张凌娣[1]2004年在《同源序列高剂量异常表达及病毒编码蛋白对基因沉默的作用》文中进行了进一步梳理RNA沉默是生物体中普遍存在的一种由同源序列引起的RNA降解过程，病毒或转座子入侵、以及体内产生的各种异常结构RNA都可能成为诱导RNA沉默发生的因素。为了认识同源性RNA的结构形式和表达剂量对诱发植物基因沉默的影响，以及某些植物病毒编码蛋白对基因沉默的抑制作用，为深入了解植物基因沉默的机制提供更多的资料，本论文就以下内容开展了研究。 分别以低拷贝(pBIN19)和单拷贝(pMW755I5J)的双元载体为骨架，构建了NOS终止子缺失的GFP基因(GFP-ΔTnos)表达载体。采用农杆菌浸润法(agro-infiltration)感染转基因本生烟16C，并对同源基因瞬时表达所引起的植物表型变化、小分子RNA的产生、DNA甲基化程度、以及相关性状在后代中的遗传情况进行了检查。根据发生沉默的时间早晚、发生沉默的植株比例以及程度的观察，发现GFP-ΔTnos载体诱发同源基因沉默的效率明显高于含有完整表达单元的同类载体；低拷贝载体诱发同源基因沉默的效率明显高于含有相同表达单元的单拷贝载体。在发生沉默的植株体内，在GFP蛋白及其RNA被不同程度降解的同时，可以检测到21-26 nt的小分子RNA(siRNA)，同时GFP基因编码区也受到显着地甲基化修饰。这种转录后基因沉默(PTGS)现象可以在植株体内系统传播，但不能遗传给后代。接种野生型本生烟后的RT-PCR结果表明，GFP-ATnos载体瞬时表达所产生的GFP RNA可能没有poly(A)尾序。以上结果表明，同源性基因表达产物的结构形式及其在植物体内的表达剂量是影响PTGS能否发生以及发生程度的两种互相关联的关键因素。 获得了含有GFP-ΔTnos表达载体的转基因本生烟，在部分转基因株系中GFP基因的表达受到抑制。Northern分析显示：GFP-ΔTnos载体所表达的GFP基因产物多数滞留在细胞核内部，不能被运送到细胞质中。 筛选含有单个GFP基因(GFP1)或3个串联重复GFP基因(GFP3)的转基因烟草，获得荧光表型基本一致的纯合株系。用含有GFP基因的PVX病毒载体(PVX-GFP)接种后，GFP3株系对PVX-GFP侵染的抵抗能力明显高于GFP1株系。分子检测结果显示，GFP3植株中普遍存在GFP基因的沉默现象，且GFP DNA的甲基化程度明显高于GFP1植株，说明这些植株对于病毒的抗性与目的基因的插入位点及拷贝数和无关，但与串联重复的GFP基因结构形式密切相关。 将RBSDV S6基因组分和BNYVV RNA2的14kD蛋白基因分别插入经改造的PVX病毒载体，与正常的GFP表达载体共侵染本生烟。表型观察和分子检测表明，S6和14kD基因可以对GFP基因的沉默产生不同程度地抑制作用，且S6对同源基因DNA的甲基化具有抑制功能。S6和14kD都能够逆转由GFP-ΔTnos载体引起的GFP基因沉默，其中S6基因的能力较强。同时，研究了RBSDV其他一些基因组成分对基因沉默的影响，发现编码两个蛋白的S7组分，以及S8组分对GFP基因沉默抑制效果较为明显。
姚雪梅[2]2010年在《凡纳滨对虾Dicer-1基因克隆和表达》文中提出病毒性疾病是当前虾病研究的焦点。基因沉默是一种天然而古老的抗病毒机制,通过沉默同源的病毒基因或与病毒复制有关的宿主细胞基因,在病毒感染的不同时期抑制病毒的复制。Dicer是基因沉默途径中的重要起始酶,负责对病毒复制时产生的dsRNA识别并切割出能引起基因沉默的小分子RNA。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界及我国目前最重要的养殖品种之一,但它的Dicer酶基因的克隆和表达都未见研究。本文采用同源克隆结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从凡纳滨对虾体内克隆获得Dicer-1(命名为LvDcrl)基因,并通过病毒侵染后Dicer-1基因mRNA水平表达量变化及存在的剪切变异体,研究宿主抗病力与该基因mRNA水平的调控关系,以及病毒对基因沉默途径的破坏和干扰机制；通过幼体发育过程中该基因的表达变化,研究基因沉默途径在幼体变态-免疫网络中的作用。克隆获得LvDcrl基因的cDNA全长为7636bp,编码2473个氨基酸,比对结果显示该多肽链包括了Dicer-1的5个保守功能域：解旋酶Helicase、未知功能的结构域DUF283、PAZ (Pinwheel-Argonaut-Zwille)结构域、RNase结构域等5个保守的功能结构域。该基因在凡纳滨对虾的诸多组织均有表达,但在血淋巴内的表达量高于肝胰腺、肌肉组织、肠、脑和鳃等组织。