王玲[1]2003年在《保护氨基酸的制备研究》文中进行了进一步梳理固相多肽的人工合成是由不同氨基酸按照一定顺序的控制合成，其难点就在于氨基酸的功能基团易与接肽反应的试剂发生作用，从而引起副产品增多、合成效率低下等现象。因此用于固相多肽合成的氨基酸的功能基团必须用保护基暂时封闭起来，这样才能保证固相多肽合成的顺利进行。 本文详细的综述了保护氨基酸的分类、保护基团的分类和特点，以及它们的特异性脱去条件，并对保护基引入的一般反应过程和应用等加以阐述。 基于多肽广阔的市场前景和居高不下的合成成本，本文以多肽合成的原料—保护氨基酸制备工艺的研究为主要内容，优化制备反应条件，并进行了部分保护氨基酸的放大工艺研究和成本核算，从而达到为多肽合成提供高纯度、低成本的保护氨基酸。 一、侧链烷烃基保护氨基酸的制备研究 本文选取了叁种侧链烷烃基氨基酸--L-丙氨酸、L-苯丙氨酸和L-缬氨酸进行了保护，并进行了2L反应器的放大反应。通过实验考察了反应温度、反应时间、反应体系pH值和保护试剂的种类等多方面的影响因素：保护L-丙氨酸、L-缬氨酸的最佳反应温度为20℃，L-苯丙氨酸的最佳反应温度则在25℃左右；最佳反应时间分别为70min、60min、90min；产品产率分别在90％、88％、89％，均高于文献的报道数据；产品的纯度均高于98％。 二、含侧链功能基团的保护氨基酸的制备研究 主要选取了含侧链羟基的L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-酪氨酸，使用的保护策略是用Fmoc保护α-氨基，用叔丁酯的形式保护侧链基团；含侧链氨基的L-赖氨酸，所合成的正交保护的L-赖氨酸是Fmoc-L-Lys(Boc)。对它们的制备条件进行了优化选择，所得产品的纯度均高于97％。 (1)Fmoc-L-Lys(Boc)的制备条件为：ε-氨基保护反应是在27℃下反应30h，收率为96.8％；α-氨基保护反应则为30℃反应2h，收率为91％。产品的最终收率为88％。 (2)全保护的L-丝氨酸和L-苏氨酸的最优反应条件为：L-丝氨酸侧链保护反应为冰浴吸收异丁烯气体48h；氨基保护是在pH＞10，-5℃下搅拌反应36h，产品的 ④g最终收率为892％；二一苏氨酸侧链保护反应为冰浴吸收异丁烯气体48h；氨基保护是在出九，0℃下搅拌反应3 6h，产品的最终收率为730。 门）Fmoc上一Tyr广Bu）的反应条件为：氨基保护是在pH九0，0℃下搅拌反应12h，最高产品产率 96 ％；侧链保护反应为冰浴吸收异丁烯气体 6h，最高产品产率 83 ％；最终产率为 796 ％。 叁、对己经合成的保护氨基酸进行成本核算和接肽反应 通过控制反应条件将保护氨基酸的制备反应进行一定的放大后可以在一定程度上降低成本，其产品的成本都远远低于商品保护氨基酸，纯度与其相当，而价格仅为十分之一。
杜秀敏[2]2004年在《Fmoc系列保护氨基酸的制备研究》文中认为随着生物技术的发展,多肽在生物医药领域的用途越来越大,保护氨基酸是固相合成多肽技术最基本的原料。氨基酸都含有α-氨基和羧基,20中氨基酸中有些还含有侧链活泼基团,如:羟基、氨基、胍基和杂环等。氨基和侧链活泼基团在接肽反应中都需要保护起来,合成多肽后再脱去保护基团,否者会发生氨基酸的错接和许多副反应。保护氨基酸一般有单保护氨基酸和双保护氨基酸之分。单保护氨基酸是指只保护α-氨基的保护氨基酸;双保护氨基酸是指除了保护α-氨基外还需要保护侧链活泼基团的氨基酸。