王海波[1]2004年在《生物活性物质提取富集方法研究》文中进行了进一步梳理提取和富集技术在进行生物活性物质分离和检测预处理中都有着十分重要的意义。提取的好坏直接影响到分析结果的正确性。目前在生物活性成分提取富集中除了常规使用的液-液萃取外，还不断涌现出许多新的处理技术如固相萃取、固相微萃取、液膜提取、微波辅助提取、加速溶剂提取、液相微萃取等。在对以上各种方法进行了综述的基础上，本论文就乳状液膜法、单滴液相微萃取和液-液-液微萃取法进行了较为系统的研究。液膜的提出是基于生物膜的基础上的，因此本文还研究了生物活性物质的界面行为，以期对其提取有指导意义。 1．综述近年来提取富集方法研究的相关文献。 2．以氯化叁辛基·甲基铵(Aliquat 336)为载体，上-205为表面活性剂，正癸醇为表面助剂，内外相Cl~-离子浓度为推动力，研究了茶氨酸在乳状液膜体系中的传输，并对影响液膜萃取的各种因素进行了系统的阐述，确定了该体系的最佳膜相组成和实验条件，实现了茶氨酸的提取和富集。 3．以Aliquat 336为载体，考察了Aliquat 336-煤油液膜体系对15种氨基酸的传输行为，获得了15种氨基酸的传输效率。实验结果表明，不同的氨基酸侧链对氨基酸的传输效率有显着影响，侧链R基亲油性越强，其传输效率越大。 4．应用液相微萃取与高效液相色谱联用技术(LPME-HPLC)快速分析尿样中的麻黄素和甲基麻黄素。对液相微萃取的条件如萃取溶剂、溶剂体积、萃取时间、料液pH值、搅拌速度等进行了优化，建立了LPME-HPLC分析尿样中麻黄素和甲基麻黄素的方法，方法的线性范围均为0.05～8 μg／mL，最低检测下限分别为0.025μg／mL和0.04μg／mL，相对标准偏差(RSD)分别为8.5％和7.0％。尿样中存在对微量麻黄素和甲基麻黄素检测的干扰物质，但是通过液相微萃取后，能有效的去除干扰物质，获得了较高的选择性。 该方法具有简便、快速、灵敏、消耗有机溶剂少等优点，是尿样 中麻黄碱类药物检测的一种有效方法。5.本文研究了以载体传输为机理的液一液一液微萃取技术对麻黄素和 甲基麻黄素富集。在弱酸性料液中，分析物首先与有机相中的二 (2一乙基己基)磷酸酷(DZEHPA)结合为中性化合物进入有一机相， 然后被反萃到强酸性的液滴中(接受相)。对液相微萃取的条件如 有机相中载体浓度、料液pH值、搅拌速度、萃取时间、盐酸浓度 和液滴体积进行了优化，麻黄素和甲基麻黄素的富集因子均高于 900。得到的最佳条件用于了尿样中微量麻黄素和甲基麻黄素的检 测，分析物的线性范围均为0.02一2.0拼g/mL和0.01心.0拼助nL，线 性相关系数分别为0.9985和0.9991，相对标准偏差为8.9%和 7 .4%。6.应用滴体积法研究了吴茱英次碱在氯仿溶液一0.5 mol/LN处50;(pH 二11)界面的液一液界面性质，将实验数据与Szyzkowski吸附等温 式进行拟合，求得了吴茱英次碱的界面吸附参数气、n，A，，。。、和界 而吸附自山能△Gad;应用最大z飞泡法测得了吴茱英次碱一氯.仿溶液 的表面，长力，对吴茱英次碱的界“叮和农而性质进行了一讨论，，
林潇[2]2013年在《离子液体双水相萃取分离生物活性物质及其机理的研究》文中研究说明双水相萃取技术是提取和纯化生物活性物质的一种新型分离方法，其操作条件温和、易于放大、且可连续操作。离子液体双水相是基于高聚物双水相发展而来的一种高效温和萃取分离体系。与传统的双水相萃取技术不同，离子液体双水相技术采用亲水性的离子液体（ILs）与无机盐的水溶液进行混合，在水中以较高的浓度溶解后形成互不相溶的两相。它有效地将离子液体与双水相萃取技术的优点相结合，不仅具有无毒、安全、简便、快速的特点，而且溶液酸度和溶解度可调、不易乳化、界面更为清晰等。此外，该技术还具有在萃取过程中保持生物物质的活性和构象的优势。几年来，离子液体双水相越来越受到人们的关注。本研究分别以小分子物质中药罗布麻中的金丝桃苷和异槲皮苷和大分子物质蛋白质为研究对象，将离子液体双水相技术应用于生物活性物质的萃取分离并对其萃取机理展开了研究，以期为生物活性物质的预处理工作提供理论依据。具体内容如下：1、离子液体微波辅助萃取结合双水相提取中药中的金丝桃苷和异槲皮苷将离子液体微波辅助萃取与双水相技术相结合萃取富集中药罗布麻中的金丝桃苷和异槲皮苷，并对其机理进行了研究。通过单因素实验和正交实验对金丝桃苷和异槲皮苷提取富集工艺进行了优化，得到最佳萃取富集条件为：0.2g/mL的[bmim][BF_4]溶液作为萃取溶液，在固液比0.02g/mL，萃取温度60oC条件下，对中药罗布麻萃取10min。提取液加入盐NaH_2PO_4后中药罗布麻的提取液将被富集到上相中。使用反相高效液相色谱法检测金丝桃苷和异槲皮苷的含量。使用这种方法萃取富集中药罗布麻的提取液，金丝桃苷和异槲皮苷具有更高的检测限，分别为3.82g/L和3.00g/L，以及较高的提取效率，分别为64%和62%。