（1湖北省武汉市江汉大学医学院 湖北 武汉 430000）
（2湖北省武汉市第一医院骨脊柱外科 湖北 武汉 430022）
【摘要】 目的：利用构建好的高效表达结核分枝杆菌抗原肝素结合血凝素（HBHA）的重组原核表达质粒（pETHBHA）和重组分枝杆菌表达质粒（pMVHBHA），探讨IFN-γ释放试验（Interferon-gamma release assays，IGRA）在骨与关节结核（BJTB)诊断中的效果。方法：采集临床诊断的BJTB患者、单纯肺结核（TB）患者和健康体检人群的外周血，分别用规模化纯化的HBHA刺激，利用IGRA检测IFN-γ的含量。结果：BJTB组患者的外周血经过规模化纯化的HBHA刺激后，分泌的IFN-γ的含量，明显高于其他两组。结论：HBHA-IGRA具有辅助诊断BJTB的价值。
【关键词】 肝素结合血凝素；IFN-γ释放试验；骨与关节结核；诊断
【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）19-0133-01
BJTB是肺外结核的常见类型，可占全部结核的3.0%～5.0%，占肺外结核的11.3%～34.5%尽管其发生率仅次于胸膜和淋巴结核，但主要好发于30岁以下青年和儿童，并由于骨质破坏导致肢体畸形、神经受压等并发症，严重影响患者的生活质量，常需要手术干预治疗[1-2]。BJTB的临床诊断常依据病史、临床症状，并结合影像学、实验室检查如血沉和C反应蛋白初步诊断；解剖或外科手术取材的病理学和细菌学培养予以证实诊断[3]。在中国，骨与关节结核患者从最初出现临床症状到明确诊断，平均需要的时间长达13.16月[4]，反映严重缺乏快速有效的诊断方法。因此，研究更敏感、快速和特异的方法，快速准确的诊断BJTB，对防治该病具有重要意义。
1.资料与方法
1.1 质粒
重组原核表达质粒（pETHBHA）和重组分枝杆菌表达质粒（pMVHBHA）均由同济医学院病原生物学系保存。
1.2 研究对象
伦理经武汉市第一医院伦理委员会批准。所有参与研究的患者均提供知情同意书。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆
BJTB组：来自本院住院病例，共收集30病例。
TB组：来自本院住院病例，共收集30病例。
健康对照组：来自本院健康体检人群，共收集30例。
1.3 标本采集
三组病例均无菌采集外周抗凝血10ml；标本保存在4℃，6h之内送检。
1.4 主要试剂
蛋白质Maker购自华美公司。7h9、7H11和ADC增菌培养液购自Difco公司。
1.5 重组大肠杆菌来源的HBHA的制备
将重组质粒pETHBHA转化的E.coliBL21(DE3)感受态细菌接种于LB培养液中(含卡那霉素50μg/mL)，37℃培养16h。按照1∶20的比例放大培养，37℃培养2h(振荡速度200r/min)后，加入IPTG 至终浓度为1mmol/L，37℃继续振荡培养4h，以诱导目的蛋白表达。
1.6 重组耻垢分枝杆菌来源的HBHA的制备
将重组质粒pMVHBHA转化的M.smegmatis细菌，接种含卡那霉素的7H11琼脂平板，并培养5d。挑取单克隆，接种于含卡那霉素的7H9液体培养基，培养5d。离心收集细菌，PBS洗涤两次。超声破碎细菌。
1.7 ELISA法检测HBHA抗原刺激产生的IFN-γ含量
将每例标本的外周血5ml，加入24孔板中，0.5ml/孔。分别加入HBHA抗原（5～20μg/ml）混匀。放置37℃培养箱静置培养20～24h。然后，收集每孔上清，-20℃保存。ELISA法检测上清的IFN-γ的含量。
2.结果
ELISA法检测结果表明，BJTB组患者的外周血经过规模化纯化的HBHA刺激后，分泌的IFN-γ的含量，明显高于其他两组。差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3.讨论
近年来，虽然经济发展快速、居住环境改善、结核检测和治疗方法不断进步，但结核的发病率却居高不下，肺外结核的发病率也随之升高。骨与关节结核作为肺外结核的重要组成部分，因其进展缓慢、临床表现无特异性，且常导致患者的骨关节被实质性破坏、预后差，给临床诊断和治疗带来极大的挑战，如何早期诊断骨结核则成为了临床棘手的问题。
4.结论
以HBHA-IGRA为基础的技术，可用于快速辅助诊断BJTB，在临床上具有重要的指导意义。
【参考文献】
[1] Kulchavenya E.Extrapulmonary tuberculosis:are statistical reports accurate.TherAdv Infect Dis:61-70,2014.
[2] Yu Y，Wang X，Du B，Yuan W,Ni B．Isolated atypical spinal tuberculosis mistaken for neoplas-ia: case report and literature review．Eur Spine J:S302-305,2013．
[3] Pigrau-Serrallach C，Ｒodríguez-Pardo D.Bone and joint tuberculosis．Eur Spine J:556-566,2013．
[4] Su-Ting Chen,Li-Ping Zhao,Wei-Jie Dong,Yun-Ting Gu, Yun-Xu Li,Ling-Ling Dong,Yi-Feng Ma,Shi-Bing Qin, Hai-Rong Huang.The Clinical Features and Bacteriological Characterizations of Bone and Joint Tuberculosis in China.Scientific Reports:11084(DOI:10.1038/srep11084),2015.
论文作者:牛飞1,冯晶2,夏平2
论文发表刊物:《医药前沿》2019年19期
论文发表时间:2019/8/20
标签：结核论文; 质粒论文; 患者论文; 分枝论文; 病例论文; 卡那霉素论文; 关节论文; 《医药前沿》2019年19期论文;