刘雪燕[1]2000年在《PCR法检测犬细小病毒的研究》文中研究表明犬细小病毒，（简称CPV）能引起犬的出血性坏死性肠炎及心肌炎。由于它的发病率和死亡率很高，并且康复犬也可能长期带毒，因此对实验犬，军犬，警犬危害极大。近年来已引起国内外有关学者的高度重视。目前国内对细小病毒的检测方法主要有病毒分离、血凝实验和电镜检查等等。电镜检查和病毒分离方法虽然特异性和敏感性较好，但是作为常规检测所耗时间太长，并且成本较高。血凝实验法又缺乏稳定性。本文以细胞培养物，病犬粪便样品为研究对象，进行PCR法检测犬细小病毒的研究。主要内容包括：一、培养猫肾F_(81)传代细胞，制作细胞爬片，感染犬细小病毒，分时段 收集细胞，固定后作为实验材料。二、苯酚法从染毒细胞中抽提DNA，用合成的两对引物进行PCR扩增， 通过优化PCR反应的各种条件，用两对引物都扩增出目的片段， 分别为1051bp和226bp，经过多次实验，结果稳定，所设阴性对照 无扩增带。三、经过对已知阳性粪便样品的实验，发现第二对引物，即扩增产物为 226bp的引物敏感性和稳定性更好。并且在已知阳性样品中，进行 PCR法与HA法的比较，实验结果经统计学软件SSPS 10.0 McNemar Test分析得出结论两种方法检验结果有显著性差异 （P＜0.05），PCR检出率更高，更敏感。四、在犬粪便样品中进行PCR检测方法的研究。我们又用第二对引物l 对从某宠物医院得到的临床初步诊断为犬细小病毒感染的20粪便lD 样品进行了检测，其中，阳性结果门个，阴性结果 7个。在 PCR Dl 扩增的同时，我们对样品进行血凝对照实验，结果 PCR法检测fill 阳性的 13个样品中 HA法只有 8个阳性，其余为阴性。我们将 PCRl 法检测为阳性而HA法检测为阴性的5个样品，经过处理后，感染lDfffi肾F。；传代细胞、其细胞病变特征与标准毒株感染细胞的病变特征DD 相同。Dl 五、在液相PCR法检测犬细小基础上，用接种病毒细胞爬片进行原位lIPCR检测方法的研究。实验采用直接法原位PCR将生物素标记在 lD 引物上，扩增产物用抗生物素碱性磷酸酶系统进行检测，成功地建Dl 立了直接原位 PCR检测犬细小病毒的方法。在接毒细胞中检测到 lD 大量阳性物质，阳性物质有些在细胞质中，有些在细胞核中，阴性DD 对照未曾检测到阳性物质。在接种病毒不同时期的细胞片上同时进DD 行原仿PCR和普通免疫组化对照检测实验。结果表明，用原位PCR Dl 方法在接毒 12小时到 72小时的细胞片上均检测到大量阳性细胞；ll 用普通免疫组化的方法，在接毒12小时的细胞片上未检测到阳性lD 细胞，在接毒24小时的细胞片上只见零星的阳性细胞。在接毒48 DD 小时的细胞片上，用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进DD 行统计比较，差异显著o刃刀01人结果表明：原位P＊R方法既具l 有 PCR方法的敏感性，又具有组织定位的优越性，是值得推厂的 lD 研究病毒性感染疾病机理的一种先进的实验技术。D
戈锐[2]2007年在《犬细小病毒四川株的分离鉴定与VP2结构蛋白基因变异性研究》文中研究指明用F81细胞从四川地区送检的5份肠炎犬病料中分离出2株细小病毒，经形态学、理化学、生物学和分子病毒学等鉴定，结果这2株病毒均能在F81细胞上生长，产生细胞肿胀、变圆、破碎、脱落等细胞病变；病毒粒子呈立体对称，直径为20-24nm，无囊膜，抗氯仿，耐酸，耐热，能被5-IUDR抑制，可凝集猪、马、猫的红细胞，不能凝集人、鸡、豚鼠、兔的红细胞，HA试验能被抗CPV的特异性抗体所抑制，用犬细小病毒(CPV)特异性引物对2株病毒进行PCR扩增，能够扩增出CPV特异性片段，并且所分离病毒能够感染犬。鉴定结果证明这2株病毒均为CPV，CPV在我国四川地区犬群中仍广泛存在。对所分离的2株CPV进行基因型分析。