刘晓娜[1]2004年在《上西早生柿组织培养及植株再生的研究》文中认为研究了甜柿上西早生品种(Diospyros kaki Thunb．cv．Unishiwase)的组培快繁、生根和植株再生的基本规律，以期为利用转基因技术改良柿果贮运品质奠定基础，同时也为上西早生柿苗木的快速繁殖提供技术指导。试验结果如下：1、上西早生柿组培苗在MS(1／2N)+ZT1.0+IAA0.1mg／L中继代培养14～15代后，转入DKW培养基中能有效提高丛生苗率约60％，转入MS培养基中培养，平均苗高显着增加。在MS+ZT 1.0+IAA 0.1 mg／L培养基中的组培苗高度和增殖系数，与在MS+ZT 0.5+BA 1.0+IAA 0.1 mg／L中培养的组培苗差异不显着，ZT用量的减少显着的降低了组培苗的成本。0.1～0.2 mg／L IAA比IBA或NAA更适于上西早生柿组培苗的增殖生长。 2、经叁因素叁水平正交实验，组培苗叶片在MS(1／2N)+ZT 4.0+IAA 0.1mg／E培养基中分化率86％，平均不定芽数2.21。MS(1／2N)培养基最好，其次是1／2 MS，MS效果最差；ZT浓度为4.0 mg／L时不定芽的分化率明显高于2.0mg,／L，在ZT1.0mg／L中培养的叶片分化率最低，IAA对叶片分化的效果不明显；组培苗叶片在MS(1／2N)+ZT 1.0+NAA 0.1mg／L中诱导出绿色颗粒状愈伤组织，在MS(1／2N)+ZT 2.0+IAA 0.1mg／L培养基中，经过二次诱导，愈伤组织分化率75％，平均不定芽数2.5；而2，4-D诱导的愈伤组织不能分化不定芽。 经叁因素叁水平正交试验，组培苗叶片在TDZ 1.0+ZT 1.0+IAA 0.1mg／L的MS(1／2N)培养基中，分化率95％，分化不定芽数1.95。TDZ的浓度对分化率和平均不定芽数的影响最大，1.0 mg／L显着优于2.0，3.0mg／L。将TDZ 1.0 mg／L诱导的组培苗叶片愈伤组织转入含有ZT 2.0mg／L的MS(1／2N)培养基中，分化率为100％，平均不定芽数为9.5。 生根组培苗的根段在MS(1／2N)培养基中分化率显着高于MS，ZT 2.0mg／L优于ZT 1.0+BA 1.0 mg／L，在MS(1／2N)+ZT 2.0+IAA 0.1mg／L培养基中，40～50mm根段分化率100％，平均不定芽3.84；根段长度与与平均不定芽之间线形回归关系显着，回归方程为Y=0.03671+0.0896X；培养基中加入0.1mg／L的IAA，能显着提高根段的分化率和平均不定芽数。 3、采用浸蘸和直接加入激素两种方法诱导20～25mm高的组培苗生根。IBA诱导生根的效果优于IAA，浸蘸250mg／L的IBA溶液，在1／2MS(1／2N)培养基中，生根率66.67%，平均根条数1.7，或在培养基中添加1.0m留L的田A溶液，生根率64.58%，平均根条数L6;添加工BAO.5+认ALOm叭或IBAI.om留L的生根培养基中，在BA+ZT一中培养的组培苗比在ZT中培养的组培苗生根率提高12.4%，平均根条数提高92.2%，生根苗的腋芽萌动率提高了2.5倍。再生苗生根能力高于丛生苗，依次为根段再生苗>叶片再生苗>BA+zT丛生苗>Zr丛生苗，根段再生苗生根率差异显着。随着继代次数的增加根段再生苗的生根能力逐渐降低，5次继代后的生根能力降至继代丛生苗相同。
刘艺[2]2008年在《次郎柿与上西早生柿ACC氧化酶的转基因研究》文中研究说明本研究以次郎柿与上西早生柿两种甜柿组培苗叶片为外植体,通过对抗生素筛选条件和根癌农杆菌介导次郎柿与上西早生柿遗传转化条件的优化,建立了次郎柿与上西早生柿遗传转化体系,将ACC氧化酶的RNAi基因导入次郎柿与上西早生柿组培苗中,以期通过转基因的方法抑制ACC氧化酶的表达,提高跃变型果实的耐贮性能。主要取得以下研究结果:1次郎柿转基因体系的建立1.1研究了抗生素对叶片再生的影响,确定了适宜的抗生素浓度。