李艳萍[1]2003年在《水稻抗瘟基因部分序列的克隆及同源性分析》文中研究指明本研究以抗稻瘟病的水稻品种的基因组DNA为模板，根据已知的NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域，设计简并引物，通过PCR扩增获得了抗病基因同源序列的两个DNA片段，同时根据该品种携带的Pi-2(t)抗性基因的序列设计特异引物及水稻的遍在蛋白保守氨基酸序列设计任意简并引物，通过TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction)扩增获得了Pi-2(t)基因的两个右翼序列DNA片段。分别将它们与pGEM-T Easy Vector连接，转化E.coli DH5α，得到重组子，经酶切鉴定，结果获得了9个抗病基因同源片段的阳性克隆(分别命名为CR271、CR272、CR273、CR274、CR275、CR371、CR372、CR373和CR374)及两个右翼序列DNA片段的克隆(分别命名为JR2和JR3)。然后进行了序列的测定，通过全序列分析，结果表明：所获得的8个抗病基因同源序列均含有NBS-LRR类抗病基因的保守序列，如P-loop(Kinase 1a)、Kinase 2、Kinase 3a以及跨膜结构域等。其中CR271与水稻白叶枯病抗病基因Xa1(AB002266)氨基酸同源性有61％相同，76％相似，其它片段与已克隆的NBS-LRR类抗病基因同源片段都具有较高的同源性；所获得的右翼序列JR2DNA片段长为1321bp，JR3DNA片段长为896bp，此两片段在核苷酸水平及氨基酸水平上均未找到有显着同源的序列。同时本研究还以感病品种C039的基因组为模板，也扩增得到与C101A51抗病品种中抗病基因同源序列同样大小的DNA片段，但一个有抗病基因的保守结构，另一个片段不能通读。
林晶[2]2007年在《水稻不育系系谱抗稻瘟病遗传及抗病基因同源序列分析》文中研究指明水稻不育系是杂交稻重要亲本之一。现阶段生产上大面积推广应用的具有持久抗稻瘟病的水稻不育系较少，选育综合性状优良的抗稻瘟病不育系是杂交稻育种的重要任务之一。本研究以福建省农科院水稻研究所历时17年成功育成的一个水稻不育系抗稻瘟病系谱为研究材料，包括抗源谷农13、天谷(1991年育成)、福伊(1995年育成)、谷丰(2001年育成)、全丰(2004年育成)以及系谱亲本V41B和龙特浦B。在一套以CO39为轮回亲本的5个近等基因系和1个感病对照丽江新团黑谷(LTH)的遗传背景下，人工分别组配了谷农13、天谷、福伊、谷丰、全丰与近等基因系和感病对照的包括亲本(P)、F_1、F_23个世代的遗传材料，以2个稻瘟病菌系“97-102-16”和“98022B”进行喷雾接菌和抗性鉴定，应用经典遗传学分析方法研究该不育系系谱抗稻瘟病基因的遗传及其等位性关系；并根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物，采用PCR方法对该不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGAs)进行克隆、测序和聚类，研究抗病基因传递规律，分析抗瘟性表型与抗病基因同源序列相似性关系，为进一步有效利用和克隆抗稻瘟病基因提供科学依据。主要研究结果如下：1、水稻不育系系谱对稻瘟病抗性遗传研究表明，谷农13、天谷、福伊、谷丰和全丰对“97-102-16”和“98022B”2个供试菌系均表现高抗。5个近等基因系对菌系“97-102-16”均表现抗性，对菌系“98022B”的抗性表现有异，除了C104PKT近等基因系表现出高感1外，其余的4个近等基因系均表现抗性。丽江新团黑谷和CO39对菌系“97-102-16”和“98022B”均表现感病。在菌系“97-102-16”喷雾接菌条件下，谷农13和全丰的抗稻瘟病遗传受1对显性基因控制，福伊和谷丰均受2对显性基因控制，天谷受3对显性基因控制，其中天谷中有1对基因与Pi-3等位，其余的显性基因与Pi-1、Pi-2、Pi-3、Pi-4a和Pi-4b均呈独立遗传。在菌系“98022B”喷雾接菌条件下，谷农13、天谷、福伊、谷丰和全丰均受1对显性基因控制，且谷丰的显性基因与Pi-1和Pi-4b均呈连锁遗传，其余的显性基因与Pi-1、Pi-2、Pi-3、Pi-4a和Pi-4b均呈独立遗传。