方法学考察的结果表明：仪器精密度良好，RSD分别为0.75%和0.59%；方法重现性良好，RSD分别为3.2%和2.9%；稳定性很高，RSD分别为0.49%和0.96%。萃取机理研究结果表明：ILs MAE的提取率主要取决于微波过程中对样品微结构的破坏，过长的萃取时间并不利于金丝桃苷和异槲皮苷萃取率的提高。2、离子液体双水相萃取分离蛋白质建立了一种离子液体双水相萃取紫外光谱分析并定量检测蛋白质的方法。本研究分别在277nm、404nm和280nm的检测波长对牛血清白蛋白、牛血红蛋白和溶菌酶进行紫外检测。咪唑类离子液体的萃取效果优于胍类和吗啉类离子液体，并且咪唑类离子液体的烷基链越长越有利于蛋白质的萃取。选用3.0mmol[omim][Br]，55%K_2HPO_4盐溶液，10mg/mL的样品加入量，在最佳pH值处升温至45oC，提取10min可得到最佳的萃取效率。双水相提取后牛血清白蛋白、牛血红蛋白和溶菌酶的回收率分别为96.90%（RSD=2.8%）、97.83%（RSD=2.9%）和97.14%（RSD=2.4%）。所拟方法回收率、重现性均较好，且适用于牛血清白蛋白和牛血红蛋白混合样品的检测，为蛋白质分离提取提供了一种新思路。3、离子液体双水相萃取分离蛋白质的机理研究为了进一步对提取蛋白质的机理进行研究，首先使用了紫外光谱分析牛血清白蛋白、牛血红蛋白、溶菌酶和胰蛋白酶萃取前后的结构，发现双水相的萃取后蛋白质的结构并未发生显着变化。使用胰蛋白酶考察萃取温度和保存温度对活性的影响。离子液体双水相在大于45oC的条件下保存2h，温度越高，双水相体系上相萃取液颜色越深，蛋白质的结构将发生变化。离子液体双水相体系[omim][Br]/K_2HPO_4采用常温萃取后保存的方法更利于胰蛋白酶发挥作用。之后测定[omim][Br]水溶液的电导率，确定了[omim][Br]/K_2HPO_4的临近簇集浓度（CAC）约为0.07g/mL。使用动态光散射仪和透射电镜对比双水相萃取前后富离子液体相中的簇集现象。研究表明：在双水相体系中加入牛血清白蛋白，形成了粒径在300600nm的簇集体。这种簇集体的动态光散射强度大于离子液体聚集体，从而说明蛋白质能与离子液体形成新的簇集体，有利于萃取分离。
李峰[3]2017年在《藤茶中抗氧化活性物质的提取及其二氢杨梅素生理活性分析》文中指出藤茶系我国南方特有茶、药两用植物,富含二氢杨梅素等黄酮类化合物,具有显着的抗氧化、抗肿瘤和降血脂活性,值得深入研究。本文建立五个抗氧化活性评价指标,用以评价响应面设计法优化的藤茶中抗氧化活性物质的超声强化提取工艺,并采用超声辅助双水相提取方法优化藤茶中指标性成分——二氢杨梅素的提取工艺;系统分析了二氢杨梅素体内外抗氧化及抑制肿瘤细胞增殖活性,并探讨了过渡金属Cu2+在二氢杨梅素抑制肝癌细胞HepG2增殖中的作用:二氢杨梅素-Cu2+体系的促氧化活性是诱导HepG2细胞凋亡的主要机制。研究结果为藤茶在食品、医药领域中的应用提供了理论依据。主要研究内容如下:(1)藤茶中抗氧化活性物质的提取以总多酚、二氢杨梅素得率,Fe2+、Trolox当量为指标,通过单因素及响应面设计法,确定了对抗氧化活性指标影响显着的叁个因素(乙醇质量分数、超声提取温度和提取时间),建立了抗氧化指标与叁个因素间的数学模型,并得出藤茶中抗氧化活性物质的最佳提取工艺参数为:乙醇质量分数67%～68%,超声提取温度45～48 ℃,时间27～28 min,料液比25 mL·g-1。在此优化工艺下藤茶多酚得率为 358.4 ±4.9 mg·g-1,二氢杨梅素得率 315.6±6.2 mg·g-1,Fe2+ 当量为 570.6 ±7.8μmol·g-1,Trolox 当量为 14.9 ± 0.55 mmol·g-1 (ABTS 法)和 12.1 ± 0.68 mmol·g-1 (DPPH法)。(2)藤茶中二氢杨梅素的双水相提取及富集建立硫酸铵-乙醇双水相超声辅助提取体系用于藤茶中二氢杨梅素的提取。通过单因素试验及响应面分析法,得出二氢杨梅素的最佳提取工艺参数为:硫酸铵质量分数26.96%,乙醇质量分数21.84%,提取温度51 ℃,二氢杨梅素得率为360.4 ±5.8 mg·g-1;硫酸铵质量分数27.30 %,乙醇质量分数23.08%,提取温度50。℃,二氢杨梅素在两相间的分配系数为18.9 ± 1.1。首次尝试制备富氮多孔磁性纳米材料N-g-C3N4-MnFe204用于双水相下相残留二氢杨梅素的富集,获得了初步富集工艺:在初始二氢杨梅素浓度20μg·g-1, pH 5.5,硫酸铵质量分数4.0 %,萃取温度为25 ℃条件下,N-g-C3N4-MnFe2O4对二氢杨梅素吸附量可达到5.36mg·g-1,通过一次萃取,可富集75.4 %的二氢杨梅素,显现了一定的应用价值。(3)二氢杨梅素体内外抗氧化活性分析采用体外试验方法,对二氢杨梅素在生理性羟基、亚硝基和超氧阴离子自由基清除,非生理性DPPH、ABTS'+ DMPD·+自由基清除,总抗氧化能力、还原能力以及对过渡金属离子还原、螯合等方面的抗氧化活性进行了系统研究。