通过次郎柿叶片及组培苗对抗生素的敏感性试验,结果表明:在抗性苗生长过程中,用200mg/L头孢霉素和30mg/L壮观霉素做为筛选转化抗性苗的筛选浓度。1.2次郎柿转基因工艺路线采用继代四年半的组培苗,取其顶端2～3片刚展开的嫩叶,从叶基部剪取4mm×4mm大小的叶片,叶背朝上,接种在DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L的培养基上;暗预培养4d后,用OD_(600)值为0.5的菌液浓度侵染叶片10 min,侵染时加入50 mg/L的乙酰丁香酮。将侵染后的叶片外植体,再转到DKW(1/2N)+ZT 1.0mg/L+TDZ 0.5 mg/L的培养基上共培养3d,之后移入DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+Cef200 mg/L的培养基上黑暗脱菌培养3d;最后转入DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+Cef200 mg/L+Sp 30 mg/L的培养基上光照选择培养,每25d继代一次。继代7～8次后转入DKW+ZT 1.0 mg/L+Sp 30 mg/L+Cef200 mg/L的培养基中。获得了次郎柿ACC氧化酶的RNAi转基因苗。经GUS染色及PCR检测得到27株转基因植株。2上西早生柿转基因体系的建立2.1研究了抗生素对叶片再生的影响,确定了适宜的抗生素浓度。通过上西早生柿叶片及组培苗对抗生素的敏感性试验,结果表明:在抗性苗生长过程中,用200mg/L头孢霉素和30mg/L壮观霉素做为筛选转化抗性苗的筛选浓度。2.2上西早生柿转基因工艺路线采用继代四年半的组培苗,取其顶端2～3片刚展开的嫩叶,从叶基部剪取4mm×4 mm大小的叶片,叶背朝上,接种在DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L的培养基上;暗预培养3d后,用OD_(600)值为0.3的菌液浓度侵染叶片10 min,侵染时加入100 mg/L的乙酰丁香酮。将侵染后的叶片外植体,再转到DKW(1/2N)+ZT 1.0mg/L+TDZ 0.5 mg/L的培养基上共培养4d,之后移入DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+Cef200 mg/L的培养基上黑暗脱菌培养3d;最后转入DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+Cef200 mg/L+Sp 30 mg/L的培养基上光照选择培养,每25 d继代一次。继代7～8次后转入DKW+ZT 1.0 mg/L+Sp 30 mg/L+Cef200 mg/L的培养基中。获得了上西早生柿ACC氧化酶的RNAi基因转基因苗。经GUS染色及PCR检测得到4株转基因植株。
刘聪娟[3]2006年在《柿果ACC合成酶反义基因的遗传转化》文中研究指明本研究以上西早生柿组培苗叶片为外植体,通过对离体叶片再生条件、抗生素筛选条件和根癌农杆菌介导上西早生柿遗传转化条件的优化,建立了高频再生体系和遗传转化体系,并将ACC合成酶基因导入上西早生柿组培苗中。以期通过转基因的方法抑制ACC合成酶的表达,提高跃变型果实的耐贮性能。主要取得以下研究结果: 1.建立了高效稳定的上西早生柿组培苗叶片再生体系 通过对影响上西早生柿叶片再生的基础培养基、激素浓度配比、暗培养时间和叶片部位的研究,得出含氮量低的MS(1/2N)培养基适合上西早生柿的叶片再生,暗培养10天能提高上西早生柿叶片的再生频率,叶片基部的再生能力比叶尖和叶中间部位强,4.0mg/L的ZT能诱导上西早生叶片高效再生。在此条件下,上西早生柿的叶片分化频率达97.8%,平均每叶片产生5.6个不定芽。 2.研究了抗生素对不定芽再生和生长的影响,确定了适宜选择压。 