在凡纳滨对虾的幼体发育过程中,LvDcr1的表达呈现阶段性变化。从受精卵至仔虾(P7)期间,都能检测到该基因的表达。从受精卵至破膜而出的无节幼体(N1)期间,其表达量逐渐下降。在对虾幼体发育期间,LvDcr1基因表达量呈现出无节幼体3期>无节幼体1期、糠虾幼体3期>糠虾幼体1期、仔虾幼体7期>仔虾幼体1期的趋势,这意味着同一幼体期间随着变态其免疫器官发育逐渐成熟。从整个发育过程来看,幼体进入仔虾后该基因表达出现一个明显的上升,意味其免疫器官发育接近于成虾。桃拉病毒(Taura syndrom virus, TSV)注射攻毒4h后,对虾血细胞中LvDcr1表达量开始逐渐增加,至8h时达到高峰,为0h表达量的8.77倍,之后逐渐下降,36h基本恢复与对照组一致的水平。鳃组织表达量从注射开始后逐渐增加至24h时达到高峰,此时表达量是对照组的6.74倍,之后至36h表达量逐渐下降至比对照组还要低的水平。该基因在血细胞和鳃组织中的表达明显上调,意味着该基因与抗病毒免疫有关。比较血细胞与鳃组织的时序表达,血细胞中该基因表达高峰值的出现早于鳃组织,并且表达上调更明显。表明血细胞对病毒的反应启动更快,反应强度更大。TSV感染的患病虾与健康虾比较,在带有TSV的个体中LvDcr1的mRNA出现剪接变异。在RNaseⅢ结构域序列中出现未被切割的内含子,而在解旋酶域序列中由于剪接变异出现了长型和短型两种转录本。这两种mRNA的剪切变异均影响该基因正常执行解旋与切割dsRNA的功能,从而抑制基因沉默途径发挥的抗病毒机制。这初步说明病毒也具有干扰基因沉默途径的机制。
郭兴启[3]2001年在《翻译与非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较》文中提出利用来源于病毒本身的基因或核苷酸序列转化植物来获得抗病毒的工程植株，已成为遗传工程中改良作物对病毒病抗性的主要措施之一。利用病毒的外壳蛋白（CP）基因为转基因（transgene）是较为成熟的抗病毒育种策略。但是，一些转病毒CP基因的转基因植物的抗病机制（是RNA介导还是蛋白质介导）目前还有争议。近年来，RNA介导的抗性已成为植物抗病毒基因工程领域研究的热点。本研究以马铃薯Y病毒（PVY~N）为基因源，分别克隆了翻译的PVY~N CP基因和非翻译的PVY~N CP基因，构建了两种植物表达载体，并转化了烟草NC89。对这两种转基因植物进行了抗病性、分子生物学及生物学鉴定和比较。同时，对从山东省内分离的两个PVY病毒分离物进行了初步研究，具体结果如下： 1．根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系（PVY~N）核苷酸序列，设计并合成了两种寡聚核苷酸引物，以PVY~N的RNA为模板，扩增出翻译的PVY~N CP（简称CPN）基因和非翻译的PVY~N CP（简称CPM）基因，将扩增的片段克隆到载体pBSK的BamHI和KpnI之间，并进行了序列测定。分别用BamHI和KpnI从重组克隆载体上将CPM和CPN基因切下，并插入植物表达载体pROKⅡ 35S启动子下游，利用PCR筛选及酶切鉴定得到含CPN的重组克隆pPVYCPN和含CPM的重组克隆pPVYCPM。用叁亲交配法将重组克隆导入根癌农杆菌，分别获得了含pPVYCPN和pPVYCPM质粒的农杆菌菌株，用于普通烟草的转化。 2．将含外源基因的根癌农杆菌与烟草栽培品种NC89叶盘共培养，将再生苗在含卡那霉素的培养基上选择，分别获得经CPN和CPM基因转化的植株277株和245株。对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行分子生物学检测表明，在含有150mg/L卡那霉素的培养基上转CPN和CPM基因的植株分别有95％和98％为Dot-blot阳性植株，即获得了263株含CPN的T_0代转基因烟草和240株含CPM的T_0代转基因烟草。 3．T_0代转基因植株的抗病性分析表明，以PVY~N的病汁液为接种物时，两种类型的转基因烟草对PVY~N的抗病性具有相似性。但同一类型的不同转基因植株对PVY~N的抗性强度不同。我们将其表现型分为叁种类型：高度抗病（植株整个生育期未检测到病毒）、抗病（植株前期未检测到病毒，但在接种20-30天后植株表现轻微症状）和感病（转基因植株与非转基因对照植株的症状相似）。而且高度抗病型的植株占转基因总株 浙 江 大 学 博 士 学 位 论 文数的 8％左右。分别用提纯 PVYN病毒粒体和 PVYN RNA为接种物的实验表明，T。代转基因植株表现的抗病性不受接种物性质及其剂量的影响。