本论文对这两类保护氨基酸都做了讨论,同时对D型氨基酸也做了尝试。分别从生产工艺和生产成本上做了讨论,合成的保护氨基酸成品直接供应多肽重点实验室作原料。单保护氨基酸主要采用碱敏感的芴甲氧羰酰基(Fmoc)来保护,主要的品种有:Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ile-OH和Fmoc-D-Val-OH。对影响Fmoc-Gly-OH和Fmoc-D-Val-OH的主要反应条件,包括反应时间和温度采用单因素分析法进行优化实验。对于Fmoc-L-Leu-OH和Fmoc-L-Ile-OH采用叁因素叁水平正交设计进行优化实验,得到了最佳的条件组合。双保护氨基酸主要包括含侧链氨基的D-Lys-OH以及含侧链胍基的L-Arg-OH的保护。对于α-氨基仍采用Fmoc保护策略,侧链氨基用二碳酸二叔丁酯引入叔丁氧羰基来保护,侧链胍基用酸敏感保护基2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基来保护。由于这两种氨基酸的合成步骤较多,分别对主要的反应步骤进行单因素优化实验,D-Lys-OH的保护主要考虑影响铜配合物生成的时间和温度,以及脱铜反应的时间。L-Arg-OH的保护主要考虑制备Z-Arg-OH的反应时间,制备Z-L-Arg(Pbf)-OH环己氨盐的温度,以及氢解脱Z时催化剂的用量、反应的压力、温度和时间,通过优化实验都得到了较好的产率。反应过程中主要采用T.L.C检测反应进程,并对产品的结晶条件进行了优化,用高效液相色谱测得产品纯度均达到95.0%以上。除一般的物理常数表征外,还包括红外光谱、质谱或氢谱。最后,从保护氨基酸原料和辅助试剂出发,对每种保护氨基酸的生产成本进行了成本核算,并与市场价格进行比较。
袁恒立[3]2007年在《ACE抑制肽的合成及生物活性》文中研究说明多肽LGFPTTKTYFPHF和VVYPWT是首次在猪血红蛋白中分离出具有较高体外降血压活性的血红蛋白片段，对血管紧张素I转换酶(ACE)抑制活性(IC_(50))分别为4.92μM和6.02μM，另具抗胃肠道酶水解活性，动力学实验表明这两个多肽属于ACE的竞争性抑制剂。本文以ACE抑制肽的构效关系为研究目的，针对多肽中氨基酸的组成及序列的改变对活性的影响开展工作。以LGFPTTKTYFPHF和VVYPWT为研究骨架，合成了LGFPTTKTYFPHF和VVYPWT以及15种类似物，分别研究C-端和N-端氨基酸残基对多肽ACE抑制活性的影响，为多肽类ACE抑制剂作为抗高血压药物进行积极探索。本文采用多肽固相合成方法，选用Wang树脂为固相载体，运用正交保护策略，以Fmoc为α-氨基保护基，HBTU-HOBt·H_2O为缩合剂，合成了LGFPTTKTYFPHF和VVYPWT及其类似物17个多肽序列，粗产物经凝胶层析和RP-HPLC进行制备，由RP-HPLC和ESI-MS对多肽进行表征。本文将合成的17个多肽序列进行体外ACE抑制活性测定并与天然分离物质进行对比，其中LGFPTTKTYFPHF、GFPTTKTYFPHF、FPTTKTYFPHF、PTTKTYFPHF、TTKTYFPHF、TKYFPHF和VVYPWT 7个序列活性较高，与天然分离物质相近。结果表明多肽C-端为芳香族氨基酸(如Phe)时往往表现出较高的ACE抑制活性，而N-端含有脂肪族氨基酸则能够增强其抑制活性；C-端叁肽中Pro残基对多肽的ACE活性也有一定影响。