用PCR方法扩增了2株犬细小病毒(CPV)VP2全基因和部份基因片段，通过序列测定和DNAStar软件分析，结果我国四川地区的CPV分离株也存在基因变异现象，发现在CPV-2a、CPV-2b基础上进一步进化产生的新的变异株。但其确切的生物学意义尚不清楚。我国四川地区的CPV与所报道国外参考毒株的核酸的同源性超过96％，没有形成明显的中国CPV分支，进化方式与文献报道的进化方式一致。该研究是首次从分子水平上，针对我国西部地区犬细小病毒的变异情况进行调查，初步了解了我国四川地区CPV的进化及其流行状况，为有效的防制CPV提供了实验数据。通过对四川地区CPV分离株的变异研究发现，CPV进化和变异的趋势与国外基本一致。通过基因进化树的分析表明，国内外的CPV起源于共同的祖先。
刘雪燕, 黄韧, 刘忠华, 程树军[3]2001年在《猫肾F_(81)传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法》文中研究指明目的 建立在猫肾F81 细胞中犬细小病毒原位PCR的检测方法。方法 在猫肾F81 细胞上感染犬细小病毒 ,设计特异性引物 ,用直接原位PCR法在染毒 12h ,2 4h ,48h细胞片上检测出犬细小病毒 ,并与常规免疫组化的方法进行了比较。结果 在染毒 48h的细胞片上 ,用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进行统计比较 ,差异极显著 (P <0 .0 0 1) ,用原位PCR法所得出的阳性率高。结论 原位PCR法检测犬细小病毒具有敏感性高和组织定位的优点
刘刚[4]2008年在《犬瘟热病毒H基因的克隆表达与分子流行病学研究》文中研究说明犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的一种以犬为主的多种动物共患急性传染病,对动物的危害很大。CDV基因组编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、大蛋白(L)、融合蛋白(F)和血凝蛋白(H)6个蛋白,其中H蛋白是CDV感染细胞过程中侵袭宿主所必需的,也是产生中和抗体的主要抗原,同时也是变异最大的结构蛋白;分析和研究H蛋白的分子进化和变异情况能反映CDV的流行和进化趋势。虽然之前开发的犬瘟热弱毒疫苗已被广泛使用并取得很好的保护效果,但是近来犬瘟热又在全世界流行,疫苗免疫失败的现象越来越多。出现这种现象的原因一方面可能是在免疫压力下,CDV抗原表位可能发生漂移,尤其是主要结构蛋白H蛋白极易发生变异,从而使疫苗失去效用;另一方面也可能由于免疫失败或者动物机体的抗体水平下降而导致机体在受到CDV感染时不能产生有效的保护。本研究旨在探明杭州地区CDV的流行特征和变异趋势,为疫苗的选择或开发奠定基础;同时,表达H蛋白用于动物机体的免疫状况的监测,为犬瘟热的防治提供参考。为此,2007年1月至2008年4月间我们收集了44份临床疑似犬瘟热病料并进行PCR检测,克隆测序13株CDV H基因序列,用于遗传进化分析;同时截短表达H蛋白,并进行免疫印迹试验以确证该重组蛋白的反应原性。1.根据CDV N基因的保守区域设计引物,在对RT-PCR法和反转录-套式PCR扩增的N基因片段克隆测序的基础上,比较了两种检测方法的灵敏性和特异性。结果显示,PCR扩增片段和测序结果与预期一致,特异性分析表明两种检测方法对犬细小病毒阳性病料无扩增条带,具有很高的特异性,RT-PCR法和反转录-套式PCR法的阳性检出率分别为11.36%和63.64%,反转录-套式PCR法比RT-PCR法更加敏感。2.为了进一步探明杭州地区CDV的流行特征和变异趋势,克隆测序了13份CDV阳性病料的H基因。分子遗传进化分析显示,所有毒株可分为7个大的分支,且各分支间具有一定的地域相关性。亚洲国家主要存在CDVⅠ型和Ⅴ型,但在中国未发现Ⅴ型毒株的存在;杭州毒株除一株属于Ⅶ型外,其余与中国大部分毒株同处于Ⅰ型,而只有少量中国毒株属于Ⅵ型和Ⅶ型。