关键词：秀珍菇；诱变；育种；RAPD；食用菌
引言：秀珍菇，学名为肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius），隶属担子菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属。秀珍菇不仅营养丰富，而且味道鲜美，蛋白质含量比双孢蘑菇、香菇、草菇更高，质地细嫩，纤维含量少，口感脆嫩。秀珍菇由中国台湾命名、开发并商业栽培，目前已在福建、浙江及上海等地广泛栽培[1]。目前秀珍菇主栽品种仍是多年前从台湾引进的秀珍菇系列品种，有的品种经多年组织扩繁后出现退化和老化现象[2]。前期，福建农林大学国家菌草工程技术研究中心课题组同福建省农科院专家合作开展了60Co辐射诱变选育秀珍菇新品种的研究，筛选到部分疑似突变菌株。与传统的形态学相比，分子标记具有遗传稳定、不受环境因素影响等特点，常用的DNA标记技术有RAPD、AFLP、SSR、SNP 等多种。其中，RAPD 是发展历史长，应用最早最为简易方便的DNA 标记技术。本研究利用RAPD技术对新菌株进行了分子生物学鉴定。
1 材料与方法
1.1菌株
台秀57（对照菌株）、秀迪1号(福建省认定的秀珍菇新品种)和突变菌株F69、F43、F5669。
1.2菌丝培养
PDA斜面培养基：200 g马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂、1000 ml水，pH自然；
PDA液体培养基：200 g马铃薯、20 g葡萄糖、1000ml水，pH自然。
将４℃保藏的菌种转接到PDA斜面固体培养基上，于25 ℃恒温培养箱下静置培养10 d，待菌落长满试管后，用接种耙耙碎菌块，接入250 ml三角瓶液体培养基中，每个菌株接种3瓶，120 r/min摇床上25 ℃培养20 d，用纱布过滤收集菌丝，用蒸馏水冲洗，再用滤纸吸干后进行DNA提取。
1.3基因组DNA的提取
采用CTAB法提取DNA[3]。取1克菌丝放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管，加65℃预热的抽提液 [2%（m/v）CTAB，100 m mol/L Tris-HCl，pH8.0，20 mmol/L EDTA，pH8.0，1.4mol/L NaCl] 2.5ml中，加巯基乙醇50μl，上下震荡,使蛋白质变性沉淀；65℃水浴1 h，隔20min振荡1次，加入2.5 ml的氯仿:异戊醇(24:1)混匀，除去蛋白质；8000 r/min,4℃离心10 min，取上清到7 ml管；加1/5体积65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混匀；10000 r/min，4℃离心10min，取上清，加入2.5 ml的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65 ℃水浴1 h至沉淀可见；12000 r/min，4℃离心10 min后，小心去除上清液；用0.5 ml无菌水溶解沉淀；加入0.25 ml饱和酚和0.25 ml氯仿:异戊醇（24:1），混匀；12000 r/min，4℃离心10 min，取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃冰箱放置30 min；12000r/min，4 ℃离心10 min；弃上清，70％乙醇洗涤沉淀2次，自然风干，用50μl无菌水溶解，-20 ℃保存备用。
1.4RAPD引物
经过预试验，从20个引物中筛选出条带清晰、差异明显的5个RAPD引物，引物序列见表1，本文所用的引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1。
表1 本文所用RAPD引物
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1.5PCR扩增与检测
ＲAPD 体系总体积为25 μL，10×PCＲBuffer 2.5μL，10mM dNTPs 1μL，25 mM Mg2+ 1. 5μL，10mM 引物1. 5 μL，模板DNA 1 μL，0. 4 U DNA 聚合酶，最后用双蒸水补至25 μL。
RAPD-PCR扩增条件： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，34 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min, 35个循环，最后72 ℃延伸7 min。
电泳检测：扩增产物10μl经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照保存。
2结果与分析
突变菌株F69的鉴定结果见图1。由图1可知，经过RAPD引物S1200扩增，与秀迪一号和台秀57相比，在F96在500 bp - 750 bp缺失一个条带，表明F96与原始菌株台秀57与秀迪1号在DNA水平存在差异；经S36引物扩增，与秀迪1号相比，F69在1000 bp - 2000 bp存在差异。诱变新菌株F43的RAPD扩增结果见图2，经过S78引物扩增，与原始出发菌株相比，F43在500 bp -750 bp 1个扩增条带缺失，与秀迪1号相比，F43在500 bp -750 bp 2个扩增条带缺失；经过S1208引物扩增，与秀迪1号相比，F43多个条带缺失。诱变菌株5669的RAPD扩增结果见图3，经过引物S36扩增，与台秀57和秀迪1号相比，3个扩增条带均缺失，经过引物S66扩增，F5669无条带扩增，而台秀57和秀迪1号在1000 bp -2000 bp有一个扩增条带。
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3结论
目前，食药用菌产业是我国第五大种植产业，仅次于粮食、油料、水果和蔬菜，在农业发展中有着重要的地位与作用。选育优良的食药用菌品种，是提高食药用菌产量、扩大食药用菌产业规模的关键因素。60Co辐射诱变可以获得较高的突变率和较宽的突变谱，已经用于多种食用菌新品种的选育。对于诱变新菌株的筛选，是获得优良菌株最重要环节之一。
基于DNA 分子标记的品种鉴定的方法有多种，且各有优势。RAPD 技术由于具有操作简单、分析速度快、成本较低、安全等优点，目前广泛应用于食用菌菌株的鉴定。如忻雅等（2008）利用RAPD标记和EST-SS R 标记对10 个不同来源的秀珍菇菌株进行了聚类分析。但是RAPD 技术仍然存在假阳性、重复性和稳定性不高等问题，可以采取与其他分子标记结合，或者多个RAPD标记同时验证。本研究利用RAPD 对秀珍菇诱变菌株进行了分析，不同引物的扩增效果有明显差异，出现了多态性条带，可以从核酸水平上证实60Co 诱变作用，F43、F69、F5669区别于台秀57和秀迪1号的新菌株。
参考文献：
[1] 林原, 陈剑, 赵光辉, 江晓寒. 7个秀珍菇菌株栽培特性及ISSR遗传分析[J]. 福建农业学报, 2015, 30(4): 339 - 343.
[2] 吴汉琼, 陈躬国, 赵光辉, 方洪枫. 秀珍菇菌株的拮抗与品比筛选[J]. 安徽农业科学, 2019, 47(14): 42 - 43.
[3] 朱坚，等. 食用菌品种特性与栽培[M]. 福州: 福建科技出版社, 2011.
[4] 忻雅, 阮松林, 王世恒, 等. 基于RAPD和EST-SSR标记的秀珍菇菌株聚类分析[J].食用菌学报, 2008, 15(4): 20 - 25.
论文作者:刘朋虎
论文发表刊物:《科学与技术》2019年第20期
论文发表时间:2020/4/28
标签：菌株论文; 引物论文; 条带论文; 秀珍论文; 标记论文; 品种论文; 福建论文; 《科学与技术》2019年第20期论文;