胞凋亡，预输注的脾细胞不仅提供了凋亡细胞，也提供了供体抗原，受体吞噬细胞吞噬凋亡脾细胞可以产生免疫抑制，受体抗原提呈细胞在免疫抑制的环境下加工和处理抗原，产生免疫无反应性，从而对随后植入的移植物产生免疫耐受。 凋亡细胞预输注可以诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受，提示肝脏在诱导肝移植免疫耐受过程中并非起主要作用。
张永革[4]2003年在《地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中认为地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受的实验研究 目的：探讨通过地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注是否可以诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受，为临床诱导移植免疫耐受提供新的思路和可行的方法。 方法：用四氯化碳蓖麻油溶液制作大鼠肝硬化模型，用双袖套法制作大鼠原位肝移植模型进行实验，供体为Wistar大鼠，受体为SD大鼠。实验分正常组、正常手术对照组(N-Control组)、肝硬化手术对照组(C-Control组)，地塞米松体内处理组(Dex组)、脾细胞组(SpC组)和地塞米松体内处理的脾细胞组(Dex-SpC组)。正常组SD大鼠只采尾静脉血作肝功能对照；N-Control组供体和受体大鼠均不作处理；C-Control组供体不作预处理，受体为肝硬化大鼠；Dex组术前10天用地塞米松腹腔注射处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，不输供体大鼠脾细胞；SpC组不用地塞米松处理供体大鼠，受体为肝硬化大鼠，术前7天输供体大鼠脾细胞(5×10~7)；Dex-SpC组术前10天用地塞米松腹腔注射预处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，术前7天经阴茎背静脉输注供体大鼠脾细胞(5×10~7)。观察各组大鼠移植术后的存活时间，术后1周肝功能(ALT、TBil)及病理变化。Annexin V/PI双标法检测地塞米松体内处理后供体大鼠的脾细胞凋亡情况。 结果：(1)各组大鼠术后存活时间：N-Control组(n=7)MST=9天、C-Control组(n=8)MST=18天和Dex组(n=8)MST=15天，术后存活时间无明显差别；SpC组(n=8)MST=34天，较N-Control组、C-Control组和Dex组存活时间明显延长；Dex-SpC组(n=8)MST＞100天，较其它各组均显着延长。(2)各组大鼠术后1周肝脏急性排斥反应的病理变化：N-Control组、C-Control组和Dex组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在6—9之间，排斥反应较SpC、Dex-SpC组重；SpC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在4-6之间，排斥反应较前叁组轻，较Dex一SPC组重;Dex一SPC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在3一5之间，排斥反应最轻。(3)各组大鼠术后l周肝功能变化:N一Control组、C一Control组、Dex组、SpC组和Dex一spC组肝功能TBil和ALT较正常组均升高;N一Control组、C一Control组和Dex组肝功能示TBil和ALT较SpC组和Dex一SPC组均明显增高;spC组肝功能示TBil和ALT稍低于N一Contr01组、C一Control组和Dex组，高于Dex-spe组;oex一spe组肝功能示TBil和ALT明显低于N一eontrol组、e-Co咖1组、Dex组和SPC组。(4)地塞米松体内处理后的脾细胞凋亡率(32.40士5.61%)，较正常大鼠脾细胞凋亡率(0.77士0.n%)明显增高(只0.01)。 结论:地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注能够诱导肝硬化大鼠同种异体肝移植免疫耐受。地塞米松诱导供体脾细胞凋亡，预输注的脾细胞不仅提供了凋亡细胞，也提供了供体抗原，受体吞噬细胞吞噬凋亡脾细胞可以产生免疫抑制，受体抗原提呈细胞在免疫抑制的环境下加工和处理抗原，产生免疫无反应性，从而对随后植入的移植物产生免疫耐受。
