海湾扇贝和栉孔扇贝EST分析及C型凝集素基因的克隆与分析

胥炜^[1]2004年在《海湾扇贝和栉孔扇贝EST分析及C型凝集素基因的克隆与分析》文中进行了进一步梳理扇贝养殖业是我国海水养殖的支柱性产业，海湾扇贝和栉孔扇贝是扇贝养殖业中的两个重要的养殖品种。近年来，养殖扇贝病害不断爆发流行，造成大规模死亡，经济损失十分惨重。引起扇贝大规模死亡的原因是多方面的，其根本原因则是养殖环境的恶化和扇贝种质的衰退，抗病力下降。所以，在积极调整产业结构、加强环境治理、开展栉孔扇贝病原及流行病学研究的同时，改良种质增强扇贝的抗病抗逆能力则是解决困扰扇贝养殖业健康可持续发展的根本保证。扇贝中抗病基因的克隆和表达无疑是研究养殖动物免疫防御机制，提高机体抗病力，实现遗传改良的基础和关键。 表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）技术是近年兴起的一种高通量基因筛选和鉴别的有效方法。本研究利用 EST 技术对栉孔扇贝和海湾扇贝表达序列进行大规模测序分析，旨在从 EST 数据中寻找与免疫防御相关的基因，同时也为今后扇贝生物功能基因的筛选与克隆奠定良好基础。 从正常海湾扇贝和感染鳗弧菌的栉孔扇贝中分离提取 mRNA，经反转录得到cDNA，然后克隆到相应载体中，构建λ噬菌体 cDNA 文库，克隆片段平均长度约为 1.2kb。从海湾扇贝和栉孔扇贝两个文库中分别挑选出 7680 个阳性克隆从 5’末端进行测序，分别得到有效数据 4991 和 5123 个。海湾扇贝和栉孔扇贝 cDNA文库测序反应平均读长分别为 462.01bp 和 392.52bp，有效平均读长分别为347.62bp 和 360.06bp。所有测得的数据经 Phrap 聚类拼接后在海湾扇贝数据库中得到 637个 contigs和 2138 个 singletons，在栉孔扇贝数据库中得到 contigs584 条，singlets 2762 条。将拼接后的结果进行 BLAST 比对，结果显示海湾扇贝中 259 条 contig 数据和 585 条 singleton 数据与 GeneBank 中已知序列具有较高同源性（E-value<0.005），而在栉孔扇贝 ESTs 中，有 332 条 contig 和 725 条singleton 可以在 GeneBank 中的序列具有较高同源性。在海湾扇贝和栉孔扇贝 - 1 -胥 炜 海湾扇贝和栉孔扇贝EST分析及C型凝集素基因的克隆与分析 硕士学位论文所有 EST 序列中，未发现同源序列的 EST 数量最多，均占到了各自总 EST 数目的56%。与细胞分裂相关基因同源的序列各占 1%，与细胞信号与传导相关基因同源的序列分别为 2%和 3%，与细胞结构与运动相关基因同源的 EST 分别占 9%和 8%，与细胞与基因和蛋白表达相关基因同源的数据分别占 12%和 5%，与新陈代谢相关基因同源的序列占到各自总数的 7%和 8%，与未知功能的已知序列同源的 EST 的比例分别为 7%和 6%。6%的海湾扇贝 EST 与 13%的栉孔扇贝 EST 序列与免疫防御相关的基因具有同源性，这些基因中包括防御素（defensin），溶菌酶（lysozyme）,凝集素（lectins），热休克蛋白（heat shock protein），过氧化物酶（peroxidase），丝氨酸蛋白酶（serine proteinase），金属蛋白酶（metalloprotease）等。该结果为进一步从扇贝中筛选和克隆参与抗病防御的功能基因提供了可能。 使用 RepeatMasker 软件在海湾扇贝的 ESTs 中发现了 76 个微卫星序列，占海湾扇贝全部 EST 数目的 1.43%。选取其中的 21 条序列，根据微卫星位点的旁侧序列设计引物，并对设计出的引物进行多态性检测，发现 21 对引物均能产生扩增产物，其中有 14 对引物可望在以后的群体分析及连锁图谱的构建中加以应用。该结果初步证实了在海湾扇贝的 ESTs 序列中存在微卫星位点，从而为扇贝中微卫星标记的筛选开辟了新的途径。 在对栉孔扇贝 EST 分析的基础上，利用 RACE 和锚定 PCR 技术克隆得到了 1个栉孔扇贝C型凝集素基因的全长cDNA序列。该序列全长1038bp，编码区684bp，可以编码 228 个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了 C 型凝集素家族的特征模体和一个 C 型凝集素的结构域（C-type lectin domain, CTLD）。通过 Clustalw和 SMART 分析在该序列中发现了形成二硫键的 4 个保守的半胱氨酸,与其他物种C 型凝集素的二硫键结构非常相似。用半定量 RT-PCR 技术对此基因在鳗弧菌感染前后血淋巴中的表达规律进行了研究，发现该基因在病原刺激前后各时间段均有表达，但在刺激后 6 小时表达量达到最高。结果表明 C 型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制，在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。