表现型为高度抗病的含CPM的 T。代转基因植株对马铃薯 Y病毒普通株系JVY勺的侵染也表现为高度抗病。 4．用单一限制性内切酶酶切TO代转基因植株的总＊NA，并进行Scut昨rn印迹杂交实验，结果表明，目的基因已经整合到烟草染色体上。对部分不同抗性的几代转基因植株所含转基因拷贝数的分析初步证明，这两种转基因植株的抗病性与转基因拷贝数都成正相关。绝大多数高度抗病植株含56个转基因拷贝，抗病植株含34个转基因拷贝，而感病植株一般含1－2个转基因拷贝。 5．T。代转基因植株的Northern印迹杂交证明，这两种类型的CP基因都在RNA水平上得到了表达，并且目的基因的RNA在细胞内的积累量与转基因植株的抗病强度成反相关，即高度抗病型植株内目的基因NA在细胞内积累量较少，感病型植株内目的基因RNA积累量较多，而抗病型的则介于二者之间。 6．TO代转基因植株帅悦em印迹杂交表明，在表达非翻译的P＊／＊P基因的转基因植株内未检测至CP蛋白，而导入翻译的PVYNCP基因的植株内检测至了CP蛋白，但是，PVYN CP蛋白含量与抗病性不存在相关关系。 7．以选择标记卡那霉素基因对卡那霉素的抗性为标记，对部分不同抗性的转基因植株卜代进行分离鉴定，并以PCR进一步证实，结果表明，转基因植株的遗传是复杂的。在所测试的 50株范围内，高度抗病植株的遗传不符合孟德尔的 3：1和 15：1的分离规律；抗病植株的遗传有的符合15：1的分离规律，但多数不符合。分子分析表明，外源基因在转基因植株乃代中能够遗传，并且在NA水平上正常表达。 8．从山东省种植的烟草和马铃薯上获得了PVY病毒的两个分离物，分别为PVY－T和 PVYP，实验初步表明 PVY－T属于 PVY“株系，PVYF属于 PVY”株系。两者在生物学特性及其侵染寄主导致的细胞病变差异，可作为区别PVY不同株系的依据。
唐兆前[4]2010年在《卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究》文中认为卵巢上皮癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。手术后,以铂类为基础的联合化疗是其主要的治疗方法。但随着化疗的进行,患者最终获得难以治愈的多药耐药,因而其五年生存率一直徘徊在30-50%。为了更好地认识肿瘤抑制基因在卵巢癌多药耐药中的机制,我们对卵巢癌卡铂耐药基因差异表达谱芯片进行了肿瘤抑制基因的筛选及验证,对相关的肿瘤抑制基因启动子区进行了甲基化检测以及突变基因筛选研究。并在组织标本中进行了临床意义的探讨。第二章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证目的:筛选卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卡铂耐药细胞系(SKOV3-CB)较其亲本(SKOV3)细胞系差异表达下调的肿瘤抑制基因,并验证其差异表达。方法:应用分子生物信息学方法,分析卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卵巢癌SKOV3-CB细胞系较SKOV3细胞系差异表达下调两倍以上的基因1554条,筛选肿瘤抑制基因。应用real-time PCR技术对基因芯片中差异表达基因检测验证。结果:从卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中筛选出RNASET2,VHL,DLG1,COPS2,NOL7,GGNBP2, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3,PCGF2,ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等17个肿瘤抑制基因,荧光定量PCR技术差异表达验证结果示:RNASET2,VHL, COPS2,NOL7, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3, ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等基因差异表达下调,下调倍数分别为24.47、65.24、10.81、21.30、72.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.9、14. 00、23.98。GGNBP2,PCGF2,DLG1等基因差异表达上调,上调倍数分别为5.76,2.19,17.1,基因芯片差异表达结果与real-time PCR所验证表达下降趋势的结果一致率为82.35%,下调两倍以上的基因一致率为64.70%。