王明[5]2010年在《免疫抑制剂及凋亡细胞诱导移植免疫耐受的实验研究》文中提出研究背景：器官移植是目前治疗器官终末期疾病的最有效的治疗措施,但是移植术后的排斥反应仍是阻碍患者和移植物长期存活的主要原因,传统免疫抑制剂的应用虽然能够有效地抑制急性排斥反应,但是在移植物的慢性排斥方面仍是不能解决其根本原因,并且长期服用免疫抑制剂会增加患者感染、中毒、肿瘤等疾病的发生率,且费用昂贵。因此,解决器官移植术后排斥反应的关键在于诱导受者对供者移植物的免疫耐受,免疫耐受是机体免疫系统在接触某种抗原后所产生的对该抗原的特异性免疫无应答状态,一旦此种免疫无应答状态形成后便无需任何免疫抑制剂维持,从而从更本上解决移植后的排斥反应,达到移植物与宿主能够长期共存的目的。但是,目前摆在移植免疫学界的难题就是如何才能够诱导受者的移植免疫耐受?据此孙尔维等人提出了利用供体凋亡细胞诱导受者免疫耐受的假说。该假说认为凋亡细胞能主动性地调节机体的免疫功能,凋亡细胞通过给其APC主动性地传递吞噬信号"eat me signal"使得吞噬细胞能够快速摄取凋亡细胞并将其所携带的供者抗原被特异性地浓集与受者APC内,从而短时间内提供大量供者MHC抗原,有效地被受者APC提呈给T细胞,最终促进调节性T细胞(Treg)的产生,抑制辅助性T细胞的产生来诱导机体的免疫耐受。国外Fsdok等人也发现巨噬细胞大量吞噬凋亡细胞时,可以抑制一些炎性因子的分泌,促进了TGF-β、IL-10等一些免疫调节因子的产生。Voll等人发现在细菌脂多糖刺激外周血淋巴细胞的反应中加入凋亡细胞不仅能够抑制IL-2、IL-1B、TNF-α等炎性因子的分泌,而且能够促进免疫抑制因子IL-10的产生。本课题组已经成功建立了供者凋亡细胞预输注诱导小动物心脏、肝脏移植免疫耐受模型,但是单纯输注凋亡细胞对大动物的移植模型诱导免疫耐受的作用并不明显,同样,国内外众多学者对诱导成年大动物移植免疫耐受进行了多次尝试,均没有理想的结果,但是凋亡细胞联合免疫抑制剂对大动物移植免疫耐受的诱导实验尚未见报道。目前就如何建立成年大动物和临床诱导免疫耐受已经成为了移植免疫学界的主攻方向和目标。因为大动物免疫系统比较复杂,排斥反应强烈,且购买及饲养价格都比较昂贵,故本课题欲先采用小鼠建立皮肤移植模型,小鼠皮肤移植模型排斥反应较为强烈,并且小鼠免疫系统简单,易操作,费用较为低廉,给受者小鼠预输注凋亡细胞并联合低剂量的免疫抑制剂诱导其免疫耐受,并通过检测其在不同免疫抑制剂作用下的全血中细胞因子的变化来探讨其机制和原理,为下一步大动物和临床诱导免疫耐受做一个探索性研究。本课题为国家自然科学基金(供者凋亡细胞诱导移植免疫耐受的机制)资助项目。本实验利用同种异基因小鼠皮肤移植作为移植模型,皮肤移植是目前可行的器官移植中排斥反应最为强烈的模型,因观察周期短,操作简便,手术成功率高,可控性强等诸多优点而被广泛应用于移植模型的建立；凋亡细胞的制备有多种方法,目前一般采用紫外线照射、抗体诱导、化疗药物诱导、射线诱导、激素诱导等方法,本实验采取地塞米松药物诱导法。地塞米松作为糖皮质激素类药物具有调节细胞生长、发育、死亡以达到维持机体组织细胞平衡稳定的作用。地塞米松诱导淋巴细胞及其它免疫细胞的凋亡较其它方法稳定、易操作已有较多文献报道。第一部分地塞米松诱导供体胸腺细胞的凋亡的初步研究目的：摸索使用地塞米松作为诱导剂对小鼠胸腺细胞凋亡的诱导作用,为下一步实验找到一种稳定性高、可控性强、凋亡率高的诱导方法。