张峘^[2]2009年在《扇贝补体样成分的基因及其功能研究》文中认为补体系统作为固有免疫的组成部分和免疫效应系统,在无脊椎动物防御过程中发挥了重要作用。但目前对无脊椎动物补体样系统的研究刚刚起步,对软体动物补体样成分的研究几近空白。本研究采用RACE、RT-PCR和基因原核重组表达等分子生物学技术开展了对栉孔扇贝(Chlamys farreri)含硫酯蛋白(thioester-containing protein, CfTEP)、含C1q结构域蛋白(C1 q-domain-containing protein, CfC1qDC)、C型凝集素(C-type lectin, Cflec-3, Cflec-4和Cflec-5)和海湾扇贝(Argopecten irradians) C型凝集素(AiCTL-6)、纤维蛋白原相关蛋白(fibrinogen-related protein, AiFREP)等基因的克隆、表达和功能研究。CfTEP、CfC1qDC、Cflec-3、Cflec-4、Cflec-5、AiCTL-6和AiFREP的cDNA全长分别为4616、777、2256、2080、1412、1063和990 bp。它们的开放阅读框编码的蛋白均含有一段信号肽,并分别含有α2-巨球蛋白结构域、C1q结构域、叁个或四个或一个C型凝集素结构域和纤维蛋白原样结构域。在健康扇贝中,CfTEP和Cflec-4仅在健康扇贝的肝胰腺和性腺中表达,而其它基因在各个检测组织中均有表达。鳗弧菌刺激可显着诱导这些基因的表达。CfTEP基因组DNA通过转录后选择性剪接可形成七种不同的转录本,它们在雌雄扇贝性腺中对不同细菌的刺激呈现出不同的表达模式。原核重组的CfC1qDC蛋白具有较强的脂多糖结合活性；重组的Cflec-3蛋白对施氏假单胞菌具有钙离子依赖的、甘露糖结合型的凝集作用；重组的Cflec-5蛋白对毕赤酵母具有钙离子非依赖的、甘露糖结合型的凝集作用；重组的AiCTL-6蛋白对大肠杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌具有钙离子依赖的凝集作用；重组的AiFREP蛋白对人、鸡血红细胞以及鳗弧菌、大肠杆菌和藤黄微球菌具有钙离子依赖的凝集活性,并且其凝血活性可被含乙酰基的糖类所抑制。本研究结果表明,CfTEP、CfC1qDC、Cflec-3、Cflec-4、Cflec-5、AiCTL-6和AiFREP作为扇贝固有免疫中重要的模式识别受体参与了扇贝对外源微生物刺激的响应。它们在分子结构和功能上与高等动物补体系统中的C3、C1q、甘露糖结合凝集素和ficolin等成分有一定相似性,有可能作为它们的一种原始形式存在于低等软体动物中。该研究结果为进一步描绘扇贝中存在的简单原始的补体系统及揭示补体系统的进化脉络提供了分子生物学证据,同时对深入了解扇贝免疫防御机制,丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容也具有重要理论意义。

王昊^[3]2006年在《栉孔扇贝凝集素家族基因的研究》文中进行了进一步梳理栉孔扇贝是我国北方重要的贝类养殖品种。自1997年以来爆发的栉孔扇贝大规模死亡,给地区经济造成了重大损失并且已经严重威胁扇贝养殖业的健康发展。然而,到目前为止,对扇贝免疫防御的分子机理了解还很少,深入研究扇贝免疫应答的分子机制是认识和了解病害发生和实现病害控制的关键问题之一。本研究采用了EST大规模测序结合cDNA锚定扩增的方法,从栉孔扇贝cDNA文库中克隆到五个C-型凝集素基因,并对其中部分基因进行了深入研究。C-型凝集素CFLec-1的基因全长1785bp,其中含有5'非翻译区66bp,随后是666bp的开放阅读框;最后一条非常长的3'非翻译区1040bp,其中包含多个多聚腺甘酸加尾信号和polyA尾巴。栉孔扇贝CFLec-1编码221个氨基酸的蛋白,其N末端为15个氨基酸的信号肽。CFLec-1的成熟肽为206个氨基酸,其等电点为5.12,计算分子量为23.49kDa。SMART程序分析显示,C末端130氨基酸是一个标准的长型C-型凝集素结构域,其中四个半光胺酸(Cys~(104),Cys~(177),Cys~(193),Cys~(202))形成的两对二硫键维持了C-型凝集素的空间结构,而位于N末端的两个二硫键(Cys~(74),Cys~(85))构成了长型C-型凝集素结构域特有的一对额外二硫键。同源性分析表明,CFLec-1的C-型凝集素结构域与红原鸡的甘露糖受体中的C-型凝集素结构域有47%的相似度,与大西洋鲑的C-型凝集素受体C有31%的相似度。通过与其他同源的C-型凝集素结构域序列比对,发现了可能的糖结合位点EPD基域(Glu~(169)-Pro~(170)-Asp~(171))。通过RT-PCR研究CFLec-1在扇贝不同组织中的分布后发现,在健康扇贝中,CFLec-1在性腺中有中等程度的表达,在腮中有少量表达,在血淋巴和外套膜中有微量表达。经热处死的鳗弧菌刺激后,CFLec-1在几乎所有检测组织中的表达量都有明显的提高,其中,血淋巴中的表达量变化最为显着。这些结果说明CFLec-1是组成/诱导型基因,并且可能参与了黏膜防御。通过RT-PCR分析了CFLec-1在血淋巴中的表达特征后发现,在革兰氏阳性菌溶壁微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌刺激后,CFLec-1的表达均显着高于对照组,并且成明显的随时间变化趋势。在大肠杆菌中表达的重组CFLec-1可以凝集革兰氏阴性菌大肠杆菌JM109,且凝集过程需要钙离子的参与。重组CFLec-1对大肠杆菌JM109有较弱的抑菌活性,对溶壁微球菌有明显的抑菌活性,对鳗弧菌没有抑菌活性。这一结果说明,

参考文献：

[1]. 海湾扇贝和栉孔扇贝EST分析及C型凝集素基因的克隆与分析[D]. 胥炜. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2004

[2]. 扇贝补体样成分的基因及其功能研究[D]. 张峘. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2009

[3]. 栉孔扇贝凝集素家族基因的研究[D]. 王昊. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2006

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