肖军[1]2002年在《大鼠热适应相关基因消减文库的构建和差异表达基因的分离、鉴定及序列分析》文中指出人体在高温环境下适应和耐受能力的研究历来受到国内外关注。它决定了人类与环境交互作用的过程中能否有效地适应高温环境，维持生存。从军事特殊环境医学的角度看，更要求在高温野战条件下保持战斗力。因此，研究热适应现象，探索促进机体热适应能力提高的有效途径，对于提高高温战区指战员工作和战斗效率，减少中暑引起的非战斗减员，具有重要的意义。 探索提高热适应能力的有效途径，必须建立在阐明热适应分子机理的基础上。研究表明，热适应是一个受多因素调控的复杂过程，仅根据目前的研究资料还不足以明确解释热适应现象。因此，全面分离参与热适应的生物活性物质，揭示这些生物活性物质发挥功能的途径，对于系统研究热适应分子机理尤为重要。 目的：采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSll）技术，探讨热适应人鼠肝脏组织基囚的差异表达，力求在坯凶水平阐明热适应的本质。 方法：将封 6J群同胞、雄性 SD大鼠（n＝6）平均分为热适应组（n二3）。和常温对照组＊4人 利用数字化仿真气候室制备热适应动物模型。分别提取肝脏组织mRNA，采用SSH技术反转录dNA，酶切、接头连接后依次以热适应组和常温对照组cDNA作为tester，另一组cDNA作为driver进行连续两次消减杂交。巢式PCR产物连接T载体，转化宿主菌。扩增目的基因，采用 Differential Screening和 t，ev。rse Northern Blot技术进行筛选鉴定。阳性差异表达基因送交测序，结果提交GetleB。uk进行同源性对比分析。 结果：热适应组模型动物获得了充分的热适应。从参比两组大鼠肝脏组织分别提纯了高质量的总RNA和mRNA，完整反转录为双链cDNA，Rsal彻底酶切，获得了长度均一性较好的短片段。高效连接特定接头，经过连续2轮消减杂交，构建了上调、下调表达2个热适应相关基因消减CDNA文库，经检测消减效率较高。巢式PCR扩增特异性高，使差异表达基因得到了指数扩增。产物连接 T载体并成功转化 TOP OF’大肠杆菌感受态细胞，侄文库中的差异表达基因得到分离。从上调表达消减文库中初步分离出 200个目的基因片段，经 Differential Screening和，everse Northern Blot技术筛选鉴定，确认其中25个基因为阳性差异表达基因。测序结果提交GeneBank进行同源性对比分析，确定差导表达基因的编码蛋白，以及确认新基因。 结论：①首次将抑制性消减杂交技术（SSH）应用于热环境医学领域的研究，从基因差异表达的角度，系统研究热适应现象的分子机理。＠构建了热适应相关基因上调、下调表达 CDNA消减文库，为进一步分离热适应差异表达基因奠定了基础。③不同于以往文献从离体培养细胞水平报道HSP参与热耐受，本实验从基因差异表达的角度，在整体动物水平发现了热适应动物肝脏组织中也存在着HSP27、HSP86和“肿瘤抑制蛋白”一p53蛋白编码基因的上调表达，间接证实了热适应机体中存在HSP27、HSP86和p53蛋白的基础表达升高现象，说明HSP27、HSP86和 p53参与了热适应分子机制。④发现了 10个在热适应过程中表达上调的新基因EST，己经全部被GeneBank收录，登陆序列号：BM285377、 －4－ BM378053－62。通过在此基础上扩增全长基因，可以表达新的蛋白质， 对深入研究热适应现象具有重要的价值。⑤采用地高辛标记PCR探针替 代了传统 Differential Screening技术的同位素 P‘二dCTP探针，在继承其 高灵敏度和良好特异性的基础上避免了放射性污染，简化了实验操作。
周利梅[2]2004年在《晕船易感大鼠脑干差异表达基因的研究》文中提出研究目的 晕船是一种常见的航海疾病，因晕船引起的头痛、头晕、恶心、呕吐、脑体功能急剧下降等严重影响海上作业能力。近年来，航海事业的发展使抗晕船成为航海医学中一个重要研究课题。随着人们对抗晕船药物中枢副作用的深入了解，晕船易感性预测逐渐受到重视。目前关于晕船易感性个体差异机理的研究报道较少，而且仅限于生理生化水平，从基因水平对晕船易感性机理的研究尚未见报道。人群中晕船易感性个体差异较大，人群调查结果显示晕船的个体差异与个体的性别、年龄、种族以及遗传因素有关，提示晕船易感性个体差异可能与基因的差异表达有关。现有的晕船机理研究表明脑干在晕船发生过程中发挥重要作用。因此本研究通过筛选和鉴定晕船易感大鼠脑干组织差异表达基因，并在此基础上进一步研究晕船时机体能量代谢相关基因的表达变化与产生晕船易感性个体差异的可能机制。