方法：将健康成年小鼠胸腺研磨制成细胞悬液,用血球计数板计数后用RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清)调整细胞浓度为1×106／ml,将所获细胞分装进4个培养皿中进行不同处理：一组置于紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后5%C02孵箱37℃恒温培养4小时。另外叁组分别加入浓度为1×10-7M、2×10-5M、2×10-3M的地塞米松后置于5%CO2孵箱37℃恒温培养6小时；将处理后的四组胸腺细胞悬液用Annexin V-PI试剂双染后,用流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡和坏死。结果：1、不同浓度地塞米松处理后的小鼠胸腺细胞凋亡率略有不同,经1×10-7M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,用流式细胞仪检测其凋亡率为53.72%；经2×10-SM浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,检测其凋亡率为58.46%；经2×10-3M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,测得其凋亡率为55.72%。2、在紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后用5%CO2孵箱37℃恒温培养4小时后的小鼠胸腺细胞,测得其凋亡率为50.29%,；结论：用地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程复杂、耗时较长,而紫外线照射法操作简便、耗时短。但是用地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡率要高于紫外线照射法,且坏死细胞较少,结果稳定,容易控制,因2×10-5M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞凋亡率最高,故下一步实验给受者小鼠注射凋亡细胞采取2×10-5M浓度的地塞米松诱导。第二部分免疫抑制剂及凋亡细胞对诱导小鼠皮肤移植免疫耐受的试验研究目的：探索供体凋亡细胞与免疫抑制剂对小鼠皮肤移植免疫耐受的作用方法：1、制备供体小鼠的胸腺凋亡细胞：采用研磨法获得供者小鼠的胸腺淋巴细胞悬液,经2×10-5M DEX处理后放入5%C02孵箱37℃恒温培养6小时后,获取供体小鼠的胸腺凋亡细胞用Annexin V-PI试剂双染后,流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡率；2、实验分组：将受者小鼠随机分为四组：PBS对照组、凋亡细胞组、雷帕霉素(RAPA)组、RAPA+凋亡细胞联合组。输注供体胸腺凋亡细胞组别的受者小鼠分别在术前7、3、1天经阴茎背静脉输注供体小鼠的凋亡细胞悬液；接受药物处理的受者小鼠在术前3天开始灌胃给予RAPA药物,1次／d,直到所有移植皮片完全坏死时停药；3、建立小鼠背对背皮肤移植模型：将修好的供者小鼠背部皮片采用6-8针间断垂直褥式外翻缝合固定在受者小鼠背部,盖上无菌敷料后创可贴加压包扎；4、术后观察：在行皮肤移植术后第5天打开包扎观察移植皮片存活情况,若植皮与宿主的背底部愈合,色泽一致,无炎症和充血,有毛的皮肤毛发生长良好,则认为未发生排斥反应.50%以上皮片结痂、变硬、坏死、脱落作为排斥标准。结果：1、自体皮肤移植(手术控制组)45例,皮片存活时间>1月的存活率为95%(43／45)；2、受者小鼠术前分别预输注一次、两次、叁次凋亡细胞比较移植皮片存活时间没有统计学差异P>0.05,但是输注叁次凋亡细胞的受者小鼠移植皮片存活时间呈明显延长趋势；3、C57—>Babl/C小鼠背—背皮肤移植手术82例,其中PBS组18例,平均存活时间6.8天；凋亡组共20例平均存活时间7.4天；RAPA组共行手术22例,平均存活时间10.36天；RAPA联合凋亡细胞组共行22例,平均存活时间10.68天。