潜在的天冬酰胺糖基化位点分析发现不同毒株之间的数目差距较大,疫苗株含4～7个糖基化位点,野毒株为7～9个;杭州地区的毒株除HZ005为8个和HZ011为6个外,其余均为9个。进一步分析了H基因变异情况,发现H基因整体变异较大,但氨基酸同义置换的概率大于非同义置换的概率,表明H基因同义突变的趋势更加明显。3.利用MDCK细胞从临床犬瘟热病犬病料中分离CDV,结果表明第3、6、9和12代感染细胞均能检测到病毒特异性条带(病毒命名为HZ026),其原代病毒和第12代病毒的H基因测序分析显示在传代过程中H基因没有发生变异。进一步截短表达H基因的两个片段,Western blot鉴定表明,表达的蛋白对于CDV阳性血清具有较强的反应原性,可用于进一步的血清学研究。
张樑[5]2018年在《猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究》文中指出猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属病毒,是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,临床表现为初孕母猪不孕、流产、产木乃伊胎和死胎等现象。PPV在全球大部分地区呈地方性流行,在未接种疫苗或疫苗接种不当的猪群中可造成毁灭性的流产风暴。大量研究报道,PPV感染可引起胎儿或仔猪的多种组织脏器发生损伤进而引起胎儿死亡或产弱仔等,并以此解释PPV诱导繁殖障碍的原因,但是,关于PPV感染对妊娠母体的影响却鲜有报道。卵巢黄体是建立和维持妊娠的重要组织,主要通过黄体细胞合成孕酮以维持正常的妊娠。已有研究报道,PPV感染可导致母体黄体组织受损,进而引起不孕和流产等病理现象的发生,但其具体作用分子机制尚不清楚。本研究首先建立永生化黄体细胞系,为后续研究提供可靠的细胞模型。然后用PPV分别感染原代和永生化猪黄体细胞,检测PPV感染诱导黄体细胞凋亡和凋亡信号转导通路,明确PPV感染抑制黄体细胞孕酮产生及相应机制。最后,PPV感染初孕母猪,从体内水平进一步验证PPV感染诱导黄体细胞凋亡的信号转导通路和抑制孕酮产生的机制。旨在从体外和体内水平探讨PPV感染诱导猪黄体细胞凋亡和对孕酮产生的影响,并解析其相关分子作用机制。研究取得以下结果。1取妊娠30~50 d健康母猪的黄体组织,胶原酶消化法和密度梯度离心法对原代黄体细胞进行分离、纯化和培养。转染pCI-neo-hTERT质粒并用100μg/mL G418连续筛选获得单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行扩大培养和类固醇合成功能的检测,最终确定一株可连续传代50次且未发生衰老迹象并保存类固醇激素合成能力的细胞系,命名为hTERT-PLCs。RT-PCR和端粒酶检测结果显示,hTERT-PLCs中hTERT能够稳定表达且维持较高的端粒酶活性。核型分析结果显示,转染后30和50代的黄体细胞染色体均保持正常的二倍体结构形式。3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色结果显示,与原代猪黄体细胞一致,hTERT-PLCs两种染色结果均呈阳性。透射电子显微镜观察结果显示,与原代猪黄体细胞超微结构一致,hTERT-PLCs的细胞间存在间隙连接,且其细胞质中都含有大量的线粒体和滑面内质网。RT-PCR检测结果显示,hTERT-PLCs稳定表达参与孕酮合成和降解过程中关键蛋白和酶的基因(STAR、HSD3B1、CYP11A1和AKR1C1),以及参与调控黄体细胞类固醇激素合成的一些特征性受体的基因(LHCGR、PGR、PRLR、ESR1和ESR2)。