另外，上述多肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性作用并不明显，表明不具有明显降血糖作用。综上所述，ACE多肽C-端叁肽含有疏水性分支侧链氨基酸、芳香族氨基酸和含杂环的脯氨酸、N-端含脂肪族氨基酸时，往往显示较高的ACE抑制活性。在今后的研究中，可以对多肽的C-端进一步改进，在保证溶解度的前提下，减少亲水性氨基酸残基数量，有可能获得更高活性的多肽。
何洪华[4]2005年在《手性氨基醇的合成研究》文中研究说明手性氨基醇是一类由α-氨基酸经过手性源还原得到的具有光学活性的氨基醇。目前,手性氨基醇已广泛用于医药、精细化工、材料和不对称催化的有机合成中。在医药领域主要应用在多肽类药物和喹诺酮类手性药物中,在不对称催化领域手性氨基醇以其来源广泛,结构多样化而备受关注,主要用作金属手性配体和手性助剂的手性源。因此,研究手性氨基醇的制备对建立低成本、规模制备手性氨基醇,具有很强的实际应用价值。本文对手性氨基醇的应用和制备进展进行了较全面的论述。根据氨基酸水溶性差异,采用NaBH_4 体系和催化加氢的方法,系统研究了脂溶性和水溶性氨基酸衍生的手性氨基醇的制备方法;对NaBH4 的各种还原体系在手性氨基醇制备中的应用进行了工艺优化和成本分析。首次建立了以Fmoc 保护氨基酸为原料,利用NaBH_4/N-甲基吗啉/氯甲酸异丁酯体系合成Fmoc-苏氨醇、Fmoc-亮氨醇等系列手性氨基醇的新路线。首先,深入研究了NaBH_4-LiCl、NaBH_4-CH_3OH、NaBH_4-H_2SO_4和NaBH_4-I_2等4 个还原体系在脂溶性氨基酸衍生的手性氨基醇制备中的应用。利用这4 个体系分别制备了L-苯丙氨醇、L-苯甘氨醇、L-亮氨醇、L-异亮氨醇、L-缬氨醇和L-脯氨醇等6 个氨基醇。在每个体系中,对影响氨基醇收率的主要反应条件,如还原剂用量、反应时间和温度等方面采用单因素分析法进行优化。收率比相关文献普遍高出10-30%。在各体系最佳反应条件下,得到6 个氨基醇的收率有所不同。NaBH_4-LiCl 体系:L-苯丙氨醇81.5%、L-苯甘氨醇90.2%、L-亮氨醇84.9%、L-异亮氨醇85.6%、L-缬氨醇81.1%、L-脯氨醇41.5%;NaBH_4-CH_3OH 体系:L-苯丙氨醇84.3%、L-苯甘氨醇85.6%、L-亮氨醇92.7%、L-异亮氨醇88.1%、L-缬氨醇86.8%、L-脯氨醇50.2%;NaBH_4-H_2SO_4体系:L-苯丙氨醇87.9%、L-苯甘氨醇82.6%、L-亮氨醇78.4%、L-异亮氨醇80.2%、L-缬氨醇84.5%、L-脯氨醇31.6%;NaBH_4-I2 体系:L-苯丙氨醇97.5%、L-苯甘氨醇91.1%、L-亮氨醇98.9%、L-异亮氨醇98.9%、L-缬氨醇90.8%、L-脯氨醇88.4%。对每个体系下6 种氨基醇的生产成本进行了原料成本核算。从成本因素考虑,L-苯甘氨醇用NaBH_4-LiCl体系制备最好,L-苯丙氨醇、L-亮氨醇、L-异亮氨醇和L-缬氨醇用NaBH_4-H_2SO_4体系为宜,L-脯氨醇用NaBH_4-I_2体系制备最佳。