用Kaplan-Meier统计方法分析后PBS对照组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异(P>0.05); RAPA组与PBS组比较有显着性统计学差异(P<0.01);RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异(P>0.05);4、Babl/C—> C57小鼠小鼠背—背皮肤移植手术78例,其中PBS组共18例,平均存活时间6.5天；凋亡组共20例,平均存活时间7.3天；RAPA组共行手术19例,平均存活时间10.42天；RAPA联合凋亡细胞组共行21例,平均存活时间10.52天。用Kaplan-Meier统计方法分析后PBS组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异(P>0.05),但是凋亡组较PBS组移植皮片呈延长趋势；RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异(P>0.05)。结论：1、分别输注1次、2次、凋亡细胞均对小鼠皮肤移植存活时间无明显延长,但是输注3次凋亡细胞对移植物存活时间有着明显的延长趋势；2、凋亡细胞对诱导同种异基因小鼠皮肤移植免疫耐受作用不明显。3、低剂量免疫抑制剂能够延长同种异基因小鼠的皮肤移植存活时间；4、免疫抑制剂联合凋亡细胞的协同作用在小鼠皮肤移植模型上效果不明显。第叁部分：不同免疫抑制剂对全血中细胞因子分泌的机制研究目的：研究不同免疫抑制剂对全血细胞中不同细胞因子分泌的影响。方法：1.取样：取健康成人外周血加入不同浓度的免疫抑制剂培养6 h后加入10μl浓度为0.15μg／ml的佛波酯(PMA)和10μl浓度为2.5 gg／ml的离子霉素(IONO),再培养6 h(37℃,5% CO2)后离心(300 G,5 min),收集上清待测;2.利用用Bio-Plex悬浮蛋白芯片系统检测细胞因子的变化,比较不同免疫抑制剂组细胞因子的水平。3.统计：采用SPSS10.0统计分析软件对数据进行统计分析。采用单向方差分析和LSD检验比较实验组与对照组之间的差异,P<0.05有统计学意义结果：高浓度,中浓度的地塞米松(DEX)及环孢素A (CsA)都能有效抑制MCP-1的分泌,而他克莫司(FK506)和麦考酚酸(MPA)不能有效抑制细胞因子的分泌。结论：DEX和CsA可有效抑制MCP-1的分泌,而FK506和MPA对MCP-1的分泌没有影响。
张会迎[6]2007年在《供者凋亡淋巴细胞对大鼠肝移植急排模型细胞因子的影响》文中指出第一部分:大鼠肝移植的技术改进和急排模型的建立目的:对经典“二袖套法”进行技术改进,建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型,观察DA—Lewis大鼠同种异体急性排斥反应的发生发展以及基本病理生理指标变化过程,为进一步研究凋亡脾淋巴细胞诱导移植免疫耐受建立良好的技术平台。方法:前期实验阶段采用改进的“二袖套法”,通过建立封闭群SD—SD大鼠原位肝移植模型150例,熟练建立大鼠肝移植模型的技能,提高稳定性。近交系大鼠正式实验分两组:A.同基因组(isogene group):Lewis—Lewis间18例;B.异基因组(allogene group):DA—Lewis间18例。除观察手术主要步骤用时、术后一般情况及术后存活时间外,受体分别于术后3d,5d,7d和10d处死取标本,观察肝脏组织病理变化,全自动生化分析法测定天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)水平变化。结果:前期实验阶段共进行大鼠原位肝移植实验150次,第二阶段能稳定建立起原位肝移植模型,供体手术时间:27.9±1.3min;修整供肝时间:12.0±1.1min:受体手术时间:55.4±2.3min:受体无肝期时间:17.9±0.9min;1周存活率93.3%(28/30)。