促黄体素(Luteinizing hormone,LH)和PGF2α(Prostaglandin F2α)类似物处理原代和永生化黄体细胞,结果显示LH处理后两种细胞中P450scc蛋白表达未发生显著变化(p>0.05),而StAR和3β-HSD蛋白的表达显著增加(p＜0.05);同时,黄体细胞的孕酮产量均显著升高(p＜0.05);PGF2α类似物处理原代和永生化黄体细胞后StAR和3β-HSD蛋白表达则显著下降(p＜0.05),但P450scc蛋白表达未发生显著变化(p>0.05),原代和永生化黄体细胞的孕酮产量均显著下降(p＜0.05)。软琼脂和裸鼠致瘤试验结果显示,永生化黄体细胞在体内和体外均未发生恶性转化。2 MTT结果显示,PPV感染可显著抑制原代和永生化猪黄体细胞的细胞活性(p＜0.05)。qPCR检测发现PPV可在原代和永生化黄体细胞中进行DNA复制,且随感染时间延长细胞中病毒拷贝数显著增多(p＜0.05)。Hoechst染色结果显示PPV感染可诱导黄体细胞出现核固缩和核碎裂。DNA片段化分析结果显示,PPV感染一定时间后可引起黄体细胞出现DNA Ladder现象。流式细胞术检测结果显示,Annexin V阳性细胞比率随PPV感染时间延长显著上升(p＜0.05)。Caspase活性检测和流式细胞凋亡率检测结合caspase特异性抑制剂检测,结果显示,PPV感染使caspase-9和caspase-3的活性显著升高(p＜0.05);而caspase-8活性未发生显著变化(p>0.05),且caspase-8特异性抑制剂预处理也未对caspase-3活性造成显著影响(p>0.05)。同时,Western blotting检测结果显示,PPV感染过程中原代和永生化黄体细胞中Fas和FasL蛋白表达均未发生显著变化(p>0.05);而Bax蛋白表达显著上升(p＜0.05),且细胞质中Bax蛋白量显著下降(p＜0.05),线粒体中Bax蛋白量则显著上升(p＜0.05),Bcl-2蛋白表达显著下降(p＜0.05),进而导致Bax/Bcl-2比率显著上升(p＜0.05)。线粒体中cyt c蛋白水平显著下降(p＜0.05),细胞质中cyt c显著升高(p＜0.05)。Western blotting和RT-PCR法检测p53蛋白及基因表达的变化情况,结果显示,PPV感染可诱导原代和永生化黄体细中p53蛋白含量显著升高(p＜0.05)且p53 mRNA表达水平也显著上升(p＜0.05);同时,p53特异性抑制剂和p53 siRNA可显著抑制PPV诱导的Bax蛋白的表达(p＜0.05)、caspase-3活性的升高(p＜0.05)和黄体细胞凋亡率的上升(p＜0.05)。Western blotting检测结果显示,PPV感染可引起原代和永生化黄体细胞中p38 MAPK磷酸化水平显著升高(p＜0.05)。p38特异性抑制剂预处理原代和永生化黄体细胞,Western blotting结果显示p38特异性可显著抑制PPV诱导的p53蛋白含量的升高(p＜0.05)并使细胞核中p53蛋白水平显著下降(p＜0.05);流式细胞术检测结果显示,p38特异性抑制剂预处理可显著抑制PPV诱导的黄体细胞凋亡率的升高(p＜0.05)。3 PPV感染原代和永生化黄体细胞,放射免疫法检测上清中孕酮含量结果显示,PPV感染显著降低细胞上清中孕酮含量(p＜0.05)。Western blotting和Real-time PCR法检测PPV感染后黄体细胞中调控孕酮合成的关键蛋白StAR和关键酶3β-HSD和P450scc的表达变化,结果显示,PPV感染可显著抑制StAR、3β-HSD及P450scc mRNA和蛋白的表达(p＜0.05)。此外,Bax特异性抑制剂预处理原代和永生化黄体后,采用放射免疫法检测上清中孕酮含量结果显示,Bax特异性抑制剂可显著抑制PPV诱导的孕酮水平的下降(p＜0.05)。同时,放射免疫检测结果显示p53特异性抑制和p38特异性抑制剂剂预处理均能显著抑制PPV诱导的孕酮产量的下降(p＜0.05)。4将36头健康初孕母猪,随机分为对照组和PPV感染组,18头/组。在配种前、配种后第22天(通过滴鼻感染PPV,记为0 dp.i.),7 dp.i.