通过上西早生柿组培苗对抗生素的敏感性试验,确定的选择压为:叶片分化培养过程中,用200mg/L头孢霉素作为脱菌培养的抑菌浓度,20mg/L壮观霉素作为对抗性不定芽的筛选浓度;在抗性苗生长过程中,用100mg/L头孢霉素和10mg/L壮观霉素进一步筛选转化抗性苗。 3.建立了高效遗传转化体系,并将ACC合成酶基因导入上西早生柿中。 通过对叶片预培养时间、浸染时间、浸染时菌液浓度、AS浓度,共培养时间等遗传转化影响因素的研究,建立的上西早生柿遗传转化体系为:叶片预培养3天,用OD_(600)为0.3的菌液浸染10分钟,共培养4天。获得的上西早生柿抗性苗经PCR扩增检测,证实ACC合成酶基因已经转入上西早生柿基因组中。 4.上西早生柿组培苗生根条件的研究 研究了基本培养基、激素种类浓度和暗培养时间对上西早生柿组培苗生根的作用效果。结果表明,1/2MS 为最适基本培养基,最佳的激素浓度与配比为IBA1.0mg/L+IAA0mg/L,暗培养5天对上西早生柿组培苗的生根有很大的促进作用。在此条件下,上西早生柿组培苗的生根率达到90%以上。
于丛丛[4]2010年在《上西早生柿ETR5基因RNA干扰植物表达载体的构建及遗传转化研究》文中进行了进一步梳理柿果为呼吸跃变型果实,对乙烯十分敏感,外源乙烯可诱发呼吸高峰,导致柿子软化,给贮藏加工运销等带来很大困难,严重影响了其经济效益。利用转基因技术调控乙烯受体的表达从而减少乙烯的作用来控制柿果的成熟,可以降低果实采收后的贮藏和运输过程中造成的损失。乙烯受体Uenishiwase-ETR5基因在柿果实成熟阶段大量表达,与果实的成熟密切相关。本研究构建了柿果ETR5基因的RNA干扰植物表达载体,首次对根癌农杆菌介导的ETR5基因转化上西柿进行了研究,优化了遗传转化体系。主要研究内容如下：(1)据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增2个Uenishiwase-ETR5基因片段。(2)2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK311的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。(3)载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。(4)以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系。主要研究结果如下：(1)成功的利用植物表达载体pSMAK311构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。(2)通过冻融法将Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体转入根癌农杆菌EHA101中。(3)以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明：立即筛选、延迟筛选、梯度筛选叁种选择方式对抗性芽的百分率及转化率的影响,得到梯度筛选的转化率为2.5%,是该转化体系中最好的筛选方式。另外,AS也是遗传转化的一关键影响因素。在共培养培养基与农杆菌悬浮液中同时加入AS,浓度为200μmol/L时得到的抗性芽最多。(4)利用优化后的遗传转化工艺进行试验,共得到21株PCR检测呈阳性的植株,转化率达3.5%。
马俊莲, 刘晓娜, 张子德[5]2004年在《甜柿上西早生叶片不定芽再生的研究》文中提出采用正交试验方法研究了不同培养基、激素种类及其浓度对上西早生柿叶片不定芽再生的影响。结果表明,氮含量减半的MS [MS (1/2N)]培养基最好,其次是1/2 MS,MS效果最差;ZT (zeatin) 浓度为4.0 mgL-1时不定芽再生率明显高于2.0 mgL-1,在1.0mgL-1ZT中培养的叶片再生率最低;0 mgL-1 IAA (indole acetic acid) 的效果好于1.0 mgL-1和2.0 mgL-1 IAA;正交试验影响因子分析结果显示,ZT的作用最大,其次是培养基和IAA;组合MS(1/2)、4.0mgL-1ZT和1.0mgL-1IAA中不定芽再生率达86%,平均不定芽数为2.2。