2、水稻不育系系谱抗病基因同源序列克隆与分析表明，供试的7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆(分别命名为：C1-5、C-6、C2-2、C2-6、C3-6、C3-7、C5-4、C5-6、C10-2、C10-4、C14-2、C14-6、C17-1、C17-4)。经过分析只有11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域(transmembrance domain)。这些NBS-LRR类氨基酸片段间同源性最高达98.3％，最低仅为29.7％，将这11个氨基酸片段登陆到NCBI上进行Blast，发现它们与Xal(AB002266)的同源性较高，42％-45％的氨基酸序列相同，59％-64％的氨基酸序列相似，且与水稻其它NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析，可以将其分为3类，分别记为G1、G2、G3，并发现抗源谷农13所含有的G3类基因，通过大谷、福伊传给后代谷丰、全丰。本文还对今后进一步有效利用和克隆该不育系系谱抗稻瘟病基因的技术路线进行了讨论。
黄利兴[3]2009年在《水稻系列不育系对稻瘟病的抗性遗传研究》文中研究说明稻瘟病是广泛发生在世界各稻区的一种最具毁灭性的真菌性病害。培育持久、广谱抗稻瘟病水稻系列不育系,并揭示其抗性遗传机理是杂交稻抗病育种的理论与实践基础。本文在评述水稻抗稻瘟病遗传和育种研究现状、阐述水稻品种与稻瘟菌互作机制、植物抗病基因同源序列的克隆与测序的基础上,以一个历时22年成功育成的一个水稻不育系抗稻瘟病系谱为材料,进行其抗谱、与稻瘟菌互作、抗稻瘟病基因遗传及抗病基因同源序列相似性等方面研究,初步揭示水稻系列不育系对稻瘟病的抗性遗传规律,为进一步有效利用和克隆其抗稻瘟病基因提供科学依据。主要结果如下:1.采用苗期室内喷雾接菌鉴定和稻瘟病重发区田间自然诱发鉴定相结合的方法,以10个水稻系列不育系和6个恢复系,按NCII设计配制一套包括16个亲本和60个杂种一代为研究对象,利用20个来自福建省主要稻瘟病区有代表性的致病力强的菌株,并结合2个包括福建省龙岩市茶地乡和湖北省恩施州白果乡稻瘟病重发区田间自然诱发点的数据,探讨了其抗谱特征。发现从1995年成功育成福伊A,到2001年育成的夏丰A、谷丰A、昌丰A,再到2004年育成的安丰A、全丰A、长丰A、乐丰A、富丰A等9个抗稻瘟病不育系及其配制的54个杂种一代,对近年福建省流行的稻瘟病菌生理小种及茶地和恩施的田间稻瘟病菌的群体毒力都具有很强的抗病反应,抗性频率均达100%,抗谱广,持续时间久,均含有显性主效抗瘟基因,对杂交稻均具有很强的显性抗瘟遗传效应;连丰A不育系及其配制的6个杂种一代,平均抗性频率为21.93%。在供试的6个水稻恢复系中,蜀恢527的抗性频率为72.3%,抗谱较广;明恢77、晚3、福恢13、明恢86、福恢5138等5个恢复系的抗性频率幅度为4.5%～13.6%,抗谱较窄。根据供试亲本抗瘟性系统聚类结果,可将16个亲本分成两大类型。第1大类为抗病类型,包括9个抗稻瘟病水稻不育系福伊A、夏丰A、谷丰A、昌丰A、安丰A、全丰A、长丰A、乐丰A、富丰A和1个中抗稻瘟病水稻恢复系蜀恢527。但福伊A、夏丰A等9个抗稻瘟病水稻不育系之间的抗病性表现差异不大,而与蜀恢527之间存在一定的差异。第2大类为感病类型,包括1个感病水稻不育系连丰A及5个水稻恢复系明恢77、晚3、福恢13、明恢86、福恢5138。2.在抗谱分析的基础上,同样以上述10个水稻系列不育系为母本,6个恢复系为父本,按NCII设计配制一套包括16个亲本(P)、60个F1和60个F2的遗传材料,采用数量性状的加性?显性?上位性及与环境互作的遗传模型和统计分析方法,以22个稻瘟病菌株和稻瘟病重发区田间自然诱发点作为环境,深入探讨了水稻系列不育系与稻瘟菌互作的遗传基础。发现供试水稻品种抗瘟性的表现是由供试水稻品种中的抗瘟基因与稻瘟病菌株互作的结果。对供试水稻品种抗瘟性的遗传控制作用从大到小依次为基因加性效应、显性×菌株互作效应、显性效应、加性×菌株互作效应、加性×加性上位性效应,而不存在加性×加性上位性×菌株互作效应。夏丰A、昌丰A、安丰A、福伊A、乐丰A、长丰A、全丰A、富丰A、谷丰A等9个水稻不育系及蜀恢527的抗瘟性可以稳定地传递给后代,都能极显着地提高其后代的抗瘟性,在抗瘟性方面有很高的育种利用价值。