、14 dp.i.、21 dp.i.、28 dp.i.和35 dp.i.采集血液,制备血清。一份用于检测血清中PPV抗体水平,发现PPV感染后,血清中PPV抗体水平变为阳性。另一份采用放射免疫法检测血清中孕酮含量,结果显示,PPV感染14 dp.i.妊娠猪血清中孕酮含量发生显著下降(p＜0.05)。在感染21 dp.i.、28 dp.i.和35 dp.i.处死对照组和PPV感染组初孕母猪,采集卵巢组织进行原位杂交染色,结果显示在黄体组织中,PPV主要的黄体细胞内进行复制,且随感染时间的延长,黄体组织中病毒量逐渐增多。TUNEL和间接免疫荧光染色结果显示,随着PPV感染时间延长黄体组织中发生凋亡的细胞数量显著上升,且发生凋亡的细胞主要为黄体细胞。HE染色结果显示,与对照组相比,PPV感染组的黄体细胞出现明显的固缩和空泡化现象,并随感染时间的延长病变愈加明显。透射电子显微镜观察PPV感染35 dp.i.黄体组织中黄体细胞超微结构变化发现,PPV感染可引起黄体细胞出现细胞核固缩、胞质体积减小、细胞器溶解和凋亡小体等凋亡现象。Western blotting检测发现,PPV感染可使黄体组织中活化的caspase-9和caspase-3表达显著升高(p＜0.05);并显著上调促凋亡蛋白Bax的表达(p＜0.05),抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(p＜0.05)。同样,p53蛋白和磷酸化p38 MAPK在黄体组织中蛋白水平均显著升高(p＜0.05)。提取黄体组织的总RNA和蛋白通过Real-time PCR和Western blotting法检测孕酮合成过程中关键蛋白(StAR)和关键酶(3β-HSD和P450scc)mRNA和蛋白表达水平的变化情况,结果显示,随着PPV感染时间的延长,黄体组织中StAR、3β-HSD和P450scc mRNA和蛋白表达水平均显著下降(p＜0.05)。本研究获得了一株具有遗传稳定性、并保留了原代猪黄体细胞主要生物学特性和功能的永生化猪黄体细胞系。PPV感染原代和永生化猪黄体细胞,qPCR法检测发现,PPV可以在黄体细胞中复制,Hoechst 33258染色、DNA片段化分析、流式细胞术检测发现,PPV感染诱导了黄体细胞发生凋亡。进一步探讨PPV感染诱导黄体细胞凋亡机制发现,PPV感染是通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞发生凋亡。PPV感染原代和永生化猪黄体细胞,检测孕酮合成过程中关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和P450scc的表达发现,PPV感染通过抑制关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和P450scc的表达抑制黄体细胞孕酮合成。分别使用PPV诱导黄体细胞凋亡关键蛋白Bax、p53和p38的特异性抑制剂预处理黄体细胞发现黄体细胞孕酮产量有所升高。PPV人工感染初孕母猪发现,黄体组织TUNEL染色阳性细胞主要为黄体细胞,并进一步证实了PPV在体内感染条件下,也是通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。人工感染初孕母猪过程中,机体血清中孕酮水平显著下降,StAR、3β-HSD和P450scc的表达也发生显著下调,与体外细胞试验结果一致。研究结果证实了PPV感染可诱导黄体细胞凋亡和抑制黄体细胞孕酮产生,揭示了PPV诱导猪黄体细胞凋亡和抑制黄体细胞孕酮产生的机制,为进一步研究PPV的致病机理提供依据。