结果显示:二氢杨梅素具有很强的抗氧化活性,并呈现良好的剂量效应关系,其抗氧化能力相当或略低于阳性对照Vc,但对金属离子的螯合能力较弱。采用D-半乳糖所致小鼠衰老模型,分析了二氢杨梅素对衰老模小鼠体内各抗氧化活性酶表达水平的影响。结果显示:二氢杨梅素能够剂量依赖性地提高衰老小鼠各脏器指数,提高衰老小鼠体内各抗氧化酶表达水平,降低脂质过氧化水平。(4)二氢杨梅素体外抗肿瘤活性研究了二氢杨梅素对肿瘤细胞的增殖抑制活性,结果显示:二氢杨梅素对结肠癌HCT116和肝癌HepG2两种肿瘤细胞的抑制活性较强,对肺癌A549细胞抑制活性较弱。二氢杨梅素对HepG2肿瘤细胞呈现剂量-时间-依赖性抑制活性,Cu2+能够增强二氢杨梅素的抗HepG2活性。进一步采用Hoechst 33342染色、Annexin V/PI双染色、DCFH-DA探针、Western Blot等方法对二氢杨梅素作用后的HepG2肿瘤细胞进行了细胞形态、细胞凋亡、细胞周期、细胞内ROS水平及凋亡蛋白表达等的分析。结果显示,二氢杨梅素-Cu2+体系促氧化作用产生的活性氧能经由线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡。建立了二氢杨梅素-Cu2+体系体外促氧化活性分析方法,揭示了在酸性条件下二氢杨梅素更容易将Cu2+还原为Cu+,进而产生羟基自由基将DNA和蛋白质氧化。实验结果对于揭示二氢杨梅素促氧化活性抗肿瘤作用机制以及开发研制新型高效、低毒的抗肿瘤保健食品与药物具有重要的理论和实际意义。
崔美林[4]2015年在《基于液体发酵的高叁萜灵芝菌生物转化大豆异黄酮及其抑制肿瘤活性研究》文中提出灵芝Ganoderma lucidum [(Leyss.ex.Fr.) Karst]是一种珍贵的药用真菌,其作为药物在我国已有2000多年的历史,本文以高产叁萜灵芝菌株为研究对象,研究内容包括：灵芝酸成分的初步鉴定,灵芝转化大豆异黄酮及其转化产物的抗癌活性和机理。对5株供试灵芝菌株进行菌株筛选得到最优菌株为美国灵芝,其菌丝生物量、胞内叁萜、胞内多糖、胞外多糖、和胞外叁萜产量分别可达1.22±0.03g/100ml, 39.29±0.25mg/100ml,23.44±0.76mg/100ml,11.50±0.74mg/ml,14.24±0.55 mg/ml;对其进行菌种鉴定,基于ITS序列分析,该菌株鉴定为赤芝(G. lucidum),是可以用于保健食品的灵芝菌种,具备食用安全性；进而对美国灵芝液体发酵培养基及培养条件进行优化,结果显示,灵芝菌丝接种到种子液中生长8d后,按接种量10%(v/v)接种于优化后的发酵培养基(麦芽汁4.10%,酵母浸出粉1.8%,KH2PO4 0.3%, MgSO4 0.15%, VB1 0.005%, pH 5.40),于180rpm,28℃,培养7d,可使灵芝菌丝生物量和胞内叁萜产量达到最高。此外,本文按照European Brewery Cenvention (EBC)方法制备麦芽汁,将其应用于灵芝液体发酵以提高灵芝叁萜产量,至今未见报道。经HPLC-ESI-MS初步鉴定,结果显示灵芝菌丝中含有的10种灵芝酸为：Ganolucidic acid A, Ganoderic acid A, Ganoderenic acid B, Elfvingic acid A, Ganoderic acid F,7,15-dihydroxy-4,4,14-trimethyl-3,11-dioxochol-8-en-24-oic acid, Lucidenic acid C,3β-hydroxy-4,4,14-trimethyl-7,11,15-trioxochol-8-en-24-oic acid, Ganoderic acid H,3,7,15-trihydroxy-4,4,14-trimethyl-11-oxo-chol-8-en-24-oic acid。此外,灵芝在液体发酵过程中可以有效的富集氨基酸,尤其是人体必需氨基酸,同时还可富集微量元素,但对各元素的富集能力各有不同。将含有菌丝体的灵芝发酵液匀浆,以β-葡萄糖苷酶酶活为1.0U/ml的灵芝匀浆液100ml(pH=5)作为转化反应液,加入5g大豆异黄酮粗提物,于60℃下转化48h,得到大豆苷元及染料木素转化率分别为96.63%,87.82%。利用富集了生物活性物质的灵芝匀浆液转化大豆异黄酮至今尚未见报道。测定转化产物抗氧化能力,随着底物浓度(0.5-10mg/ml)增加,转化产物(TSI)、转化前(SI)溶液各抗氧化指标均随之上升,并且在相同底物浓度下,TSI溶液抑制羟自由基能力(底物浓度<6mg/ml)、DPPH清除能力、SOD酶活及T-AOC均高于SI溶液。分别经30%、50%、75%(v/v)乙醇浸提灵芝转化大豆异黄酮产物得到TSI-1、 TSI-2、TSI-3提取液。经MTT法检测,TSI-1 (120μg/ml), TSI-2 (100μg/ml), TSI-3 (60μg/ml)对细胞HTL9, MCF-7, HepG2的增殖均有显着的抑制作用,且都可以促进细胞凋亡,其中,TSI-2 (100μg/ml)对细胞HTL9凋亡影响最为显着,晚凋细胞由8.27%增至40.13%,早凋细胞由0.95%增至9.05%。