结论:利用基因芯片技术分析基因差异表达结合real-time PCR对其检测结果验证是一种有效的方法,多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药的机制。第叁章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与卵巢癌卡铂耐药表达下调的关系。方法:应用分子生物信息学方法,分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出引物,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)法或亚硫酸盐测序法(bisulphite sequencing)检测SKOV3-CB、SKOV3中的耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。结果:表达下调的14个基因(VHL, COPS2, NOL7,RANSET2, RBL1, S100A2, PARG1, PERP, TCF3, DNAJA3, ING1, RARRES3, RBBP8,CYLD)中,有10个基因(VHL, COPS2, NOL7, RBL1, PARG1, PERP, DNAJA3, ING1, RNASET2,CYLD)启动子区能够设计出引物,其中CYLD未检出结果,后改用亚硫酸盐测序法检测。MS-PCR检测结果显示,SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;RNASET2,PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物,CYLD重亚硫酸盐测序提示在SKOV3-CB及SKOV3细胞系均为未甲基化状态。结论:卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因差异表达下调的原因。第四章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因突变检测目的:筛查可能的基因突变,探讨其与卵巢卡铂耐药以及相关肿瘤抑制基因表达下调的关系。方法:以亲本细胞系(SKOV3)为对照,在卵巢癌卡铂耐药细胞系(SKOV3-CB),应用单链构象多态性分析(SSCP)检测RNASET2,VHL, COPS2, NOL7, PARG1, RBL1, PERP, DNAJA3, ING1, CYLD等10个基因RT-PCR扩增片段的突变。结果:以SKOV3细胞系为对照,在SKOV3-CB细胞系中,SSCP检测发现DNAJA3,PERP基因聚丙烯酰胺电泳带型存在差异;RNASET2,VHL,COPS2, NOL7, PARG1, RBL1,ING1, CYLD等基因未检测到差异带型。经测序发现PERP第叁外显子1093,1160,1222位点上分别存在A→G突变;1083位点及1085,1086位点,分别存在T,C,C,碱基缺失。DNAJA3第八个外显子87位点处存在A→T突变。结论:DNAJA3,PERP的基因突变以及PERP基因的碱基缺失与卵巢癌卡铂耐药相关,可能是导致其表达下调的原因,宜进一步深入研究。第五章卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系的研究目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达的临床意义方法:Trizol一步法提取卵巢肿瘤患者卵巢组织总RNA,应用RT-PCR检测85例卵巢组织的RNASET2、VHL、PARG1、CYLD、COPS2、PERP、DNAJA3、ING1、NOL7、RBL1基因mRNA表达,其中卵巢癌49例,卵巢良性组织21例,卵巢正常组织15例。结果: RT-PCR结果显示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7基因在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中均有一定程度表达;VHL、PERP、COPS2、CYLD基因在正常卵巢组织、良性肿瘤中、卵巢癌组织中均有一定程度表达,但在部分卵巢癌组织中表达沉默,分别为4(4/49)、3(3/49)、2(2/49)、32(32/49)例;采用Fisher确切概率法统计分析,提示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7、VHL、PERP、COPS2基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢正常组织及卵巢良性肿瘤中的表达沉默阳性率比较差异无意义。