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【摘 要】外泌体是由细胞主动内吞加工分泌的直径为30-100nm的双层脂质结构细胞外囊泡。几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，其主要成分包括蛋白质、脂质、核酸。外泌体在细胞信息交流中发挥着重要作用，并与多种疾病的发生、发展、治疗及预后密切相关。肿瘤来源的外泌体参与调控肿瘤生长发展和侵袭耐药等过程。本文对外泌体来源、成分及其与乳腺癌诊断和耐药调控的相关研究做一综述。
1980，Eberhard G.Trams和R.M. Johnstone发现了外泌体[1]。由于最初被认为是细胞排泄废物的一种方式，外泌体在被发现之后的十多年一直没有受到重视。1996 年G．Raposo[2]等在研究EB 病毒转染的人B 细胞时发现，一些有膜结构的小囊泡表面表达的主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（ major histocompati?bility complexⅡ，MHC-Ⅱ）能激活T 细胞并在体内起到抗原递呈的作用。1998年，L．Zitvogel[3]等发现树突细胞液可以分泌外泌体，这使研究人员意识到外泌体很有可能是细胞之间交流的工具。2007年，H．Valadi[4]等发现，细胞之间可以通过外泌体中的RNA交换遗传物质。这意味着细胞可以通过外泌体影响另一个细胞，甚至可以把自己的基因强加给另外一个细胞。2013年，诺贝尔生理/医学奖颁给了三位科学家，他们分别是美国科学家James E. Rothman和Randy W.Schekman，德国科学家Thomas C. Sudhof，以表彰他们发现细胞内部囊泡（外泌体等）运输调控机制。
目前，科学界将细胞外囊泡（extracellularvesicle）大致分为三类：微泡(microvesicle)、凋亡小体（apoptotic body）和外泌体（exosome）。微泡是由细胞分泌的一种直径为100~1000nm的膜囊泡[5]；凋亡小体是指细胞程序性死亡过程中所释放的一种直径为500~4000nm的膜囊泡[6~7]；外泌体则是一种直径为30~100nm由细胞经过内吞-融合-外泌等一系列过程分泌到细胞外的膜囊泡，其在电镜下呈现为脂质双层包裹的扁平球体。研究发现，淋巴细胞、神经细胞、树突状细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞均可分泌外泌体，而且外泌体广泛分布于各种体液中，如血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、羊水、腹水等[8]。
一、外泌体的来源
外泌体的形成过程始于细胞表面网格蛋白（clathrin-coated vesicles， CCV）参与的内吞作用形成的早期内吞体（early endosomes）,内吞体通过内向出芽作用，包裹特意分选的蛋白、核酸等物质在内吞体内形成多个管腔囊泡（intraluminal vesicles, ILVs）,这些管腔囊泡即为外泌体前体。晚期内吞体内包含多个ILVs后形成多泡内核体（multivesicular endosome, MVE）&多胞体（multivesicular body, MVB）[9].随后，大多数MVB与溶酶体融合，导致MVB降解，而少数MVB的膜表面有CD63、溶酶体跨膜蛋白1（lysosomal membrane protein LAMP1），LAMP2等，可介导其与细胞膜融合并向胞外释放外泌体[10]。
二、外泌体的主要成分
1.蛋白质：外泌体中蛋白质的含量和种类都十分丰富，外泌体携带的蛋白质可以分为两大类；一类是外泌体中普遍存在的肌动蛋白、微管蛋白、热休克蛋白（heat shock protein, HSP）等细胞骨架蛋白，Rab蛋白、Alix、Flotillin和肿瘤易感基因101（tumor sensatine gene 101, TSG101）[11]等膜转运蛋白和膜融合蛋白，以及CD9、CD81、CD63等内体转运相关的四跨膜蛋白（tetraspanin）等[12~13]；另一类是根据细胞来源的不同而存在差异，如抗原呈递细胞（antigen presenting cell, APC）释放的外泌体中含有MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子[14]，T细胞来源的外泌体携带特异性的CD3分子[15]，血小板来源的外泌体含有血友病因子和整合蛋白CD41a[16]，神经元分泌的外泌体含有谷氨酸受体[17]，肿瘤细胞来源的外泌体上表达大量的肿瘤抗原等。
2.脂质：外泌体含有的脂质主要有磷酯酰丝氨酸、鞘磷脂和胆固醇等。这些脂质分子不仅参与维持外泌体的形态，还能作为信号分子参与众多生物学过程，如传递一些中间信号分子如前列腺素、磷酸激酶C和D等[18]。外泌体的脂质与其来源的细胞质膜的脂质成分、分布和含量都有所不同，这些特点保证了外泌体在胞外环境中不被酶降解，保持了其自身稳定性，进一步增强了被靶细胞吸附的能力。