供试水稻品种抗瘟性的加性基因遗传概率是非加性基因遗传概率的2.2倍,加性基因产生的抗瘟性可以稳定地传递给后代;普通狭义遗传力是互作狭义遗传力的6.4倍,显示在不同的稻瘟病菌株胁迫的环境条件进行水稻抗瘟性的选择是有效的。3.在抗稻瘟病水稻不育系系谱中,选用抗源谷农13、天谷B、福伊B、谷丰B、全丰B为材料,在一套以CO39为轮回亲本的6个近等基因系和1个感病对照丽江新团黑谷(LTH)的遗传背景下,人工分别组配了谷农13、天谷B、福伊B、谷丰B、全丰B与CO39近等基因系和感病对照的包括亲本(P)、F1、F2 3个世代的遗传材料,以3个稻瘟病菌株进行苗期室内喷雾接菌鉴定,应用经典遗传学分析方法研究该不育系系谱抗稻瘟病基因的遗传及其等位性关系。发现谷农13、天谷B、福伊B、谷丰B和全丰B等5个亲本的抗瘟性都由显性基因控制。谷农13、福伊B、谷丰B和全丰B中都含有2对与CO39近等基因系中的Pi-1、Pi-2、Pi-3、Pi-4a、Pi-4b不等位的显性抗稻瘟病基因。天谷B中含有3对显性抗稻瘟病基因,它们都与Pi-1、Pi-2、Pi-4a、Pi-4b不等位,其中有1对与Pi-3等位。4.根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物PR2和ER4,采用PCR方法对福伊A、谷丰A等10个水稻系列不育系,谷农13、V41B等11个亲本,及感稻瘟病对照丽江新团黑谷(LTH)的NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGAs)进行克隆、测序,分析抗病基因同源序列相似性关系。在供试材料中,共获得33个NBS-LRR类抗病基因的同源片段。其中,从谷农13、福伊A、地谷B、昌丰A、夏丰A、连丰A、乐丰A、V41B、龙特甫B、博白B、金23B等11亲本中各获得2个同源片段,从天谷B、谷丰A、安丰A、全丰A、长丰A、富丰A、LTH、R931022、Y20、Y27、Y12等11亲本中各获得1个同源片段。运用Clustal W方法和DNAstar软件对这些氨基酸序列进行聚类分析,可分为12类NBS-LRR类抗病基因同源序列。用DNAsis软件对这12类抗病基因同源片段再次聚类分析,可分为9类NBS-LRR类抗病基因同源片段。其中,氨基酸片段间同源性最高达98.8%,最低仅为19.8%。
黄姗, 林晶, 吴志源, 黄利兴, 游年顺[4]2010年在《水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析》文中进行了进一步梳理根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal(AB002266)的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。
江南[5]2010年在《水稻品种Jefferson和谷梅2号广谱抗稻瘟病基因的发掘与定位》文中提出水稻是全世界最重要的粮食作物之一。稻瘟病(rice blast)由子囊菌灰色大角间座壳菌[Magnaporthe grisea]引起,是水稻生产中的最严重病害之一。实践证明,选育和推广抗病水稻品种(组合)是控制这一病害最安全、经济、环保的方法,而抗性基因的发掘与利用又是抗病育种的基础和核心。因此挖掘更多新的抗瘟基因,对于我们了解水稻抗病的分子机制具有重要的意义,同时对水稻抗病育种也具有巨大的实践应用价值。本研究对多个国家和地区收集到的十份抗源材料进行了抗谱分析和等位性测定,并利用分子标记对其中的两份候选抗源的抗瘟基因进行了定位,具体结果如下：1.选取了来自4个国家的10份水稻抗源材料,利用从国内外7个稻瘟病发病区分离的32个稻瘟病菌生理小种进行室内接种,鉴定筛选出了Amber、谷梅2号、Jefferson、魔王谷、湘资3150和天津野生稻6份广谱抗瘟资源。2.选取Amber、Jefferson、谷梅2号叁份抗源材料与Pi9基因的供体水稻品系75-1-127杂交获得F2遗传群体,利用稻瘟病菌生理小种318-2接种,观察该群体的抗感分离情况从而判断候选抗源材料的主效抗性基因与Pi9的等位性关系。结果表明谷梅2号和Jefferson含有与Pi9等位或紧密连锁的抗瘟基因,而Amber的抗瘟基因与Pi9不等位。3.