CYLD、DNAJA3基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织中的表达沉默阳性率比较差异有显着意义(P分别为0.00、0.00;0.00,0.00)。VHL等10个基因表达与卵巢癌临床病理的关系Fisher确切概率法统计分析,提示CYLD在FIGO I-II与III-IV期存在差异有意义外(P<0.05),其余基因差异均无意义(P均>0.05)。Log Rank分析发现卵巢癌组织VHL、PERP、CYLD基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异均无统计学意义(P分别为0.183、0.493、0.271)。COPS2基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异有统计学意义(P=0.005)。COX回归模型多因素生存分析提示FIGO分期、病理分级进入模型(P分别为0.045、0.028);淋巴结转移及COPS2、PERP、CYLD、ING1基因表达沉默等参数均未进入模型(P分别为0.907、0.476、0.754、0.728、0.304)。结论:结论CYLD、DNAJA3基因表达沉默可作为卵巢癌与卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织鉴别诊断的一个潜在的指标,COPS2、PERP、CYLD、ING1不能作为卵巢癌独立的预后因素。
黄金凤[5]2012年在《乙型肝炎病毒X蛋白相关原发性肝癌发生中的表观遗传学机制研究》文中提出原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位于所有癌症的第五位，且其死亡率为所有癌症死亡率的第叁位，严重威胁着人类健康。而肝癌发生的一个最主要的危险因素就是肝炎病毒感染，流行病学资料显示50-55%的原发性肝癌发生是由于持续性的乙型肝炎病毒（HBV）感染引起。由HBV导致的慢性感染者全世界约有4亿人，其中50%的男性携带者和14%的女性携带者最终会死于慢性感染导致的肝硬化和原发性肝细胞肝癌（HCC）等并发症。目前人们对肝癌的发病机制并不十分清楚。过去人们普遍认为遗传学上的基因突变是肿瘤发病机制中的关键事件，尤其是抑癌基因的体细胞突变与肿瘤的发生有着密切的关系。但是，近年来随着对肿瘤认识的深入，人们发现表观遗传学异常在肿瘤的发生、发展过程中也起到非常重要的作用。由遗传学和表观遗传学改变引起的原癌基因的活化和抑癌基因的灭活共同引起细胞恶性改变，表观遗传学修饰的改变甚至早于遗传学改变在癌前期即开始出现。HBX作为HBV基因组中最小的开放阅读框，同时也是结构和功能上重迭最明显的区域，编码产生的HBx蛋白被认为与HCC的发生发展密切相关。它可以作为原癌基因或者共同作用因子促进肿瘤的发生，最近的研究显示HBx还参与了肝癌发生中的表观遗传学调控。HBx可以通过上调DNA甲基转移酶（DNMT）的活性导致基因启动子区的甲基化从而促进肝癌的发生。但是HBx激活DNMTs的机制仍然不清楚。Micro RNAs（miRNAs）是一类长度约19-25个碱基的单链非编码小分子RNA，它可以通过靶基因mRNA的3'-UTR区完全或不完全的互补结合后导致靶基因降解或抑制其翻译，来调节基因的表达。在生物体内发挥着许多重要作用，包括参与生物体的发育，分化，增殖，凋亡，应激反应等，研究显示miRNAs表达谱的改变在包括肿瘤的许多人类疾病的发生中都起着重要的作用。一些miRNAs可能作为原癌基因或者抑癌基因发挥作用。而越来越多的证据显示miRNAs与DNA甲基化有着互相调节关系，可以互为靶向。在本课题中，我们研究了在HBV相关性肝癌中是否存在着异常表达的能调控机体DNA甲基化状态的miRNAs，参与了肿瘤的发生过程。本实验室的前期研究中基于HBx转基因小鼠及对照野生型C57/BL6小鼠肝脏组织miRNA芯片发现miR-152在HBx转基因小鼠的肝脏组织中表达量发生明显下调。而通过生物信息学预测发现，DNMT1可能是miR-152的靶基因。随后我们通过体外双荧光素酶报告基因检测证明miR-152可以通过直接与DNMT1的3'-UTR区发生互补结合，从而靶向抑制其mRNA和蛋白表达水平，并调控机体的DNA甲基化状态。