此外,经TSI-2 (100μg/ml)处理后,细胞HTL9、MCF-7被阻滞于G1期,HepG2被阻滞在S期,无法进行分裂而诱导凋亡。细胞HTL9经TSI(100μg/ml)处理后,细胞中Bax相对含量增加,Bcl-2/Bax比值下降,同时Cyto-C蛋白表达含量显着增加,激活Caspase-3, Caspase-8使其含量增加,由此可说明TSI主要是通过线粒体途径诱导细胞凋亡的。此外,抗凋亡因子Survivin相对表达量、NF-κB蛋白含量显着降低,而促凋亡p53的相对表达量增加。结果表明,TSI(100μg/ml)可通过对多个与凋亡相关基因的调控,来诱导细胞HTL9凋亡。
陈亮[5]2007年在《芹菜黄酮类物质提取与富集工艺研究》文中指出本文用分光光度法测定了不同地方芹菜品种中黄酮含量，通过正交试验优化了乙醇回流提取和超声波提取芹菜中黄酮的工艺，对利用大孔树脂富集芹菜黄酮的工艺进行了探讨，采用颜色反应、色谱检测和光谱扫描等方法对富集后的芹菜黄酮类物质进行了初步分析，主要研究内容和试验结果如下：1．采用Al(NO_3)_3络合分光光度法测定芹菜总黄酮(以芦丁为对照品)，其标准曲线方程：C=0.9967A+0.0178，R~2=0.992。采用该方法分别测定了湖南14个地方芹菜品种的叶与茎中黄酮含量，试验结果表明，张家界野芹菜叶黄酮含量最高，为20.350mg／g，邵阳实芹茎黄酮含量最低，只有1.39 mg／g，两种芹菜叶黄酮含量差距达14倍之多；芹菜叶的黄酮含量远高于芹菜茎的黄酮含量，一般芹菜叶的黄酮含量是茎含量的3～5倍。2．通过比较甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿五种有机种溶剂的芹菜黄酮提取效率，选择乙醇为提取溶剂；以乙醇为溶剂回流提取芹菜黄酮的最佳工艺条件为：在80℃下以1∶5的物料比用70％乙醇浓度提取30min，重复提取一次；以乙醇为溶剂超声提取芹菜中黄酮的最佳工艺条件为：以1∶25的物料比用50％的乙醇提取9min，重复提取一次。3．通过比较D101、AB-8、XDA-1、HP-20、H3250、NKA-9六种大孔树脂对芹菜黄酮的静态吸附量和解吸率，选择了XDA-1树脂对芹菜黄酮进行富集；XDA-1树脂动态吸附与解吸最佳工艺条件为：以2BV／h的流速上样后用8BV的水洗去杂质，然后用4BV 70％的乙醇以2BV／h洗脱。当粗提物中黄酮含量为1.25％时，XDA-1树脂对芹菜黄酮的富集倍数为8.416倍。4．采用颜色反应、硅胶薄层色谱、高效液相色谱和光谱扫描对芹菜黄酮进行初步分析，试验证明芹菜粗黄酮的主要成分为芹菜素(苷)。用氯仿-甲醇-水(18∶2.3∶0.35)能将芹菜粗黄酮在硅胶薄层板上较好的展开，用扫描法能够测定芹菜粗黄酮中芹菜素的含量，试验得出芹菜素含量与峰面积的回归方程为：y=15138x+7594.8，R~2=0.993，线性范围：0.332ug～0.996ug／斑点，该方法测得富集后产品中芹菜素含量为48.6 mg／g。
白凤霞[6]2008年在《螺旋藻变异株生物活性物质的研究》文中提出本文对螺旋藻的培养优化及其生物活性物质进行了研究。以提高螺旋藻直线型变异株Sp-Dz胞内活性物质的含量为目的,对影响Sp-Dz生长及胞内藻蓝蛋白和多糖含量的各理化因子进行了系统的探讨,并研究了螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的抗肿瘤、抗氧化活性。主要结果如下:1、通过螺旋藻变异株Sp-Dz的培养及培养条件的优化,确定了Sp-Dz的适宜培养条件为:接种密度0.2(OD560),光强3500lux,温度25℃,初始pH值10.0,以尿素为氮源添加量为0.8g/L。2、通过对影响螺旋藻变异株Sp-Dz藻蓝蛋白和多糖含量理化因子的研究表明,当温度25℃、光强3500lux、初始pH 9.5、尿素用量0.8g/L、葡萄糖添加量2.0g/L时,藻蓝蛋白含量最高;当温度30℃、光强4500lux、初始pH 9.5、尿素用量0.4g/L、葡萄糖添加量2.0g/L时,多糖含量最高。3、采用DEAE-Sepharose Fast Flow、SDS-PAGE凝胶电泳、紫外-可见光谱、红外光谱等对藻蓝蛋白及多糖产品进行分析,结果显示:藻蓝蛋白纯度(OD620/OD280)为3.74,与试剂级4.0接近,亚基分子量为35.9kDa,最大紫外吸收位于620nm处,二级结构主要以α-螺旋结构为主;螺旋藻多糖组成单糖为吡喃糖,成苷的半缩醛羟基主要为α-构型。4、藻蓝蛋白对DPPH自由基和·OH自由基均有一定清除作用,且对DPPH自由基的清除率可高达77%;而多糖对DPPH自由基和·OH自由基的清除效果比较差。多糖和藻蓝蛋白对肿瘤细胞都均有一定抑制效果,其中藻蓝蛋白对BEL-7402抑制效果最强,当其浓度为400ug/mL时,抑制率可达31%,而多糖对HL-60抑制效果最好,在同样浓度下,抑制率可达51%。