3.核酸：外泌体还含有各种mRNA及小干扰RNA（small interferring RNA，siRNA）等核酸，当这些RNA 被另一个细胞捕获时，mRNA 能合成新的蛋白质，微小RNA（microRNA，miRNA）可调控蛋白质在受体细胞中的表达。外泌体携带的DNA、mRNAs、长非编码RNA（long noncoding RNAs，LncRNAs）、microRNAs分子转移到靶细胞后可以通过多种途径调控细胞的生命活动。研究发现，许多外泌体携带的miRNA可以作为肿瘤标志物指示肿瘤的大小、恶性程度、侵袭转移、分期分级等。如miR-21 在来源于食管鳞癌患者血液的外泌体中表达上调[19]。有研究表明，肺癌细胞分泌的外泌体含有miR-21 和miR29a，这些miRNAs 可以和免疫细胞的Toll 样受体结合，引发炎症反应，促进肺癌细胞的生长[20]；此外，在IL-4的刺激下，巨噬细胞分泌的外泌体将携带的miR-223 转运至乳腺癌细胞后，激活Mef2c-β-catenin 信号通路，进而促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移[21]。
三、乳腺癌中外泌体作为诊断标志物
乳腺癌的早期诊断、早期治疗是提高疗效的关键。目前常用的是影像学和病理学的诊断。影像学检查存在放射损伤、灵敏度低等缺陷；病理学检查包括针吸活检、手术切除活检，是诊断的“金标准”，但它是一种有创检查，给患者带来一定的损伤。寻找其他有效的生物标志物辅助乳腺癌诊断是研究的另一个重点。近几年的研究表明几乎所有体液中都包含外泌体（血液、尿液、唾液、乳汁等），且外泌体包含特异性蛋白质、RNA、脂质等，对于疾病的早期诊断有很重要的价值，可以充当乳腺癌的诊断标志物 。此外外泌体中的蛋白质、miRNA等信号分子稳定性优于其游离状态，真实反映分泌细胞的生理及病理功能状态，故从体液中纯化出外泌体具有良好的临床应用前景[22]。
外泌体miRNA在乳腺癌诊断方面的价值也有所研究。李卓等[23]研究指出人血清中可以有效分离得到外泌体，与全血清样本比较，分离外泌体可以显著提高循环miRNA类的疾病标志物的检出。对肿瘤外泌体转录组学的研究发现正常人和肿瘤患者外泌体内miRNA表达谱不同，这为外泌体miRNA作为诊断标志物提供基础。Eichelser等[24]通过对50例乳腺癌患者和12名健康女性外泌体中miR-101、miR-327、miR-373的定量检测发现：与管腔上皮型相比，三阴乳腺癌患者血清循环外泌体miR-373水平增高；与激素受体阳性乳腺癌患者相比，雌激素受体阴性和孕激素受体阴性乳腺癌病人外泌体miR-373也呈高表达，由此可见血清外泌体miR-373可作为高侵袭性乳腺癌标志物。Zhou等[25]发现miR-105在转移性乳腺癌中特异性表达，通过比较含外泌体血清和去除外泌体血清中miRNA的表达时发现，循环miR-105主要存在于外泌体中。从血清中纯化外泌体，在平均随访时间为４.２ 年的患者中发现外泌体miR-105在随后发生远处转移的患者中的表达高于未发生远处转移者，表明外泌体miR-105在转移前状态升高与转移相关，其可作为预测乳腺癌转移的指标；Bethany N. Hannafon等[26]通过PDX小鼠实验发现乳腺癌细胞外泌体miR-1246和miR-21高水平表达，这种外泌体小RNA被释放入血液中，可以作为乳腺癌的血浆生物标志物。在对16名乳腺癌患者血浆外泌体中检测到的miR-1246和miR-21的水平明显高于健康对照者，受试者工作特征曲线分析表明，血浆外泌体miR-1246和miR-21联用相比单独使用单一指标诊断是更好的乳腺癌指标。然而，这些外泌体标志物的临床应用还需要进行更大样本量分析。
四：外泌体介导药物耐受
乳腺癌细胞间还存在着耐药性传递的现象，外泌体可能是耐药信息传递的转运载体[27]。Chen等[28~29]发现阿霉素和多西紫杉醇耐药的乳腺癌细胞株通过外泌体横向转运miRNA至敏感细胞株，其转运的miRNA可能参与某些增殖、凋亡相关的信号通路，最终通过调节敏感细胞株细胞周期分布改变或调节药物诱导的凋亡进而产生耐药。外泌体除了通过转运miRNA传递耐药外还可以通过转运耐药相关蛋白介导耐药传递。Ｐ－糖蛋白（P-gp）是相对分子质量为170000的跨膜蛋白，由MDR1编码，研究已证实其过表达是耐药发生的重要机制[30]。Lv等[31]发现外泌体介导的MCF-7乳腺癌细胞耐药的传递与P-gp有关，耐药MCF-7通过外泌体传递P-gp至敏感细胞株最终导致耐药在异质性肿瘤细胞间的传递。Juliana Carvalho Santos等[32]的研究发现外泌体中miR-155调控乳腺癌细胞有更高的迁移率并促使生成更多的乳腺干细胞，其在耐药乳腺癌细胞中的大量表达与对药物敏感乳腺癌细胞转染为耐药细胞证明了细胞间传导miR-155介导的耐药性传递机制。
五：总结
越来越多的证据表明外泌体通过介导细胞间和细胞内的交流，参与乳腺癌发生发展的多个过程，在乳腺癌中发挥着“双刃剑”的作用。一方面通过传递致癌性因子、耐药蛋白及耐药miRNAs等促进乳腺癌进展及耐药；另一方面其在肿瘤诊断、治疗、预后等方面发挥有利作用。外泌体尤其是其携带的物质如miRNAs用于乳腺癌的诊断具有其优势，比血清中游离miRNAs更加稳定，可以探索直接检测外泌体miRNAs的方法而无需先将其分离；但其在肿瘤早期诊断以及鉴别诊断中的潜在价值仍有待进一步评估。此外，外泌体用于肿瘤的生物治疗已显示出其潜在的应用前景，在精准医疗的发展趋势下，外泌体可能成为新一代的基因治疗靶点，将会对乳腺癌的诊断和治疗带来新的方向。
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论文作者:陈李澍伯,杨琦,郑燚,尹楠,马靖涵,张夺标,闫伏
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2019年2月下第4期
论文发表时间:2019/6/4
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