耿雨菲[6]2016年在《2014-2015年黑龙江三个地区犬细小病毒2型的PCR检测及其VP2基因序列分析》文中指出犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是引起犬腹泻的主要病原,它属于细小病毒科,细小病毒属成员,是一类无囊膜、单股DNA病毒。犬细小病毒病在1978年成为全球性疾病,并在世界各地呈地方性流行。犬细小病毒病为一种烈性传染病,其发病率和死亡率均很高,是目前影响我国宠物犬、观赏犬、军犬、警犬等健康的主要传染病之一,给人们带来了严重经济损失。为了分析黑龙江三个地区CPV-2流行毒株遗传演化的规律及流行现状,本研究以VP2(568 bp)为目的基因,对2014年5月份至2015年4月份黑龙江三个地区有腹泻症状的201份犬粪便拭子样品进行PCR检测。研究结果表明,201份犬粪便拭子样品中有95份样品呈CPV-2阳性,其阳性率为47.26%,且VP2基因的核苷酸和氨基酸的同源性分别为98.8%~100%和97.6%~100%;在这95份CPV-2阳性样品中,新CPV-2a型(Ser297Ala)、新CPV-2b型(Ser297Ala)和CPV-2c型的阳性率分别为64.21%、21.05%和14.74%;各类型阳性率的不同主要体现在地域、季节和年龄之间的差异上;其中CPV-2阳性样品中接受过免疫的犬占48.42%;此外也发现了犬冠状病毒(CCoV)、犬嵴病毒(CaKV)和犬博卡病毒(CBoV)三种病毒混合感染的阳性样品。进化树分析结果显示,新CPV-2a型、新CPV-2b型和CPV-2c型毒株与中国CPV-2毒株关系密切;新CPV-2a型毒株具有较高的变异性,形成三个亚群。95份CPV-2阳性样品中,Tyr324Ile和Thr440Ala的氨基酸替换率分别为100%和64.21%;所有的新CPV-2b型毒株皆在440位发生氨基酸(Thr→Ala)替换,且在CPV-2c型毒株中首次发现370位氨基酸(Gln→Arg)替换的特点。通过本次流行病学调查得出,新CPV-2a型、新CPV-2b型和CPV-2c型在黑龙江三个地区呈混合流行性,其中以新CPV-2a型和新CPV-2b型为主。
严云, 吴玄光[7]2007年在《PCR法检测犬细小病毒的研究进展》文中研究指明聚合酶链反应是一种体外扩增特定DNA片断的技术,能快速、特异地在体外扩增特定的DNA片断,使之在短时间(数小时)内特异地扩增数百万倍。目前,在临床上聚合酶链反应方法已被广泛应用于DNA的检测。本文就聚合酶链反应检测细小病毒的研究作一综述。
吴雪伶, 樊金萍, 林林, 冯建平, 孟淑芳[8]2010年在《重组鼠源性细胞鼠细小病毒(MMV)检测方法的建立及应用》文中研究表明目的:建立重组细胞中鼠细小病毒检测的NB324K感染试验及实时荧光定量PCR检测方法,并分别进行了方法学分析。方法:将不同稀释度的MMV悬液分别感染NB324K细胞,通过观察细胞病变和结晶紫染色结果检测NB324K感染法的灵敏度。通过设计合成针对非编码区保守序列的一对引物和探针,并优化荧光PCR反应体系和反应条件,建立用于重组细胞中鼠细小病毒检测的荧光定量PCR方法,并对方法的特异性、线性、精密度、灵敏度等指标以及试验干扰性和可行性进行了分析。将NB324K感染试验与荧光定量PCR试验相结合,初步建立NB324K感染PCR试验,并比较该试验方法与NB324K感染法的检测灵敏度及检测时间。结果:建立了NB324K感染试验,该试验的检测灵敏度为0.2CCID50,感染时间为144小时。建立并优化了鼠细小病毒的荧光定量PCR检测方法,该方法特异性较好,与其他种属的细小病毒无明显的交叉反应,线性范围为109-105拷贝数/反应,R2达到0.99以上,灵敏度为5×104拷贝数/反应,试验内和试验间的Ct的精密度均<5%,试验内病毒拷贝数的精密度20%～30%,试验间为20%～50%。通过检测鼠细小病毒感染CHO-K1的模型,证实该方法能够用于细胞样品中鼠细小病毒的检测。对样品进行干扰试验分析结果显示,部分样品存在病毒检测的干扰反应。将该方法与NB324K感染试验相结合,建立了NB324K感染PCR试验,检测灵敏度为0.02CCID50,感染时间为96小时。结论:本研究建立的鼠细小病毒的NB324K感染试验和荧光定量PCR检测方法能够较好的应用于重组细胞中鼠细小病毒的检测,初步建立NB324K感染PCR试验,进一步提高了感染试验的灵敏度并缩短了试验时间。