廖云莉[7]2014年在《海洋微生物小分子代谢产物提取制备工艺研究》文中认为本论文主要是以海洋微生物发酵液为研究对象,探索海洋微生物小分了代谢产物高效率、高通量的提取和制备分离方法,建立海洋微生物小分子代谢产物馏分库以供活性药物的初步筛选,为最终建立海洋微生物小分子代谢产物活性化合物库奠定基础。具体内容如下：第一：为提高过滤速率,对海洋细菌和放线菌发酵液进行预处理研究,主要以海洋细菌发酵液为研究对象,采用絮凝技术对发酵液进行预处理。以610nm透光率、蛋白去除率、多糖去除率、过滤速度等为指标,从8种不同类型的絮凝剂中筛选出适合的絮凝剂,通过HPLC分析比较了两种絮凝剂对发酵液中小分子代谢产物提取的影响,并探讨了所筛选絮凝剂的使用条件。比较了4种固液分离方法对细菌发酵液的分离效果,进而确定了适合海洋细菌发酵液快速预处理的工艺。结果表明：硫酸铝耦合膜超滤法絮凝速度快、蛋白多糖去除率高、滤液澄清度好,不会造成粗提物中铝离子的残留量增加,适用于大部分海洋细菌发酵液的预处理。最佳使用pH值为6,在25℃-45℃之间温度对其影响不大,发酵液中蛋白含量与硫酸铝用量存在一定的关系。通过验证,此法对放线菌发酵液预处理也是适宜的。第二：以提取质量和HPLC指纹图谱为依据,对3类不同类型的13种大孔吸附树脂进行了筛选,以及组合搭配,通过质谱分析探究将筛选出的3种不同类型的树脂串联吸附是否具有优势,最后以254nm吸光值变化趋势和HPLC跟踪分析对串联树脂的吸附以及解吸条件进行了初步探索。结果表明：将非极性大孔吸附树脂DM11,中极性树脂HPD400和极性树脂SD3003种不同类型的树脂串联,可以尽可能多的吸附发酵液中的小分子代谢产物,并可以节约树脂用量。DM11:HPD400:SD300较适宜的搭配比例约为2：2：3；确定的吸附条件为：吸附温度为5℃,吸附pH值为5,上样流速为4BV/h时较适宜,放线菌上样量约为10BV,细菌约为32BV。确定的洗脱条件为：初步分段梯度点的甲醇水比例约为50：50；洗脱体积为水洗2BV、20%甲醇洗2BV、50%甲醇洗1.8BV、纯甲醇洗2BV；洗脱流速为1.5BV/h较适宜。第3：以分离度与分辨率为依据,从易分离极性化合物的四种高效液相分析色谱中筛选出了适宜的色谱柱,并对所筛选色谱柱的梯度条件进行了优化。结果表明：柱4(NMU C18,4.6×250mm,5μ)适合分离海洋微生物发酵液粗提物,采用梯度条件3能较好的兼顾极性部分与非极性部分化合物的分离。并采用HPLC-PDA-ELSD和UPLC-PDA-Q-TOFMS两套分析检测系统分别对粗提物进行指纹图谱表征,给出尽可能多的物化信息。第四：以色谱峰的可重现性、色谱柱装填的可重复性以及色谱峰的分离度和峰形为指导依据,对干法与湿法两种制备柱装填方法的柱效进行了考察；以尿嘧啶、硝基苯和芴3种标准品对分析柱和制备柱进行柱效评价,对分析条件与制备条件的转化进行了初步探究；以发酵液粗提物为对象考察了26×460mm制备柱的上样量；最后对分段制备是否可解决分离度的问题做了初步的考察。结果表明：制备柱采用干法装填的效果比较好；26×460mm的制备柱适宜的流速为40mL/min,起始梯度有机溶剂比例相对分析条件极性部分需下调5%-10%,非极性部分约下调5%,梯度运行时间可根据公式4-4进行转化；为保证一定的分离度,粗提物的上样量不超过3g比较适宜。
袁军[8]2016年在《解淀粉芽孢杆菌NJN-6拮抗物质的分离鉴定及对土壤微生物区系的影响研究》文中进行了进一步梳理土传枯萎病是由土传病原菌引起的毁灭性作物病害,严重制约着经济作物的生产。近年来,生物措施在土传病害的防控方面发挥着越来越重要的作用。本实验室从香蕉园发病区的健康植株根际分离得到了一株解淀粉芽孢杆菌NJN-6 (以下均简写为NJN-6),该菌株在实验室条件下能强烈抑制香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌和番茄青枯病茄科劳尔氏菌的生长,并且在盆栽和大田试验中均表现出显着的促生和生防效果,但是其作用机理尚不清楚。本研究以NJN-6为供试菌株,分离鉴定其拮抗尖孢镰刀菌和茄科劳尔氏菌的活性物质,研究该菌株在香蕉的根际定殖能力以及利用香蕉根系分泌物生产拮抗物质的能力,然后采用高通量测序和定量PCR技术研究外源添加拮抗物质对土壤微生物区系的影响。得到了如下主要结果:1.利用正丁醇从NJN-6的发酵液中萃取得到iturin A类拮抗物质,通过高效液相色谱(HPLC)结合标准物质的保留时间定性鉴定出叁种iturinA物质的存在。然后,利用HPLC/ESI-MS证明这叁种物质的分子量分别为1043、1057和1071 Da,与叁种iturin A标准品的分子量一致。利用大孔吸附树脂XAD-16,从NJN-6的发酵液中富集有效活性物质,通过HPLC结合自动馏分收集器分离得到五种活性物质。