同基因组大鼠无急性排斥表现(Williams标准),中位生存时间超过100天;肝组织发生轻度形态学改变,表现为肝细胞轻度变性浊肿,肝血窦轻度扩张,汇管区少量炎细胞浸润,整个肝小叶结构基本正常。异基因组大鼠术后黄疸明显,体重持续下降,中位生存时间为11天,术后第7天肝组织病理改变出现典型急排反应(Williams标准),表现为肝细胞变性重,有较多坏死细胞,肝血窦显着扩张充血,汇管区大量炎性细胞浸润,肝小叶结构破坏。肝功能方面,术后3d两组AST无显着性差异(P=0.741),同基因组TBil比异基因组高(P=0.004),5d、7d、10d异基因组AST、TBil水平均明显高于同基因组(P≤0.001)。结论:采用改进的“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型手术成功率高,稳定性好。综合异基因组大鼠术后在一般情况、生存时间、肝组织病理、血清肝功能等方面的表现,与临床急性排斥反应的特点相似,可证明DA—Lewis品系组合为肝移植急性排斥组合,尤其第7天开始出现典型排斥反应(Williams标准),可作为反应排斥程度的检测指标的时间点。同时,此急排模型可作为第二阶段凋亡细胞诱导移植免疫耐受研究良好的技术平台。第二部分供者凋亡淋巴细胞对大鼠肝移植急排模型细胞因子的影响目的:已知凋亡细胞发生免疫调节作用时伴有细胞因子等微环境的变化,本章实验在建立大鼠肝移植急性排斥模型的基础上,了解预输注凋亡脾淋巴细胞对排斥反应的抑制效果,并通过观察受体移植后肝组织内和外周血中细胞因子的变化,初步探讨凋亡细胞诱导免疫耐受的机制。方法:通过56℃水浴30分钟制备供体坏死脾淋巴细胞,通过直线加速器照射2.0 Gy培养8h制备供体凋亡脾淋巴细胞,并以AnnexinV联合PI双标法流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率。按第一章方法建立DA—Lewis大鼠肝移植模型。实验分叁组:1.对照组(Control group,CO):术前不做任何处理;2.坏死细胞组(Necrosis group,NE):术前第7天阴茎背静脉注射供体坏死脾淋巴细胞;3.凋亡细胞组(Apoptosis group,AP):术前第7天阴茎背静脉注射供体凋亡脾淋巴细胞。检测指标包括:1.术后存活时间的观察:每组4只,以100天为观察时间期限;2.肝功能检查、肝组织病理:每组分别于术后第7天处死大鼠(每组各处死3只),抽取外周血离心取血清于自动分析仪检测AST、TBil水平,切取肝组织行病理学检查。3.肝组织和外周血细胞因子检测:每组分别于术后第3、7、10天处死大鼠(每组每时间点各处死3只),取肝组织和外周血,低温环境下裂解组织和离心提取样本,以Luminex液相芯片法检测细胞因子,指标包括IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ。结果:1.流式细胞仪检测脾淋巴细胞结果:56℃水浴30分钟水浴制得细胞坏死率达98.561%,直线加速器照射2.0 Gy培养8h制得细胞凋亡率达50.408%。2.术后存活时间:叁组生存时间有显着性差异(F=110.667,P=0.000)对照组中位生存时间11天,坏死细胞组10天,两者间无显着性差异(P=0.878),凋亡细胞术后存活时间延长(P=0.000),中位生存时间超过100天。3.肝功能检测:坏死细胞组AST、TBil均高于对照组(P=0.010,0.024),而凋亡细胞AST、TBil均低于对照组(P=0.000)。4.肝组织病理学:移植术后第7天,对照组和坏死细胞组均呈重度排斥反应(Williams3级),表现为表现为肝细胞变性重,有较多坏死细胞,肝血窦显着扩张充血,汇管区大量炎性细胞浸润,肝小叶结构破坏。凋亡细胞组凋亡细胞组呈轻度排斥反应(Williamsl级)。肝细胞索状排列基本整齐,小叶结构清晰,肝细胞轻度浊肿,有点状坏死;汇管区少量炎性细胞浸润,血管轻度扩张充血。5.