将谷梅2号、Jefferson两份抗源材料与感病亲本CO39构建F2遗传群体,使用稻瘟病菌生理小种318-2接种,群体大小分别为102株和127株,抗感单株分离比均为3：1,表明两份材料对318-2小种的抗性由一对显性基因控制。利用分布在水稻第6号染色体的SSR标记对抗感群体进行基因型分析,筛选到与谷梅2号抗病基因共分离的4个SSR标记,与Jefferson抗病基因共分离的7个SSR标记,进而在分子水平证实了Jefferson、谷梅2号中对318-2的主效抗性基因与Pi9基因的等位性关系。其中Jefferson抗性与分子标记RM7311、RM7178、RM6836、AP4791、AP5659-5、AP5695-1、AP5413共分离；谷梅2号的抗性与AP4791、AP5930、AP5659-5、AP4007共分离。4.利用已克隆的广谱抗瘟基因Pi2、Pi9、Piz-t的序列信息设计引物,通过RT-PCR方法在Jefferson、谷梅2号中扩增Pi9的同源cDNA序列,均获得了约3.1kb的片段。测序结果显示二者与已克隆的叁个基因具有较高的同源性,差别主要集中在LRR结构域中,NBS结构域相对更为保守。谷梅2号的序列与Pi9相比共有46个氨基酸差异,其中在NBS结构域有6个氨基酸差别,在LRR结构域有31个氨基酸的差异；Jefferson的序列与Pi9相比共有18个氨基酸差别,且全在LRR结构域中。
张海英[6]2003年在《mRNA差异显示分离水稻抗稻瘟病基因的相关cDNA片段》文中研究说明稻瘟病是由稻瘟病病菌(Magnaporthe grisea)引起的水稻叁大病害之一，广泛分布于世界各大稻区，严重影响水稻产量。培育抗瘟性品种一直被认为是防控稻瘟病的最有效的方法。但是，由于稻瘟病菌种类多且变异快，抗病品种的抗性常常因为病菌的变异适应而很快丧失，因此要通过常规的育种方法培育广谱、长效抗病品种是很困难的。通过遗传工程和分子生物学技术克隆植物抗病基因，深入了解病原和寄主互作机制以及分析水稻抗病防卫反应时的基因表达特点对于水稻抗瘟性改良具有重要的意义。近年来在水稻抗稻瘟病基因的定位和克隆方面已进行了广泛的研究，在不同的供体中已发现或定位了20多个抗稻瘟病的主效基因和至少10个QTL座位，其中Pib和Pi-ta这两个基因已通过图位克隆的方法克隆，然而对水稻抗病品种的抗病反应机理及其基因表达特点的研究却并不多。 本实验以我国优良的稻瘟病抗性品种地谷为研究材料，利用mRNA差异显示技术来研究地谷在接种稻瘟病菌前后基因表达的差异，寻找并分离与水稻抗瘟性相关的cDNA片段，以期通过对这些差异片段的分析来进一步阐述水稻抗瘟性分子机制以及病原物所激发的与防卫反应有关的信号转导过程，同时本研究也对mRNA差异显示技术用于研究植物抗病基因表达进行了有益的探讨。 以四川稻区稻瘟病菌强优势小种ZB13接种水稻叶片，分不同时段进行取材，分析水稻叶片受稻瘟病菌诱导后基因的表达差异，获得了87个差异片段。对这些差异片段进行了回收、重扩增与克隆，并对部分差异片段进行了杂交鉴定，对其中6个片段(随机编号为SSR-8，SSR-10，SSR-11，Z4，Z5，27)进行了克隆测序并用BLAST程序对测序结果进行了同源性比较分析，其主要结果如下： 1、差异表达基因片段SSR-8在核苷酸水平上与水稻第4号染色体BAC克隆H0302E05和oj991113 30均高度同源(99％)，推测该cDNA片段位于水稻第四号染色体。BLASTX比较结果表明SSR-8与水稻中一个推测的苹果酸合成酶(登录号：CAD79703)具有78％的同源性。而苹果酸合成酶是糖代谢的支路—乙醛酸途径中的两种关键的酶(苹果酸合成酶和异柠檬酸裂合成酶)之一，它只存在于乙醛酸循环体中。近来的研究表明在动植物与病原菌相互作用中乙醛酸循环起着非常重要的作用(Michael,2002)。 2、SSR-10在核苷酸水平上与水稻基因组第1号染色体的PAC克隆AP003291.3和AP003294.2均高度同源(99％)，推测该cDNA片段位于水稻第一号染色体。BLASTX比较结果未发现与其有显着同源性的氨基酸序列，推测为新的基因片段。 3、SSR-11在核苷酸水平上既与水稻第4号染色体BAC克隆OSJNBa0085I10高度同源 (97%)同时又与水稻第1号染色体的队C克隆P0468B07和AP003247.4高度同源 (92%);推测在水稻的第1和第4号染色体上均存在该序列;BLASTX比较结果未发现 与其显着同源的氨基酸序列，推测其为新的基因片段。