其中两种物质具有拮抗香蕉病原菌的作用,且被证明是分子量分别为1030 Da (C14)和1044 Da (C15)的bacillomycinD。另外叁种物质能够拮抗番茄青枯病病原菌,且被证明分子量是分别为402、487 和 502 Da 的 macrolactin A、7-O-malonyl macrolactin A 和 7-O-succinyl macrolactinA。分离鉴定出的八种拮抗物质中,五种能够抑制真菌的生长,叁种能抑制细菌的生长。2.构建了一种环保、快速、便捷的双水相体系:乙醇-硫酸铵系统。利用该系统从NJN-6菌株的发酵液中萃取得到iturin A,随后用HPLC对iturin A进行了定量分析。通过优化萃取体系的pH得到了 95%以上的萃取回收率,通过优化HPLC分析的柱温得到了较好的分离效果。该检测方法中iturin A出峰时间和峰面积的相对标准偏差分别在1.29%和1.45%。整个萃取和检测过程用时短、操作便捷,是一种快速定量发酵液中活性物质的定量方法。3.菌株NJN-6不仅能够分泌水溶性的拮抗物质,以便抑制病原菌的生长,而且还能在较远距离对尖孢镰刀菌产生抑制作用(超出水溶性物质的有效扩散范围),甚至在有物理阻隔完全切断水溶性物质交流的情况下(分隔平板中)仍表现出较强的抑制作用,表明NJN-6能够分泌挥发性的抑菌物质。在分隔平板实验中,NJN-6产生的挥发性物质能够抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长和孢子的萌发,其抑制效率达到了 35%。甚至能够显着地降低土壤中尖孢镰刀菌的孢子浓度,处理35天后,与对照相比,土壤中尖孢镰刀菌孢子的浓度降低了 1个数量级。利用固相微萃取对NJN-6产生的挥发性有机物进行有效富集,然后利用气相色谱-质谱(GC-MS )对挥发性物质进行鉴定。鉴定出的36种小分子的挥发性物质包含12种芳香类、7种烷烃类、3种醇类、7种酮类、2种烯烃类、3种萘酚类、1种酯类和1种醚类。通过纯品验证结果显示,有11种物质能够完全抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长;另外7种物质显示出了较好的抑制效果(抑制率>80%);其余18种物质的抑制效果在6.12%和78.8%之间。鉴定出的这些物质及其良好的对尖孢镰刀菌的抑制效果表明了挥发性物质的分泌在NJN-6菌株拮抗尖孢镰刀菌过程中起重要作用。4.通过纯培养条件下,利用扫描电镜对NJN-6的生物膜形成和根际定殖能力进行测试,表明NJN-6具有在香蕉根际良好的定殖能力。采用根系分泌物作为基础培养基对NJN-6振荡培养后,对其发酵液进行液质联用检测,发现NJN-6能利用根系分泌物产生脂肽类拮抗物质和植物类激素促生物质;同时,该菌株在根系分泌物存在的条件下,其产拮抗物质基因和生物膜形成基因均上调表达。综合两方面的结果表明,NJN-6菌株能够在根际定殖,并且利用根系分泌物生存繁殖并且产生活性物质。5. Macrolactin是一类抗菌效果极佳的细菌生长抑制剂。然而,其对土壤中细菌群落结构以及土壤中本身产macrolactin基因丰度的影响尚不清楚,本实验通过外源添加从NJN-6发酵液中分离出的macrolactin类物质到土壤后,研究其对土壤细菌群落的影响。经过四周的处理,表明macrolactin类物质能显着地降低细菌群落的生态多样性和大多数类群的相对丰度。但变形菌门,尤其是伯克氏菌属、Dyella属和Rhodanobacter属的相对丰度和绝对丰度不但没有减少,反正有不同程度的增加。文献报道,这叁个属的菌均有降解农业化学品的作用。同时,macrolactin类物质的添加致使土壤本身产macrolactin类物质的polyketide synthase (PKS )基因丰度显着下降。6.脂肽作为一大类抗真菌物质,具有显着抑制真菌菌丝生长和孢子萌发的作用。同样,其对土壤真菌群落以及土壤中产脂肽基因丰度的影响并无相关报道。本文通过外源添加从NJN-6发酵液中分离获得的脂肽类物质到土壤后,研究其对土壤真菌群落的影响。结果表明微生物源的抗真菌物质-脂肽类物质的施入能显着地降低真菌的丰度和真菌群落的多样性,而木质素降解相关真菌类群(毛孢子菌属和隐球菌属)的相对丰度在外源添加脂肽物质后显着增加。同时,土壤自身中产拮抗物质的Non-ribosomal peptides synthase (NRPS)基因丰度随着脂肽类物质的加入而显着降低。证明微生物源的抗真菌物质和化学合成的农业杀真菌剂一样能够改变土壤真菌的群落结构,广谱性的杀灭有益菌和病原菌。而土壤本土拮抗物质的基因丰度也因为外源拮抗物质的加入而发生显着的变化。这些结果将对后续微生物源拮抗物质的大田使用提供相关参考。7.采用分隔平板(一边培养菌株,一边放置土壤)培养NJN-6实时产生得到挥发性有机物质,以此衡量其对土壤微生物的群落结构和组成以及部分功能基因产生的影响。结果表明挥发性有机物对土壤总细菌丰度具有增加作用,而对土壤总真菌丰度具有降低作用。高通量测序表明挥发性有机物显着地降低了土壤细菌和真菌群落结构的alpha多样性。另外,挥发性物质还对土壤微生物产生的两种主要拮抗物质的相关基因-PKS和NRPS产生显着地抑制作用,同时降低了参与氮循环过程中的AOA、nifH和nirS的基因丰度,增加了 AOB的基因丰度。结论:解淀粉芽孢杆菌NJN-6能够产生大量拮抗土传枯萎病原菌和拮抗番茄青枯病病原菌的物质,是一株防控土传病害的良好生防菌;能够利用根系分泌物在根际定殖和分泌活性物质,而这些具有抗菌作用的微生物源拮抗物质会显着影响土壤微生物群落组成,说明通过施用生防菌,能够显着影响土壤微生物区系,实现调控土壤微生物区系的目的。