旨在从分子水平探讨晕船易感性个体差异的机理，为最终建立晕船易感人群预测方法提供实验依据。 研究方法 1．建立晕船易感大鼠动物模型 SD雄性大鼠8只，体重150-180g，给予热暴露6天，根据大鼠热应激后肛温的变化判断其是否产生热适应。SD雄性大鼠30只，体重150-180g，给予模拟晕船刺激21天，根据大鼠异嗜高岭土量的变化趋势判断其是否对模拟晕船刺激产生适应。以热应激作为模拟晕船刺激的应激对照，在进行大鼠热应激和大鼠模拟晕船刺激实验前，比较两者异嗜高岭土量的差异，以及大鼠模拟晕船刺激适应前后和大鼠热适应前后异嗜高岭土量的差异。以证实异嗜高岭土是否是判断大鼠发生晕船的特异指标。 SD雄性大鼠100只，体重150-180g，随机等分为A组和B组。A组随机取出10只作为对照，不给予模拟晕船刺激，其余的40只全部给予模拟晕船刺激3天：B组随机取出10只作为对照，不给予模拟晕船刺激，其余的40只全部给予模拟晕船刺激21天。观察实验过程中各组大鼠异嗜高岭土量及异嗜高岭土量的变化第二军医大学博士学位论文趋势，以研究大鼠中晕船易感性个体差异情况。 根据是否异嗜高岭土及异嗜高岭土量的变化趋势对A组和B组的模拟晕船刺激大鼠进一步分组:A组大鼠分为晕船组和不晕船组;B组大鼠分为晕船易感组、晕船适应组和不晕船组。2.筛选晕船易感大鼠脑干差异表达基因 以B组中晕船易感大鼠为实验组(tester)，以B组中不晕船大鼠为驱动组(driver)，提取脑干组织RNA，利用抑制消减杂交技术(SSH)构建晕船易感大鼠脑干组织差异表达基因cDNA文库。以差异表达基因菌液为模板进行PCR扩增，检测是否含有插入片段以及插入片段长度。挑取含有插入片段的克隆进行斑点杂交筛选阳性克隆。阳性克隆的测序结果分别输入GenBank中进行同源性检索。对cDNA序列的初步分析以及氨基酸的翻译使用DNAssist version 2.0软件，蛋白质序列分析在~Softbe卿.com上进行。3.探讨能量代谢相关基因的差异表达与晕船的关系 提取A组的对照大鼠、晕船大鼠和不晕船大鼠脑干组织RNA，同时提取B组的对照大鼠、晕船易感大鼠、晕船适应大鼠和不晕船大鼠脑干组织RNA。以大鼠队action基因为内参照，利用实时荧光定量PCR技术，分别检测编码磷酸果糖激酶、Al，P合酶、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶和铁蛋白的基因在上述晕船差异个体脑干组织中的表达情况。研究结果1.晕船易感大鼠动物模型 大鼠接受热应激最初两天肛温在40℃以上，第叁天开始肛温一直维持在39.5℃左右，这提示大鼠己经产生热适应。 在进行热应激和模拟晕船刺激实验之前，两组大鼠异嗜高岭土量差异不显着:在热应激和模拟晕船刺激期间，热应激大鼠较晕船大鼠异嗜高岭土量低，两者差异显着(p<0 .05);在大鼠对热应激和模拟晕船刺激适应后，两组大鼠异嗜高岭土量差异不显着。大鼠在热适应前后异嗜高岭土量差异不显着，但大鼠在晕船适应后较晕船适应前异嗜高岭土量明显降低，两者差异显着(p<0.05)。 大鼠接受模拟晕船刺激后，对照组和各实验组之间的进食量以及体增重差异不显着(p>0.05)。但不晕船组大鼠的进食量较其它各组的进食量相对稍高。在模拟晕船刺激前期，对照组大鼠的体增重较实验组大鼠的体增重略高。第二军医大学博士学位论文 A组40只实验大鼠给予模拟晕船刺激共3天。结果显示晕船组大鼠异嗜高岭土量显着高于对照组大鼠(P<0.05);对照组大鼠和不晕船组大鼠异嗜高岭土量差异不显着。 B组40只实验大鼠给予模拟晕船刺激共21天。结果显示，晕船易感大鼠(20%)在接受晕船模拟刺激的过程中异嗜高岭土量一直处于较高水平，与对照组比较差异显着(P<0.01或P<0.05);晕船适应大鼠(55%)在接受模拟晕船刺激后，异嗜高岭土量从较高水平逐渐降低到对照组水平，在刺激的前期异嗜高岭土量与对照组比较差异显着(P<0.01或P<0.05)，到刺激的后期异嗜高岭土量与对照组比较差异不显着(p>0.05);不晕船大鼠(25%)在模拟晕船刺激过程中几乎不异嗜高岭土，异嗜高岭土量与对照组比较差异不显着(p>0.05)。 结果提示:异嗜高岭土是判断大鼠发生晕船的特异指标，大鼠中存在晕船易感性个体差异。建立的晕船易?
参考文献：
[1]. 大鼠热适应相关基因消减文库的构建和差异表达基因的分离、鉴定及序列分析[D]. 肖军. 第一军医大学. 2002
[2]. 晕船易感大鼠脑干差异表达基因的研究[D]. 周利梅. 第二军医大学. 2004