4、24在核昔酸水平上与日本晴第11号染色体的一个BAC OSJNBa0044D巧高度同源 (95%);与釉稻中的RPRlh(登录号:BAA75813)基因及粳稻中的类似基因即Rl (登录号:BAA758 12)的mRNA均具有89%的同源;推测该序列在日本晴，粕稻和 与粳稻中都存在。BLASTX比较发现在BAC 05则Ba0044D15中位于z4上游的一个较 大的ORF与水稻中一系列具有NBS一LRR结构的抗病基因的氨基酸序列均高度同源， 同时与水稻中的RPRI基因具有75%的同源性。RPRI基因于1999年 (Koji，s akamoto，Yuichi Tada.etal)首次报道，在水稻中RPRI基因受系统性获得性抗性 (SAR)的化学诱导剂和接种稻瘟病菌的正调控，并且RPRI也具有植物抗病基因所特 有的NBS一LRR的结构，它是在疾病诱导的系统性获得抗性表达的过程中产生的，它与 防卫反应的信号转导相关。由此推测z4也具有NBS一LRR结构并属于R基因家族，该 基因的表达可能与地谷抗病防卫反应的信号转导过程相关。5、25在核昔酸水平上与孟山都公司测序的水稻第12号染色体上的一个BAC克隆 AL73 1 891，100%同源，推测该片段位于水稻第12号染色体上。BLASTX中比较结果 未发现与其同源的氨基酸序列，推测其为新的基因片段。6、27在核普酸水平上与粳稻基因组的第6号染色体上的BAC克隆OSJNBa0004I20和 AP000616.1，均高度同源;推测该cDNA片段位于水稻第6号染色体上。BLASTX中 比较结果表明与水稻第6号染色体上一个推测的硫氧还蛋白的同源性为72%(登录号: ACoo6248)。本实验研究首次发现硫氧环蛋白基因的表达也受稻瘟病菌的诱导，而其 诱导表达与地谷抗稻瘟病反应间的关系还需要进一步的研究，即研究硫氧还蛋白本身 ，是否与地谷抗稻瘟病直接相关，还是硫氧还蛋白基因上游的抗病基因的诱导表达影响 了硫氧还蛋白基因的表达。近来研究也发现抗病基因与硫氧环蛋白基因的连锁关系是 普遍存在的，王石平等(王石平等，1998.)就是根据蛋白激酶和硫氧环蛋白氨基酸序 列中的高保守区域合成简并引物，并用聚合酶链反应从水稻(口秘sativa L.)DNA中 扩增同源片段，来寻找水稻抗病基因DNA片段的。
鲍永美[7]2007年在《水稻SNARE蛋白基因的克隆与功能分析》文中认为水稻是世界上最重要的粮食作物。在一些水稻产区,病原菌、高盐、干旱等逆境胁迫严重影响了水稻的生长和生产,因此阐明植物耐受逆境胁迫的分子机制和改良植物的抗逆性已经成为当前农业研究的主要目标之一。本论文的主要研究内容分为两个方面:一、从水稻中分离了4个与植物逆境胁迫信号传导途径相关的SNARE蛋白家族基因,并对它们的功能进行了初步研究;二、采用蛋白质组学方法分析了水稻抗稻瘟病质膜相关蛋白的诱导表达情况。真核生物细胞囊泡运输过程中的膜融合主要是由SNARE蛋白介导的,SNARE蛋白的结构高度保守。研究发现,植物中的SNARE蛋白促进植物细胞板形成,能与离子通道蛋白相互作用,有利于植物的正常生长发育,能提高植物的抗病性及参与植物的向重力性作用。本研究从水稻中克隆了水稻中的SNAP25类蛋白基因OsSNAP32,并对其功能进行初步研究。OsSNAP32基因编码蛋白含有283个氨基酸,在N端和C端分别存在一个Qb-SNARE结构域和一个Qc-SNARE结构域。洋葱表皮瞬时表达亚细胞定位结果表明,OsSNAP32基因的编码蛋白定位于细胞质膜上。半定量RT-PCR的结果表明,该基因的表达受到H_2O_2、PEG6000、SA、ABA、冷、热、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicator)这8种胁迫处理的诱导。对T_1代转基因植株进行稻瘟病菌接种处理,发现转正义OsSNAP32基因植株的抗瘟性与对照相比明显增强,转反义OsSNAP32基因植株的抗瘟性与对照相比无明显变化。综上研究结果表明OsSNAP32基因在水稻各种胁迫应答反应中起着重要的调节作用。本研究还克隆了Qb-SNARE蛋白家族成员基因OsNPSN11～13,这3个基因的序列同源性为80%-85%,具有相似的基因组结构,均含有10个外显子和9个内含子,分别定位于水稻第6、3和7条染色体上,多重序列比对结果表明这3个基因与拟南芥的AtNPSN11～13基因的同源性较高,所编码的蛋白均含有一个Qb-SANRE结构域和一个跨膜结构域。