尹亚琳[9]2014年在《大型真菌蛋白研究及应用》文中认为第一部分：北虫草菌丝、子实体的转录组和蛋白组分析冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是中国传统的药用真菌,是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,许多研究证明其有抗肿瘤和免疫调节等生理作用。天然的虫草稀少且昂贵,资源也日益枯竭。北虫草(Cordyceps militaris)是虫草属的另一种虫、菌结合的药用真菌,活性成分与冬虫夏草类似,其己经被成功的进行了人工栽培并作为天然虫草的替代品被广泛接受。但是除了虫草素、虫草酸和虫草多糖等常见的活性组分,对北虫草中其他药用组分特别是蛋白组分的研究较少。本研究从转录和翻译水平对不同发育阶段的人工培养北虫草进行了系统的分子学研究,以期待发现活性蛋白质／多肽成分。我们对人工培养的北虫草的菌丝及子实体进行了高通量的Illumina测序并进行转录组数据分析。将得到的clean reads与己知的北虫草基因组进行比对并进行序列随机性评估和覆盖率统计,结果显示约有90%的clean reads能比对到北虫草基因组上,且reads在基因个部位的分布均匀,基因覆盖率大于90%,表明测序以及比对结果都较好。我们预测了共738个可变剪接事件以及不同时期的约3000个新的转录本,该预测丰富了北虫草的数据库。对北虫草不同发育时期基因表达差异分析表明,共有2113个基因在菌丝时期高表达,有599个在子实体时期高表达。将这些差异表达基因进行功能注释分析(GO, KEGG),发现与细胞内核酸结合及代谢、转录调控等活动在菌丝时期较为活跃：而糖水化合物代谢,信号转导等活动在子实体时期更为活跃。这都与北虫草的发育需要相关。另外,我们通过对预测的虫草素代谢途径进行深入分析证明菌丝时期此代谢途径更为活跃,这为虫草素的生产优化提供了数据支持。我们利用一维凝胶电泳技术、高效液相色谱与质谱结合技术对北虫草的菌丝及子实体进行了蛋白质组的测序。在菌丝和子实体中分别鉴定了359和214个蛋白,进行功能注释分析(GO, KEGG, COG)后发现与转录组相似的规律,验证了转录组数据。另外,我们分析了其中值得关注的一些蛋白质,包括凝集素,超氧化物歧化酶,与虫草素代谢途径相关的酶等,为进一步研究北虫草蛋白提供了重要数据信息。根据北虫草蛋白组数据,我们从北虫草菌丝或是子实体中进行基因克隆后原核表达了叁个蛋白质RicinB-related lectin (CCM_03832), ConA-like lectin (CCM_03227)和Superoxide dismutase (CCM_04979)o对它们进行生物活性分析,发现RicinB-related lectin (CCM_03832)有一定的凝血活性,RicinB-related lectin(CCM_03832)和ConA-like lectin (CCM_03227)能抑制HepG2细胞增殖,这叁种蛋白都能刺激小鼠脾脏淋巴细胞的激活。另外我们利用蛋白质分离技术从北虫草子实体中天然纯化了叁种蛋白CM-1, CM-2, CM-3,并通过质谱技术在北虫草数据库中找到其对应序列,其生物活性也正在研究中。第二部分：杨树菇凝集素2,AAL-2(Agrocybe aegerita Lectin2)用于富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段及其检测方法研究O-GlcNAc修饰是非常重要的蛋白翻译后修饰,它与磷酸化,泛素化,甲基化等一系列蛋白修饰相互作用,共同调节细胞的各种生理活动并参与多种疾病的发生发展过程。但是O-GlcNAc修饰的富集与鉴定是该领域的瓶颈问题。我们研究组从大型真菌杨树菇(Agrocybe aegerita)分离到一种新的凝集素AAL-2,通过糖谱鉴定发现其对GlcNAc具有极高的亲和力和特异性,要远远高于常用于O-GlcNAc修饰肽段富集的麦胚凝集素WGA。本研究中我们用AAL-2分别对简单标准肽段样品以及一个具有O-GlcNAc修饰的阳性蛋白进行O-GlcNAc修饰肽段的富集,并通过MALDI-MS检测到了阳性肽段,证明AAL-2能有效富集简单样品中的O-GlcNAc修饰肽段。