孟庆国, 褚征, 刘克良[5]2005年在《N-Boc保护氨基酸的酯化方法研究》文中研究说明目的研究N Boc保护氨基酸的酯化方法。方法以甲磺酰氯与醇反应制备甲磺酸酯 ,N Boc保护氨基酸与甲磺酸酯反应得到相应的N Boc保护氨基酸酯。结果制备了 5种N Boc保护氨基酸酯 ,其结构均经1H NMR和ESI MS确证。结论该N Boc保护氨基酸酯化方法反应条件温和、成本低、无副反应发生、收率高。
虞惟俊[6]2008年在《小牛血及血清去蛋白提取物注射液的质量控制方法研究》文中研究表明小牛血、血清去蛋白提取物注射液可以增进与能量有关的功能性代谢和保存性代谢,对脑神经损伤、脑中卒及脑梗塞等疾病有积极的治疗效果。国外该注射液的代表产品是爱维治。该产品每年进口额为几千万美元,位列进口药品排名前列。近年来国内制药企业纷纷仿制,造成了低水平重复、产能过剩及质量控制疏忽等问题。加之近年来出现的齐二药、“欣弗”及“鱼腥草注射液”事件等,使得注射液的质量问题日益受到人们密切的关注。出于用药安全考虑,国家药监局明确指出需提高注射液的质量控制要求。由于该注射液所含成份非常复杂,现有的国家药品标准不能完全说明质量问题,所以有必要丰富该注射液的质量控制方法,以达到更好地控制该药品质量的目的。该工作需通过国内外产品质量对比后再进行标准的完善。小分子肽是该注射液的有效成份之一。本文采用了CZE和LC-MS等多种尚未被列入该药物标准中的检测技术对爱维治及国内五家代表性产品的小肽进行了研究,建立了该注射液小肽的RP-HPLC、CZE和LC-MS分析方法。在液相分析中优化了流动相比例、流速等条件,采用了A相为水-乙腈-叁氟乙酸(93:7:0.1)、B相为乙腈:水(4:1)、检测波长210nm、流速为0.3m1·min~(-1)。在CZE实验中优化了缓冲液浓度、缓冲液pH、运行电压等条件,采用了pH2.5的0.1mol.L~(-1)NaH_2PO_4缓冲液,电压18kV,分离温度25℃。结果表明,爱维治的RP-HPLC和CZE图谱中分别有10个和8个峰,国内产品的峰数不同程度少于爱维治。在液相分析的基础上建立了质谱方法,结果表明,国内外产品共同含有5种小肽,爱维治及两家国内产品还含有其它2种小肽。小肽的分子量在300-1000Da之间,初步推断是二肽至九肽。利用自编的程序得出小肽可能含有的氨基酸,有助于小肽的序列分析。所建立的方法准确度高、重现性好,可作为评价企业产品质量的方法,对国内产品的质量控制具有一定的指导作用。无机盐对人体生命活动影响巨大,对维持人体的正常代谢及功能十分必需。本文建立了该注射液中八种常见金属离子的原子吸收测定方法。测定钾和钠时加入了0.2%CsC1作为消电离剂;测定铜、铁、锌和铅时分别对测定条件进行了优化,其灰化温度分别为1000,1400,700和800℃,原子化温度分比为2300、2500、1800、1800℃,并加了不同浓度的Mg(NO_3)_2和NH_4H_2PO_4作为基体改进剂。结果表明,国内外产品离子含量差异较大,国内产品注射用水的硬度较高,国内有一家产品的钙、镁和铁离子含量明显高于其它产品。本文的实验结果为是否将常见无机金属离子含量列入标准积累了基础数据。此外,本文还根据该药品标准的相关内容,测定了该注射液的常规质量控制项目。结果表明,国内产品的游离氨基酸含量、肽含量及呼吸活性不同程度均低于爱维治。论文分析了国内外产品存在差异的原因并提出建议,对提高国内产品质量具有一定的参考价值。