王静[9]2018年在《犬冠状病毒的分离鉴定及两种检测方法的建立》文中研究表明犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCoV)是小肠的自限性病原体,一般会导致幼龄犬非致死性的轻度腹泻,当与其他肠道病原体共感染时,患病动物死亡率升高。1971年CCoV首次在德国报道,目前呈世界性流行。近年来,随着欧洲地区多例致死性的CCoV高致病性变异毒株的报道,引起全球研究学者的普遍关注。本试验旨在对从北京地区采集到的犬粪便样品进行检测,并对部分阳性样品进行病毒分离,经鉴定确实为CCoV,之后用分离的病毒建立用于CCoV检测的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法和鉴别CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的双重纳米RT-PCR方法,以期可以深入了解北京地区CCoV的流行情况,为犬冠状病毒病的诊断、防治及后续相关研究奠定基础。用优化后的RT-PCR法对采集于北京地区犬粪便样本进行犬冠状病毒检测及基因型鉴定,从检测的阳性样本中筛选出病毒粒子浓度高且无其他犬常见病毒感染的3个样品进行CCoV的分离。2份样品在增殖至4代前CPE明显,通过RT-PCR法显示为阳性,至第5、6代CPE不明显甚至消失,RT-PCR法结果显示为阴性,另外1份样品成功分离,说明CCoV在细胞上能出现CPE,但是病毒增殖较不稳定。应用参考毒株的多抗对分离毒进行了间接免疫荧光试验,并结合形态学鉴定,确定该病毒为CCoV,经RT-PCR法鉴定其基因型为Ⅱ型。对CCoV分离株C-末端9 kb的基因片段进行克隆并测序,通过与Gen Bank中提供的其他CCoV基因组比对,结果显示与CCoVfc1株有最高同源性,属于CCoVⅡ型的分支中,与国内的分离株同源性也很高,说明国内CCo V在进化上很可能存在共同的来源,与CCo V-Ⅰ型的23/03株同源性最低,之后在NCBI中进行BLAST发现与意大利的CCoV strain 430/07株同源性最高,高达约96%。应用分离的病毒建立了快速检测CCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,最低能检测出45copies,应用该方法对采集北京地区的某犬养殖场和动物医院共计76份粪便样品进行检测,结果揭示,集约型养殖很容易导致整个犬群CCoV的传播流行。同时建立了用于鉴别CCoV-Ⅰ和CCo V-Ⅱ的双重纳米RT-PCR方法,具有良好的特异性和灵敏性,并且操作简便快捷,灵敏性试验表明最低核酸检测量是普通RT-PCR方法的100倍。用双重纳米RT-PCR方法对采集于北京地区的60份粪便样本进行检测,结果可知CCoV-Ⅱ型在犬群中的感染率较大,相比较CCoV-Ⅰ而言占优势,并且结果显示犬群中存在两种基因型共感染的情况。
马建[10]2005年在《养殖水貂阿留申病感染情况及分子流行病学的研究》文中提出应用对流免疫电泳(CIEP)和聚合酶链式反应(PCR)方法,对在打皮期从我国主要水貂养殖区——山东、辽宁和黑龙江3地,随机采集的38、42和30份水貂样本的ADV感染情况,进行了对比检测。两种方法检测得到的三地ADV感染阳性率,分别为50.0%、42.8%、66.67%和63.16%、54.76%、86.67%。两组存在差异的检测结果,均可在一定程度上说明国内养殖水貂群AD的高感染率;同时,也可反映出CIEP法用于AD检测时存在的误差。 对通过PCR方法检测得到的ADV感染阳性母貂的产仔情况,进行了跟踪观察;并使用PCR方法对仔貂分窝时感染ADV的情况进行了检测。