肝组织细胞因子变化:在各时间点(术后第3、7、10天)上,叁组间大鼠肝组织内IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平均有显著性差异(P＜0.01)。其中,各时间点坏死细胞组IL-2、IFN-γ水平均比对照组高(P＜0.05),而凋亡细胞组则比对照组低(P＜0.05):除了于术后第3天,凋亡细胞组与对照组间IL-10水平无显着性差异外,其他各时间点坏死细胞组IL-4、IL-10水平均比对照组低(P＜0.05),而凋亡细胞组则比对照组高(P＜0.05)。6.外周血细胞因子变化:对照组和坏死细胞组的术后血清IL—4、IL—10变化不大,叁个时间点间无显着性差异(P＞0.05),在术后叁时间点(术后第3、7、10天),两组间的IL—4、IL—10水平也均无统计学意义(P＞0.05),而两者的IL—2、IFN—γ水平则有显著性差异,坏死细胞组偏高(P＜0.05)。而对于凋亡细胞组,除了术后第3天IL—4水平与前两者无统计学意义外(P＞0.05),在各个时间点上,其IL—2、IFN—γ均比对应的坏死细胞组和对照组低(P＜0.05),而IL—4、IL—10水平则比后两者均高(P＜0.05)。结论:1.直线加速器X线照射2.0Gy和培养8小时能够简便有效地诱导大鼠脾细胞凋亡,凋亡率高,重复性强。2.从术后第7天的肝组织病理检查和血清肝功能结果显示术前7天预输注供体凋亡脾淋巴细胞能明显、确切减轻受体对同种异基因移植物的排斥反应,而坏死细胞则起相反效果,术后存活时间的结果更提示凋亡细胞可能诱导同种异基因肝移植受体的长期存活。3.从术后3、7、10天肝组织内和外周血中细胞因子检查结果所示,凋亡脾淋巴细胞的预输注可使移植后Th2细胞因子(IL-4、IL-10)的水平上调及抑制Th1(IL-2、IFN-γ)的表达,说明凋亡细胞诱导移植免疫耐受可能与调节Th1/Th2平衡有关,即促使Th0细胞往Th2细胞分化而抑制Th1细胞生成的趋势。4.由于Th1/Th2模式的局限性,此四种细胞因子变化如何对耐受诱导产生影响,还需要进一步对肝组织中其他细胞类型和反应功能的改变,如调节T淋巴细胞、记忆T细胞、B细胞等进行相继的研究。
丘昶儒[7]2010年在《预输注5-Fu处理的同种异基因淋巴细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的初步研究》文中研究说明目的预输注5-Fu处理的同种异基因淋巴细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的初步研究。方法1.双袖套法建立Wistar-SD的原位肝移植急性免疫排斥模型。2.体外用不同浓度的5-Fu处理同种异基因淋巴细胞。3.实验大鼠随机分4组,每组Wistar供鼠、SD受鼠各10只:A组:对照组,供、受体鼠无特殊处理,行肝移植手术。B组:单纯淋巴细胞组,受体SD大鼠术前第7、4天尾静脉注射淋巴细胞悬液(5 X 10~6/ml)1ml,共2次。C组:低浓度5-FU+淋巴细胞组,受体SD大鼠术前第7、4天尾静脉注射5-Fu(浓度7.5ug/ml)处理过的淋巴细胞悬液(5 X 10~6/ml)1ml,共2次。D组:高浓度5-FU+淋巴细胞组,受体SD大鼠术前第7、4天尾静脉注射5-Fu (浓度15ug/ml)淋巴细胞悬液(5 X 10~6/ml)1ml,共2次。4.观察移植鼠的术后一般情况,术后第7天每组大鼠随机取处死4只观察肝脏病理变化,其余的大鼠作生存分析。5.免疫组织化学的方法测定移植术后肝的FasL、CD4、CD8等分子表达,用image-pro plus6.0软件进行图像分析。结果1.肝移植大鼠的存活情况:A组生存时间为6.7±1.5d,B组生存时间为10.3±2.7d,C组生存时间为19.0±5.3d,D组生存时间为11.7±3.9d。其中B、C、D组和A组差异显着(P<0.01),C组和B、D组差异显着(P<0.01),B、D组差异不显着(P>0.05)。2.