李泽勇[7]2014年在《聚氨基酸/介孔二氧化硅纳米载药系统的制备及应用研究》文中提出在肿瘤治疗领域,研究者开发出了多种载药系统用以克服药物的快速血液清除性、较差的水溶性、低肿瘤选择性以及明显的副作用。众多纳米尺度的载药系统包括脂质体、纳米凝胶、聚合物纳米粒子、无机纳米粒子以及纳米胶束被制备用于利用肿瘤的通透性增强及滞留(enhanced permeation and retention, EPR)效应将抗肿瘤药物运载至肿瘤组织。本文设计制备了一系列基于聚氨基酸/介孔二氧化硅的纳米载药系统,并围绕其开展了研究,包括以下几方面：第一章,综述了基于聚氨基酸/介孔二氧化硅的纳米载药系统的发展历史、制备方法、功能化方法以及应用,重点概述了这两类载药系统在药物控释及肿瘤治疗方面的应用。第二章,通过NCA开环聚合制备了一系列双亲性卟啉端基化嵌段聚氨基酸。DLS及TEM测试结果表明APP-L109K186在水相中可以自组装形成球形胶束；光谱分析指出其具有高的卟啉荧光量子产率；体外细胞实验指出其具有优良的生物相容性以及显着的光动力学疗效。第叁章,通过“一锅法”制备了一种基于介孔二氧化硅的智能型纳米药物传递系统CPT@MSN-hyd-DOX。此系统被证明具有如下性质：(1)、可以通过“一锅法”轻松制备CPT@MSN-hyd-DOX同时不缺乏多功能性；(2)、利用酸敏感的腙键将DOX固定在MSN的内外表面,这使得这种载体对肿瘤组织微酸环境表现得非常敏感,也就是说这种纳米粒子在血液循环过程中能够保持相对的“隐形”,同时当其通过EPR效应在肿瘤部位富集后会在肿瘤酸刺激下较快释放DOX；(3)、作为一种强疏水性抗癌药物,CPT载入MSN能够有效的被细胞摄取,并实现在细胞内的持续释放；(4)、CPT与DOX间显着的协同效应能够被肿瘤微环境酸度所激活,同时被内吞进入细胞后在内涵/溶酶体pH的作用下协同效应会得到进一步提高。也就是说CPT@MSN-hyd-DOX能够实现肿瘤酸度激活的协同化学治疗,使其具备较强的实际应用前景。第四章,在前一章的基础上利用"click"反应将N3-GRGDSGRGDS-NH2序列通过双硫键高密度键接在介孔二氧化硅表面,载药后得到了DOX@MSN-S-S-RGD。此系统被证明具有如下性质：(1)、多肽序列的高密度键接对MSN的堵孔有一定效果；(2)、RGD的引入使其具备癌细胞靶向；(3)、双硫键的引入使其具备还原敏感性,也就是说DOX在血液循环过程中药物较低速率释放,通过靶向进入癌细胞后在GSH的作用下爆释。第五章,制备了一种基于介孔二氧化硅的具有逐步酸敏感性智能型纳米载药系统MSN-SATAT&DMAK11。此系统对肿瘤组织pH及内涵/溶酶体pH均表现出分步响应性：首先通过肿瘤酸度激活的电荷翻转实现被肿瘤细胞选择性摄取,然后通过内涵/溶酶体酸度激活的电荷翻转实现快速内涵/溶酶体逃逸以及接下来的核靶向输入。
苏国万[8]2012年在《花生粕酶解及其产物呈味特性研究》文中研究指明花生粕是花生榨油的副产物，富含蛋白质，由于高温压榨和溶剂浸提导致花生蛋白严重变性，色泽和气味劣化，限制了其在食品工业中的应用。本文旨在通过生物酶解技术高效回收利用花生粕蛋白资源，提高其附加值，拓宽应用范围。主要是采用生物发酵技术诱导米曲霉分泌蛋白酶，高效水解花生粕蛋白制备富含呈味肽的呈味基料。利用多种分离技术手段对花生蛋白呈味肽进行分离纯化，并对呈味肽段进行一级氨基酸序列的鉴定，采用固相多肽合成技术合成目标肽，对比分离纯化肽与合成肽的呈味特性，明晰其呈味机理。通过研究花生蛋白肽与还原糖之间的美拉德反应，深入探讨了多肽的美拉德反应活性、热反应结合方式以及风味的释放规律，为进一步提升花生蛋白肽的呈味特性提供理论和方法指导。