洋葱表皮瞬时表达亚细胞定位结果表明,这3个基因均定位于细胞质膜上。将OsNPSN11基因构建到表达载体pET-30a中进行原核表达,并进一步得到纯化蛋白制备多克隆抗体,用该抗体与水稻细胞的不同提取组分进行Western blot,结果表明该基因的编码蛋白定位于质膜上。为了研究水稻中OsNPSN11～13这3个基因的功能,我们用半定量RT-PCR的方法分析这3个基因在H_2O_2、NaCl和PEG6000处理下的表达情况,发现OsNPSN11～12基因在用H_2O_2进行处理时表达量均有所增加,而在用NaCl和PEG6000处理时,OsNPSN11-12基因的表达量有所下降,OsNPSN13基因的表达在各种处理情况下变化并不明显。进一步研究基因的功能,将这3个基因转入酿酒酵母细胞中,对转基因酵母细胞和对照酵母细胞进行H_2O_2、NaCl和甘露醇处理,结果发现,无论是在固体培养基上还是液体培养基上,在用H_2O_2进行处理时,转基因酵母细胞比对照酵母细胞长势好,而在用NaCl和甘露醇进行处理时,转基因酵母细胞比对照酵母细胞长势差表现为更加敏感。为进一步研究基因在植物中的功能,将基因转入烟草中,T_1代转基因幼苗在1/2MS培养基上进行H_2O_2、NaCl和甘露醇处理,结果发现H_2O_2处理后,转基因烟草比未转基因对照烟草长势好,用NaCl和甘露醇处理后,转基因烟草比未转基因对照烟草长势差。由上可知,OsNPSN11～13可能参与酵母和烟草的抗H_2O_2胁迫过程,而在NaCl和甘露醇胁迫过程中可能不起作用。进一步分析OsNPSN11～13这3个基因在抵御生物胁迫过程中的功能。通过半定量RT-PCR的方法分析了水稻植株在接种白叶枯病菌和稻瘟病菌处理后的表达情况发现,在白叶枯病菌接种处理后,OsNPSN11～12基因的表达受到诱导,在稻瘟病菌接种处理后,抗病品种黑壳子粳中OsNPSN11～12基因的表达受到诱导,感病品种苏御糯中OsNPSN11～12基因的表达在处理前后没有明显变化,OsNPSN13基因的表达在两种病原菌处理前后均没有明显变化。鉴于OsNPSN11～12基因在抗稻瘟病品种和感病品种中的表达差异,我们将OsNPSN11基因转化感病品种苏御糯受体,对T_0代转基因植株进行PCR、RT-PCR和Southern blot检测得到阳性植株后,对T_1代转基因植株进行苗期抗瘟性鉴定,结果发现转正义OsNPSN11基因植株的抗性明显增强。以上实验结果表明,OsNPSN11基因在水稻植株抗病过程中起着一定的作用,具体的抗病机制有待进一步的实验证明。植物质膜蛋白在植物抵御病原物侵染早期信号传导途径中起着重要的作用。本文采取改进的质膜蛋白提取、纯化和双向电泳方法,分析了太湖流域地方抗病品种黑壳子粳在稻瘟病菌菌株北1接种处理前后质膜相关蛋白的诱导表达情况。比较分析了未处理和接种处理8h和24h后质膜蛋白的双向电泳图谱,发现有23个蛋白点受到了不同程度地诱导,并对这23个蛋白点进行了质谱鉴定,其中7个蛋白点进行二级串联质谱(MS/MS)结果表明这23个诱导表达蛋白可分为四类:1)与植物生长代谢相关的酶类,如与植物糖酵解相关的丙糖磷酸异构酶(TIM)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD),与脂类代谢相关的烯酰CoA水合酶(ECH),与能量代谢相关的苹果酸脱氢酶(MDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、1,4苯醌还原酶(QR)和苯醌氧化还原酶(QR2),与氨基酸代谢相关的甲酰四氢叶酸合成酶(FTHFS);2)与植物物质合成分解调节有关的蛋白,如调控质膜多肽(DREPP)、可逆糖基化多肽(RGP)、Remorin蛋白和20S蛋白酶体;3)与抗氧化系统相关的蛋白,如脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、超氧化物岐化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX);4)与信号传导有关的蛋白,如膜连蛋白(Annexin)和谷胱甘肽转移酶(GST)。本研究发现了一些新的抗病防卫反应早期响应质膜相关蛋白,为了解水稻抗稻瘟病防卫反应机理提供了新的线索。