病理情况:C组大鼠肝脏病理改变呈急性轻度排斥反应,肝细胞条索状排列基本整齐,肝小叶结构存在;中央静脉血管少量炎性细胞侵润;汇管区少量淋巴细胞侵润。A组呈急性重度排斥反应;B、D组呈急性中度排斥反应。C组优于A、B、D组。3.免疫组化CD4、CD8表达:肝小叶中,A组CD8+T细胞的总累积光密度值(IOD SUM)高于B组、C组和D组(P<0.05)。B组、C组和D组无差异(P>0.05)。汇管区,A组CD8+T细胞的IOD SUM高于B组、C组和D组(P<0.05)。C组低于B组和D组(P<0.05)。B组和D组无差异(P>0.05)。CD4在肝小叶和汇管区均无表达。4.免疫组化FasL表达:肝小叶中,C组FasL细胞的IOD SUM高于A组、B组和D组(P<0.05)。B与D组无显着性差异(P>0.05)。A组低于B、C、D组(P<0.05)。汇管区,A组FasL细胞的IOD SUM低于B、C、D组(P<0.05)。C组高于A、B、D组(P<0.05)。B与D组无显着性差异(P>0.05)。结论1.成功建立了Wistar-SD大鼠原位肝移植模型。2.大鼠肝移植急性排斥中,CD8+T细胞是主要参与者,CD4+T细胞为辅助者。3.预输注低浓度5-Fu处理的同种异基因淋巴细胞可以诱导移植肝FasL表达上调。4.耐受机制可能是通过Fas/FasL通路,诱导肝小叶及汇管区的CD8+T细胞凋亡来实现。
刘静, 高毅, 孙尔维, 张志, 汪爽[8]2003年在《同期输注供者地塞米松诱导脾细胞对肝移植大鼠免疫影响》文中进行了进一步梳理目的探讨肝移植同时输注地塞米松体内诱导凋亡的供体脾细胞对受体肝移植免疫的影响。方法实验分为对照组、单纯供体地塞米松处理组,单纯输供者脾细胞组和地塞米松诱导供者凋亡脾细胞输注组。每组Wistar和SD大鼠各10只。用地塞米松3 mg·d-1·kg-1·b.w.处理Wistar大鼠3 d后,第4天行大鼠肝移植。观察术后第7天肝功能(ALT、TBil)的变化、病理改变和受体生存期。结果肝移植同时输注凋亡细胞组和单纯输注脾细胞组的谷氨酸转移酶(ALT)、血清总胆红素(TBil)较对照组和单纯地塞米松处理组显着升高(P<0.05);生存期明显缩短(P<0.05),病理改变呈急性重度排除反应,而对照组仅呈急性轻度排除反应。结论肝移植同时输注地塞米松体内诱导供体凋亡的脾细胞促进受体对移植肝的排除反应,凋亡细胞未被及时吞噬可能是引起排斥反应的重要原因。
汪艳[9]2006年在《供体凋亡淋巴细胞诱导移植耐受的免疫学机制初探》文中指出免疫耐受是解决移植排斥反应的根本方法之一。目前采用的耐受诱导方法多以中央和外周耐受理论为基础形成，但由于各种原因尚未取得预想的结果。凋亡是生物体内的基本生理现象之一，对于维持机体内在平衡非常关键。研究已发现，凋亡是机体维持免疫系统稳定的重要作用机制，而且凋亡细胞对炎性反应的抑制性调节作用是一种主动的过程：凋亡细胞通过分泌趋化因子、变换细胞膜表面特征“eat-me”分子，诱导吞噬细胞对其进行清除，同时在清除过程中通过巨噬细胞等分泌炎症抑制性因子，如TGFβ、IL-10、PGE_2等造成一个特殊的免疫微环境。正常生理状态下，此过程可以促使相关淋巴细胞对其特征性抗原识别激活后产生免疫耐受，而不是引起炎性免疫应答。根据凋亡细胞能够主动引起免疫耐受这一现象，孙尔维等首次提出利用供体凋亡细胞输注受体诱导供体特异性免疫耐受的理论设想。由此，本课题组前期研究开展了供体凋亡脾淋巴细胞对大鼠心脏、肝脏移植模型诱导耐受的实验研究，发现一定数量的供体凋亡脾淋巴细胞预输注可以诱导大鼠心、肝脏移植模型产生特异性免疫耐受，延长移植存活时间。该发现初步验证了孙尔维等的理论设想，但对于供体凋亡细胞输注如何诱导机体产生非特异性免疫耐受，其内在作用的关键环节和机制是什么，都尚未可知。同时，类似的相关机制研究，国内外都未有报道可以用来参照和解释，而了解供体凋亡细胞诱导移植耐受的内在机制对于深入掌握该理论的中心环节、进一步完善该理论设想，进而指导更有效地实现耐受诱导有
参考文献：
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