病人组织检测结果也显示miR-152的表达量在HBV相关性肝癌组织中比对应的癌旁组织发生了频繁的显着下调，且miR-152的表达量与DNMT1的mRNA表达负相关。细胞水平实验证明在HepG2.2.15细胞中过表达miR-152可以导致基因组整体DNA甲基化水平（GDM）的下降；而相反的，在HepG2细胞中，miR-152的抑制剂可以导致细胞的GDM上升，以及肿瘤抑制基因GSTP1和CDH1的启动子区甲基化水平显着上升而抑制其表达，从而促进肿瘤的发生。本实验证明了miR-152参与了HBV相关性肝癌发生中的表观遗传学调控，在肿瘤的发生中起到抑癌基因的作用，丰富了HBV-HCC的发病机制。并首次在消化系统疾病中报道miRNA可以调控DNA甲基化，为丰富不同表观遗传学修饰之间的相互调控机制，以及理解表观遗传学的复杂调控网络起到了积极的作用。我们同样相信我们的发现对潜在的相关治疗可以产生积极的影响意义。本研究的结果为发展使用外源合成的miR-152作为表观遗传学药物治疗HBV相关性肝癌提供了有力的理论支持。miR-152可以单独使用或者与其他药物联合使用，它可以通过重新激活肿瘤抑制基因以及纠正肿瘤细胞的异常DNA甲基化模式，来达到治疗肿瘤的目的，为HBV-HCC提供了新的miRNA药物治疗靶点。除了小RNA分子，近年来，另一类长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)也逐渐进入人们的视角。lncRNAs是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们本身并不编码蛋白或者只是编码很短的多肽。近年来，越来越多的研究表明lncRNAs在表观遗传学调控领域也有着非常重要的作用，它可以通过各种不同的机制调控基因的表达水平，参与基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录后调控、蛋白功能调节等多种重要的信号转导调控过程。lncRNAs参与调控了多种生理病理学过程，参与了各种疾病包括肿瘤的发生发展过程。那么HBV是否可以通过影响lncRNAs的表达来促进肿瘤的发生呢？在本研究中，我们还从HBx转基因鼠角度入手，消除其他干扰因素，研究了HBV对lncRNAs的表达影响，以及lncRNAs在HBV-HCC发生中的作用及其分子机制。本实验中我们使用lncRNAs芯片技术筛选到一批在HBx转基因小鼠肝脏组织中比野生型小鼠发生显着差异的lncRNAs，并且用实时定量PCR技术扩大样本量对它们在不同年龄和性别的转基因和野生型小鼠肝脏组织中的表达量进行了验证。证实了HBx确实可以影响机体的lncRNAs表达，说明HBV感染者可能有着其特异的lncRNAs表达谱，而且其中很多lncRNAs表达变异在感染的早期未发生肿瘤时就已经出现，提示它们的表达差异可能与肿瘤的发生密切相关。我们发现HBx诱导下调的一个lncRNA-AK050349，可以在体内外抑制肿瘤的增殖和迁移，在HBV相关性肝癌的发生起到抑癌基因的作用。AK050349可以通过与vimentin蛋白发生相互结合并抑制其表达，以及改变其正常的细胞骨架结构，发挥其抑制肿瘤转移的作用。我们的研究证明了HBx相关的lncRNAs在原发性肝癌发生发展中的重要作用，是对HBV-HCC的肿瘤发生和转移网络的重要补充，能让我们更好地理解HCC的发生机制，做到早期诊断，改善治疗和干预手段，从而提高肝癌的存活率。同时lncRNA-AK050349在HBV相关HCC肿瘤生长和转移级联反应中的抑癌作用为我们治疗HBV相关HCC提供了新的思路和靶向。为发展使用外源合成的lncRNAs作为表观遗传学药物治疗HBV相关性肝癌提供了有力的理论支持。
先志强[6]2014年在《番茄AGO基因的分离鉴定及SlmiR168、AGO1在番茄生长发育过程中的功能研究》文中研究表明转录后调控是植物中一类重要的调控方式，在植物发育的各个阶段以及病毒防御中都发挥着重要的调控作用。miRNA是植物中内源的一类参与到转录后调控中的重要小分子，参与植物叶形态的形成、营养生长向生殖生长的转变以及配子的形成等生命活动。研究表明，miRNA是植物中普遍存在的一种调控手段，但是目前对于miRNA在植物生命活动中的研究尚不够深入。AGO蛋白是在miRNA起作用的沉默复合体中的核心组成部分，其可以结合miRNA并在miRNA指导下对靶标基因的表达进行调控。关于重要的果实模式生物——番茄中AGO基因的分布、表达以功能目前尚不明确；另外，AGO家族中的AGO1受miR168调控，但其调控机制及对番茄的生理作用未见报道。