杨明挚[8]2004年在《云南野生稻抗病基因克隆、结构功能分析及其分子进化研究》文中提出云南野生稻是我省乃至全世界珍贵的野生植物资源,是改良栽培稻,可供人类长期持续发掘利用的重要基因宝库。本论文立足云南野生稻及其他野生稻资源,研究野生稻中功能已知或未知的植物抗病基因。从云南不同野生稻及其他来源的野生稻中分离克隆了一些抗病基因、抗病相关基因或抗病相关基因片段。对所获得的基因或基因片段的结构、功能及其在野生稻或抗病基因本身的分子进化等方面展开了一系列相对系统的研究。先后从云南元江普通野生稻中克隆了一个完整的抗稻瘟病Pi-ta 基因和一个Pi-b 基因,并从不同种或类型的云南野生稻以及其他野生稻中克隆了抗稻瘟病Pi-ta、Pi-b 以及抗白叶枯病Xa21、Xa1 基因的部分序列,从云南不同野生稻中获得了大量的R-片段,通过分析这些R-片段,克隆了一个新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病侯选基因。应用相关软件,对所克隆的的抗病基因或抗病侯选基因推导产物的二级结构与功能间的关系进行了探讨。依据所克隆的基因序列间的同源性分析,初步建立了一个云南野生稻及其他野生稻与栽培稻间的分子进化模型。同时构建了叁个云南野生稻叶片的cDNA文库,其中一个云南元江普通野生稻自然状态下营养生长期叶片的cDNA 文库及两个由稻瘟病和白叶枯病病菌诱导下的疣粒野生稻和药用野生稻的cDNA 文库。在cDNA 文库构建过程中,建立了一种高效且简便快速的检测cDNA 文库中插入片段大小范围的方法。为进一步从云南野生稻中发掘有用的抗病基因奠定了良好基础。第一部分:云南野生稻中抗病基因同源片段的克隆及研究从野生稻中大规模的分离克隆抗病基因相关片段(R-片段)尚未见报道。利用简并引物我们从云南不同野生稻中获得了60 多个可以编码完整氨基酸序列的R-片段,其中30 多个为NBS-LRR 类片段,15 个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)片段。此外还从小粒野生稻(Oryza minuta)、江西东乡普通野生稻(Oryza rufipogon)及长雄蕊野生稻(Oryza longistaminata)中获得了20 多个NBS-LRR类R-片段。并有选择性的在基因库中登录了20 个R-片段序列。对这些片段的序列分析发现,大多数R 片段与基因库中水稻及其他植物中获得的R 片段或基因
程在全[9]2006年在《云南野生稻遗传特性及其优良基因克隆的研究》文中研究指明云南野生稻是珍贵的野生植物资源，蕴藏着十分丰富的优良种质基因，是改良栽培稻，可供人类长期持续发掘利用的重要基因宝库。野生稻过去在云南分布广，生态类型多，但是，随着人类活动其适生环境遭到破坏，而处于濒危状态。因此，开展对云南野生稻现存资源的调查和保存保护研究，及主要遗传特性和有关基因(片段)的分离研究，有助于促进对野生稻资源的保存、研究和利用，具有重要的理论和实际意义。 1 云南野生稻资源最新分布状况调查和营养成分研究 对云南野生稻现存分布情况进行了较为系统的调查，新发现了1个普通野生稻自然分布居群，2个药用野生稻自然分布居群和5个疣粒野生稻自然分布居群。通过RAPD和ISSR分子标记分析，发现居群间的遗传距离大于居群内不同点或植株间的遗传距离。揭示了云南普通野生稻不同类型材料与具A’A’基因组的国内其它地区普通野生稻代表材料的遗传距离。 首次对云南野生稻稻米总蛋白质含量、17种氨基酸含量和10种无机元素(其中Ca、Fe、Zn为人体健康有益元素)的比较分析发现，野生稻稻米的蛋白质含量最高达19.3％，一般为13％～16％，比栽培籼稻和粳稻的稻米蛋白质含量高出50％～80％。在人体必需氨基酸和有益无机元素中，野生稻多数种类和类型的含量都显着高于籼稻和粳稻。发现野生稻稻米的高含量蛋白质、人体必需氨基酸以及Zn和Fe，都受遗传控制为主，可能遗传力高，但是Ca、Mn等元素可能遗传力小。 上述结果表明，虽然云南野生稻自然资源消亡很多，但是现存资源的遗传