进一步,我们采用不同的层析方法对复杂样品的肽段和蛋白进行了富集分析：对复杂肽段(包括B16-BL6细胞质蛋白酶解肽段,糖尿病大鼠肝脏蛋白酶解肽段)进行富集,LC-MS/MS检测结果表明O-GlcNAc修饰肽段在穿透尾部富集；对复杂蛋白(正常及糖尿病大鼠肝脏蛋白)进行富集,western和LC-MS/MS (CID)结果均表明,O-GlcNAc修饰蛋白对Sepharose4B-AAL2有更高的亲和力,从而在洗脱峰中被富集。最后利用LC-MS/MS (ETD)技术从B16-BL6细胞质样品中鉴定到79个O-GlcNAc修饰蛋白(73个在穿透尾部检测到,9个在洗脱中检测到,其中有3个在两部分中均能检测到),共123个O-GlcNAc修饰位点(111个在穿透尾部检测到,13个在洗脱中检测到,其中有1个位点在两部分中均能检测到)。另外从糖尿病大鼠肝脏中检测到99个O-GlcNAc修饰蛋白,共119个修饰位点,从普通大鼠肝脏中检测到66个O-GlcNAc修饰蛋白,共82个修饰位点。这些结果还需要进一步的实验验证,本实验初步建立了AAL-2富集O-GlcNAc修饰蛋白／肽段的方法。
王超萍[10]2011年在《石榴花活性物质提取分离技术研究》文中研究表明石榴花含有多酚类、黄酮类、叁萜类等多种化合物,这些化合物具有诸多功效,如软化血管、生津化食、止泻、止痒、解毒、降温、抗胃酸过多等,近些年来,人们又发现石榴花具有抗氧化、抗糖尿病和护肝等多种功效,石榴花是一种极具研究和开发价值的天然植物资源。本课题以石榴花为原料,经干燥、粉碎、研磨,采用酶合超声提取技术,通过响应面优化法确定最佳提取工艺参数,从而最大限度提取出叁类活性物质,然后经薄层层析和紫外分光光度法测其含量,再用大孔吸附树脂将活性物质进行分离纯化,最终研究结果如下:1.以单因素试验为基础研究酶解过程中酶添加量、酶解时间、乙醇浓度、超声频率以及超声时间对活性物质提取率的影响,并利用Minitab15中文软件响应面分析法进行优化,确定最佳的工艺条件为:酶添加量为0.05g,酶解时间为60min,乙醇浓度为80%,超声频率为36kHz,超声时间为20min。2.采用薄层层析及紫外分光光度法测定石榴花中叁类活性物质的含量。将样品与对照品进行薄层层析分离并用紫外分光光度法测定各种条件下多酚类、黄酮类及叁萜类叁类化合物的吸光度,以确定最佳提取条件下各化合物的含量。通过薄层层析分离,确定了体积比为6:8:4:2的氯仿、乙酸乙酯、甲醇、甲酸为最佳展开剂;通过紫外分光光度法测定含量并结合所做正交试验的结果,确定了在此最佳实验条件下提取出多酚类、黄酮类及叁萜类化合物的含量分别为58.6mg/g、68.1mg/g、11.0mg/g。3.通过静态吸附试验从十二种大孔吸附树脂中筛选出HPD-600型、AB-8型、D-101型叁种吸附量大、解吸率高的大孔吸附树脂分别对多酚类、黄酮类及叁萜类叁类活性物质进行分离纯化。通过单因素试验和正交试验研究上样液pH、洗脱剂浓度、上样流速、上样浓度、洗脱剂用量等技术参数,然后采用逐级分离技术对叁种活性物质分别进行纯化富集。结果表明:pH值为6.0,洗脱剂为90%乙醇溶液,上样流速为2.0BV/h,多酚浓度为2.02mg/mL,洗脱剂用量为3.0BV,在此工艺条件下可获得最大的多酚吸附量为93.85mg/g,回收率是80.1%;pH值为6.0,洗脱剂为90%乙醇溶液,上样流速为1.0BV/h,黄酮浓度为1.88mg/mL,洗脱剂用量为2.0BV,在此工艺条件下可获得最大的黄酮吸附量为69.93mg/g,回收率是92.5%;pH值为6.0,洗脱剂为90%乙醇溶液,上样流速为3.0BV/h,叁萜浓度为0.8mg/mL,洗脱剂用量为3.0BV,在此工艺条件下可获得最大的叁萜吸附量为61.57mg/g,回收率是84.2%。
参考文献：
[1]. 生物活性物质提取富集方法研究[D]. 王海波. 湖南师范大学. 2004
[2]. 离子液体双水相萃取分离生物活性物质及其机理的研究[D]. 林潇. 湖南大学. 2013
[3]. 藤茶中抗氧化活性物质的提取及其二氢杨梅素生理活性分析[D]. 李峰. 江苏大学. 2017
[4]. 基于液体发酵的高叁萜灵芝菌生物转化大豆异黄酮及其抑制肿瘤活性研究[D]. 崔美林. 浙江大学. 2015
[5]. 芹菜黄酮类物质提取与富集工艺研究[D]. 陈亮. 湖南农业大学. 2007
[6]. 螺旋藻变异株生物活性物质的研究[D]. 白凤霞. 南京林业大学. 2008
[7]. 海洋微生物小分子代谢产物提取制备工艺研究[D]. 廖云莉. 厦门大学. 2014
[8]. 解淀粉芽孢杆菌NJN-6拮抗物质的分离鉴定及对土壤微生物区系的影响研究[D]. 袁军. 南京农业大学. 2016
[9]. 大型真菌蛋白研究及应用[D]. 尹亚琳. 武汉大学. 2014
[10]. 石榴花活性物质提取分离技术研究[D]. 王超萍. 山东轻工业学院. 2011
标签：化学论文; 二氢杨梅素论文; 灵芝孢子论文; 芹菜素论文; 真菌孢子论文; 土壤检测论文; 土壤结构论文; 杨梅论文; 生物活性论文; 灵芝论文;