因此，本研究根据拟南芥的AGO基因与番茄基因库进行对比分析，在番茄基因组中找到15个潜在AGO基因，系统发育分析发现其可根据其相似性分为叁个亚家族：与拟南芥AGO1近似的AGO1亚家族、与拟南芥AGO2近似的AGO2亚家族及与拟南芥AGO4近似的AGO4亚家族；对其进行组织特异性检测发现，大多数SlAGO基因在番茄的根、茎、叶、花以及花蕾、雄蕊、雌蕊等被检测组织中为组成型表达，但是SlAGO5只在生殖系统里表达，而SlAGO4D与SlAGO7在果实发育前期表达明显强于其它组织与时期；细胞定位分析结果表明，番茄AGO蛋白定位于细胞核与细胞质中，但在AGO1A、AGO1B、AGO5和AGO10的细胞定位观察中发现细胞核膜及细胞质膜上存在大量荧光信号。在前期生物信息学分析的基础上，获得番茄miR168序列及其靶标基因SlAGO1A及SlAGO1B的信息，然后借助超表达35S驱动的miR168以获得miR168功能获得的转基因植株；采用在SlAGO1A与SlAGO1B与miR168匹配位点定点突变（4m-SlAGO1A及4m-SlAGO1B）的方法来获得miR168-resistance转基因植株；采用miR168-sponge的方法获得miR168功能缺失的转基因植株。通过对这叁种转基因植株表型的观察及分析表明：1)在番茄中分离的15个AGO基因中，SlAGO1A及SlAGO1B两个AGO基因受miR168调控，SlAGO1A及SlAGO1B蛋白又可促进miR168的表达和稳定，miR168与SlAGO1A与SlAGO1B之间存在相互调控而到达平衡的关系；2)在对叁种转基因的表型的观察中发现，miR168可以通过影响SlAGO1s而参与到植物的生长、发育阶段的转化、成熟叶片的向上反应、果实生成、果实膨胀等过程中。通过分子检测，明确miR168可以通过SlAGO1s而影响早期在营养生长及转化过程中起重要作用的miR156的累积，进而影响植株的生长速率及开花时间；miR168可以通过调控SlAGO1s而影响直接参与到乙烯通路中的miR164及潜在参与到乙烯相应中的miR172的累积而造成叶片向上反应；miR168可以通过调控SlAGO1s而影响参与生长素途径中的miR167及miR393，并且影响潜在参与赤霉素途径中的miR171而影响果实的生成及膨大；3)在叁种转基因对激素及环境的相应过程中，发现miR168可以通过降低SlAGO1s的表达方式来影响种子在不同浓度ABA处理下的发芽速度以及发芽率。另外，miR168是随光周期呈现节律性震荡并且超表达miR168的转基因植株在10μM NPA的处理下，其茎的延伸能力明显优于野生型，结合超表达miR168植株变高及花枝变多的表型，能接受光信号的miR168可以通过影响SlAGO1s的表达，从而影响转基因植株对生长素的相应，进而平衡花絮的发育，使得转基因具有更多的花；4)对miR168及SlAGO1s调控的重要的miRNA（与生长素转运相关的miR166及与开花相关的miR172）转基因的表现进行观察及统计，进一步挖掘miR168影响番茄生长发育的信号通路。本研究围绕番茄生长发育过程中miR168与SlAGO1的相互调控问题，对番茄的AGO蛋白进行分离鉴定和分析，明确番茄中miR168与SlAGO1的相互作用及生理功能，并解析miR168调控AGO1进而调节众多miRNA的调控网络。本研究为番茄中miRNAs的调控模式及其功能的阐明奠定了基础，有助于深入理解AGO1与miRNAs的相互作用关系，也将为miRNAs参与果实的发育研究提供重要理论依据。
参考文献：
[1]. 同源序列高剂量异常表达及病毒编码蛋白对基因沉默的作用[D]. 张凌娣. 中国农业大学. 2004
[2]. 凡纳滨对虾Dicer-1基因克隆和表达[D]. 姚雪梅. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2010
[3]. 翻译与非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较[D]. 郭兴启. 浙江大学. 2001
[4]. 卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究[D]. 唐兆前. 广西医科大学. 2010
[5]. 乙型肝炎病毒X蛋白相关原发性肝癌发生中的表观遗传学机制研究[D]. 黄金凤. 第二军医大学. 2012
[6]. 番茄AGO基因的分离鉴定及SlmiR168、AGO1在番茄生长发育过程中的功能研究[D]. 先志强. 重庆大学. 2014
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