刘艺, 马俊莲, 张子德, 唐霞, 宋春丽[6]2009年在《上西早生柿ACC氧化酶的转基因研究》文中提出为了得到耐贮藏的转基因柿,以上西早生柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC氧化酶的RNAi遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的壮观霉素浓度为30 mg/L,预培养时间为3 d,用OD600值为0.3的菌液侵染10 min、AS浓度100 mg/L、共培养4 d有利于提高转化频率。经PCR分子检测与GUS组织化学染色,初步确定ACC氧化酶基因已转入上西早生柿组培苗中。
宋春丽[7]2002年在《磨盘柿和上西早生柿离体繁殖技术初探》文中提出本论文以磨盘柿和上西早生柿为材料，对柿离体快繁技术进行了初步研究。比较了不同时期柿芽的初代培养效果；探讨了不同激素种类、配比在柿组培体系的建立及继代培养中的作用和效果；研究了酚类物质吸附剂、抗氧化剂在防止外植体褐变中的作用；初步探索了激素、暗培养等对组培苗生根的影响。主要结果如下： 1．梢尖或嫩茎段在初代培养中褐变死亡率高达80％以上，不能建立有效的初代培养体系：1～3月份和9～12月份柿芽初代培养萌芽率达80％，是建立磨盘柿初代培养的理想材料。 2．ZT和BA都可用于磨盘柿的初代培养，适宜浓度分别为2mg／l和5.0～7.5mg／l。但BA中生长的初代苗，在含BA的培养基中继代培养生长时，外植体的伸长生长停止，甚至弱化死亡；1mg／l的BA和1mg／l的ZT配合使用可促进其生长，提高分化率和有效新梢率。 3．ZT的继代培养效果好于BA，1mg／l的ZT可用于磨盘柿长期继代培养，2mg／1的ZT可以促进上西早生柿芽增殖；5.0mg／l的BA与0.1mg／l的NAA配合使用促进了上西早生柿簇状不定芽的形成，继代培养时将它们转入含ZT1mg／l和IAA0.05mg／l的培养基中，簇状芽可以正常长高；BA和ZT隔代交替培养，可以提高分化率，降低纽培苗成本。 4．用250mg／l的IBA浸组培苗基部30秒，再经12～15天暗培养后，磨盘柿生根率为20％；200mg／l的IAA浸苗基部20min后，在光照下培养也有根的发生，形成粗壮的主根，平均根长度达54mm。200mg／l的IAA浸上西早生柿组培苗基部20min，暗培养12天，生根率为20％，平均生根数为2条。 5．聚乙烯吡略烷酮(PVP-40)对梢尖和嫩茎段初代培养中的褐变具有显着抑制作用。
艾呈祥, 孙山, 秦志华, 陶吉寒, 王长君[8]2011年在《中国柿品种资源的分布现状与新技术在育种上的应用》文中提出综述了我国柿品种资源的分布现状,分子标记、细胞工程和转基因新技术在柿育种上的应用,对柿种质资源与育种发展前景进行了展望。
参考文献：
[1]. 上西早生柿组织培养及植株再生的研究[D]. 刘晓娜. 河北农业大学. 2004
[2]. 次郎柿与上西早生柿ACC氧化酶的转基因研究[D]. 刘艺. 河北农业大学. 2008
[3]. 柿果ACC合成酶反义基因的遗传转化[D]. 刘聪娟. 河北农业大学. 2006
[4]. 上西早生柿ETR5基因RNA干扰植物表达载体的构建及遗传转化研究[D]. 于丛丛. 河北农业大学. 2010
[5]. 甜柿上西早生叶片不定芽再生的研究[J]. 马俊莲, 刘晓娜, 张子德. 中国农业科学. 2004
[6]. 上西早生柿ACC氧化酶的转基因研究[J]. 刘艺, 马俊莲, 张子德, 唐霞, 宋春丽. 河北农业大学学报. 2009
[7]. 磨盘柿和上西早生柿离体繁殖技术初探[D]. 宋春丽. 河北农业大学. 2002
[8]. 中国柿品种资源的分布现状与新技术在育种上的应用[J]. 艾呈祥, 孙山, 秦志华, 陶吉寒, 王长君. 落叶果树. 2011