总结观察、检测结果,可得到以下结论:1,ADV感染阳性母貂产仔的数量少,死胎数及发育不良的幼仔数要明显高于ADV阴性貂。2,实验中,ADV感染阳性母貂所产幼仔分窝时感染ADV的比例为100%。 有关AD分子流行病学研究中,首先对从山东、辽宁和黑龙江3地分离到的16株ADV毒株VP2基因上的,以超变区为核心区域的基因片断,进行了PCR扩增、克隆和序列测定。借助核酸分析软件,对获得的该16株ADV的序列与ADV-G、ADV-Utahl及ADV-K等几株国外代表性参考毒株的序列进行了比较。在比较分析的基础上,初步探讨了国内ADV分离株基因型的划分,及它们与国外参考株间的遗传进化关系,并可得到以下结论:1.多数ADV国内分离株基因型可划归为Ⅱ或Ⅲ型,它们具有与欧美参考株较近的亲缘关系,国内AD源于引种的可能性很大:2.国内ADV存在高度遗传多样性。ADV-DL1、ADV-DL2这两株核酸缺失株,以及与国外参考株存在明显核酸和推导的氨基酸序列差别的ADV-DL5株,可能为国内ADV中明显有别于欧美参考株的基因型株。其次,对ADV-DL1、ADV-DL2核酸缺失株和ADV-DL5株这3株国内分离株VP2基因上与致病力相关的基因片断,进行了扩增、克隆和序列测定,并与国外参考株进行了对比分析。结果表明:ADV-DL1、ADV-DL2和ADV-DL5国内分离株与国外参考株,在与致病力相关基因区上整体变异不大,同源率在93.6%-96.0%之间。ADV-DL1、ADV-DL2和ADV-DL5与国外参考株相对比,均存在特有的氨基酸突变位点。ADV-DL1、ADV-DL2的突变位点相对较少(分别为5和6处),且根据突变氨基酸的性质,推断它们对VP2蛋白空间结构产生较大影响的可能性不大。ADV-DL5与国外参考株间氨基酸突变位点相对较多,共有10处,且其中几处氨基酸的改变可能对VP2蛋白空间结构产生较大的影响。而结构蛋白VP2构象的变化可进一步影响ADV的致病力等相关生物学相关特性。由此,在第一部分研究工作的基础上,可更进一步加强ADV-DL5株为国内特有的一ADV新基因型毒株的可能性。另外,ADV-DL5、ADV-DL1和低致病力的ADV-Pullman株间在致病力相关功能区推导的氨基酸序列上共同具有3-4个有别于其它致病力株的氨基酸残基位点,这也是一个比较有意义的发现。
参考文献：
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[2]. 犬细小病毒四川株的分离鉴定与VP2结构蛋白基因变异性研究[D]. 戈锐. 四川农业大学. 2007
[3]. 猫肾F_(81)传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法[J]. 刘雪燕, 黄韧, 刘忠华, 程树军. 中国实验动物学报. 2001
[4]. 犬瘟热病毒H基因的克隆表达与分子流行病学研究[D]. 刘刚. 西北农林科技大学. 2008
[5]. 猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究[D]. 张樑. 西北农林科技大学. 2018
[6]. 2014-2015年黑龙江三个地区犬细小病毒2型的PCR检测及其VP2基因序列分析[D]. 耿雨菲. 黑龙江八一农垦大学. 2016
[7]. PCR法检测犬细小病毒的研究进展[J]. 严云, 吴玄光. 广东畜牧兽医科技. 2007
[8]. 重组鼠源性细胞鼠细小病毒(MMV)检测方法的建立及应用[C]. 吴雪伶, 樊金萍, 林林, 冯建平, 孟淑芳. 2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集. 2010
[9]. 犬冠状病毒的分离鉴定及两种检测方法的建立[D]. 王静. 中国农业科学院. 2018
[10]. 养殖水貂阿留申病感染情况及分子流行病学的研究[D]. 马建. 东北林业大学. 2005