刘叶平[10]2012年在《水稻抗稻瘟病资源的抗性表现及PiK位点分析》文中进行了进一步梳理水稻是人类最重要的粮食作物,而稻瘟病是一种毁灭性病害,严重危害着稻米的安全生产。选育和种植抗病品种是控制稻瘟病的一种经济有效且绿色环保的措施。抗稻瘟病种质资源的发掘、研究与利用是水稻抗稻瘟病育种的重要基础。本研究对经过多年田间和室内的抗性筛选获得的一批优质抗源,并且这些抗源的的农艺性状各异,具有一定的利用价值；通过本实验室多年多点的对含PiK的水稻近等基因系材料进行病圃鉴定表明,Pik(?)位点基因在当年的各个病圃中都表现出一定的抗性,特别是Pikh、Pikm表现出稳定的和较高的抗病性,于2011年在四川蒲江、雅安、营山进行重复病圃鉴定表明PiKh、PiKm仍有较高抗性,多年的监测表明PiK位点基因在四川的抗性仍然存在,还具有一定的利用价值；通过DNA测序、蛋白质序列比对,分析鉴定了抗源中PiK位点基因的分布情况,以便合理的利用这些种质资源,为水稻品种布局提供依据。1.2011年通过监测含PiK5个等位基因(PiK、PiKs、PtKh、PiKm、PiKp)的单基因近等基因系材料在四川蒲江、宝兴和营山的田间抗性情况,发现抗性表现如下：在蒲江病圃中,5个材料均表现为感病,其中PfKm(IR25)叶片发病率最低,达6.67%,而在宝兴和营山病圃中IR25(PiKm)没有发病；IR4(PiKs)在叁个病圃中都表现为感病,特别在浦江病圃中叶片发病率达73.66%。；从整个结果来看,ⅠR8(PiKh)、IR25(PiKm)的叶片发病率、病情指数在叁个病圃中都相对较低,因此,PiK位点的PiKh、PiKm表现抗病或发病较轻,含这些抗稻瘟病基因的品种和抗源材料还具有一定的改良和利用价值。2.2009-2010年对四川农科院植保所、水稻所、川农大常年筛选、保存的多份抗稻瘟病抗源在蒲江病圃进行鉴定和农艺性状观察,淘汰感病材料,归并农艺性状相同材料,最后获得的32份抗源材料,2010年秋季再进行苗期接种鉴定,鉴定结果表明,32份抗源材料绝大部分都表现出高抗和广谱抗性,主要农艺性状也存在较大差异,可以根据不同的育种目标加以利用,有一定的研究、利用和改造价值。3.利用PiK位点基因引物进行扩增时发现,32份抗源有16个品种有扩增产物,全长约12.1kb,扩增得到的序列全长和参考碱基序列的相似度都在98%以上,可以推断出PiK位点基因在这些抗源材料中确实存在。再根据含PiK位点基因的水稻近等基因系材料在四川的发病情况推断,这些含抗源材料所含基因可能有PiKh或PiKm。利用生物学软件MEGA5.0对所获有的氨基酸序列进行同源树构建,发现抗1、抗3的氨基酸序列和参考序列(PiKm)的相似度达99.9%,而抗12、抗14、抗24、抗32则高达100%,据此可以推测出抗1、抗3、抗12、抗14、抗24、抗32可能就含有PiKm基因。这些抗源材料所表现的抗性除PiK位点基因外是否还有其他基因在起作用,还需进一步研究。4.通过全长序列的比对发现,除抗24外,其余所有序列都存在差异,核苷酸多态性相对集中在6000-7000bp处。通过比对、聚类分析上看,PiK位点基因编码的氨基酸多态性主要与PiK-1基因有关,PiK-2的氨基酸序列高度保守。5.丽江新团黑谷(LTH)是一种高感稻瘟病材料,根据PiK位点基因序列(PiKh,AB462256)作为参考序列设计的引物也可以在LTH中扩增出基因全长,且获得的序列全长与参考序列的相似度达98.57%,根据扩增和测序获得的.序列翻译出的氨基酸序列LTH-1和LTH-2,和参考序列氨基酸PiKh-1和PtKm-2的相似度分别达94.68%和100%,但LTH有此位点的基因却没有抗性存在。通过与已知的PiK位点基因编码的氨基酸序列及抗源的测序后翻译而成的氨基酸序列比对发现,LTH-1存在四个位点的氨基酸改变,分别是第76、191、221、288处的氨基酸有变化。LTH不存在抗性的原因可能是这四个氨基酸的差异。
参考文献：
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[5]. 水稻品种Jefferson和谷梅2号广谱抗稻瘟病基因的发掘与定位[D]. 江南. 湖南农业大学. 2010
[6]. mRNA差异显示分离水稻抗稻瘟病基因的相关cDNA片段[D]. 张海英. 四川农业大学. 2003
[7]. 水稻SNARE蛋白基因的克隆与功能分析[D]. 鲍永美. 南京农业大学. 2007
[8]. 云南野生稻抗病基因克隆、结构功能分析及其分子进化研究[D]. 杨明挚. 云南大学. 2004
[9]. 云南野生稻遗传特性及其优良基因克隆的研究[D]. 程在全. 四川大学. 2006
[10]. 水稻抗稻瘟病资源的抗性表现及PiK位点分析[D]. 刘叶平. 四川农业大学. 2012