选用花生粕作为培养基氮源诱导米曲霉分泌适合水解花生粕的蛋白酶，通过对影响米曲霉产蛋白酶的营养源进行研究，结果表明面粉、花生粕及氯化钙的影响较大。通过单因素试验和响应面分析，确定营养源优化配方：面粉2.24g，花生粕8.46g及氯化钙0.028g，中性蛋白酶活力为15478.00U/g（40℃)。蛋白酶粗品经过硫酸铵沉淀分级、超滤膜分离及Sephadex G-75凝胶过滤层析后，纯化得到电泳纯级的中性蛋白酶，蛋白酶活力达到79551.60U/g（40℃)，其分子量约为50KDa。该蛋白酶的最佳pH为7.0，最适作用温度为50℃，在40～55℃之间蛋白酶均能保持较高的酶活力，金属离子对其无显着的激活作用。选用实验室自制酶和Alcalase、Protamex及Papain叁种商业蛋白酶水解花生粕，监测各酶水解花生粕产物中蛋白回收率、水解度、肽分子量分布，结果表明，自制酶可高效水解花生粕蛋白，蛋白回收率和水解度分别高达80.6%和43.4%，且小分子量肽段含量较高，其中有15.9%的肽分子量小于1KDa，而叁种商业蛋白酶水解花生粕产物的肽主要分布在3–6KDa之间。采用因子分析法对不同花生粕酶解液的氨基酸含量数据进行降维分析，结果显示氨基酸含量数据可分为叁个主因子，其中第一主因子可表征为营养价值，而第二主因子可表征为风味。营养评价结果表明自制酶水解可以显着提高花生粕酶解产物的必需氨基酸含量，提高其营养价值。但其它叁种商业蛋白酶对改善花生粕蛋白的营养价值作用不明显。滋味感官分析结果表明自制酶花生粕酶解液具有更高的鲜味和咸味强度，低苦味值和较高的滋味饱满度，其差异主要来源于游离氨基酸和小分子肽的影响。采用超滤、凝胶过滤色谱和半制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）等系列分离技术对花生粕蛋白肽进行分离纯化，得到两个呈味肽。采用MALDI-TOF-MS分析其分子量和氨基酸序列，结果表明鲜味增强肽分子量为1091.419Da，氨基酸序列为Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg；鲜味肽分子量为963.595Da，氨基酸序列为Ser-Ser-Arg-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg，经肽谱数据库检索，这两个肽均为首次发现的呈味肽。以鉴定得到的两个呈味肽为目标肽进行固相化学合成，分别得到两个合成肽TP-A（鲜味肽）和TP-B（鲜味增强肽）。通过RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析，结果表明合成多肽的纯度达到95%以上，且氨基酸序列与目标肽相一致。采用滋味稀释分析法评价合成多肽，结果表明合成肽TP-A的鲜味阈值为160mg/L，合成肽TP-B的鲜味增强阈值为5mg/L。通过系统比较分析蛋白和肽标准品及酶解液在Superdex Peptide HR10/30和TSKgel G2000SWXL中的分离洗脱特性，发现前者更适合用于测定蛋白酶水解物的肽分子量分布，或监控蛋白酶解液分离纯化过程中分子量变化情况。通过对热反应产物的粒径分布和肽分子量分布分析，结果表明，加热可使大分子肽发生热降解，而美拉德反应过程中肽热降解和聚合并存。肽的美拉德反应活性与其分子量分布呈负相关关系，即肽的分子量越小，其美拉德反应活性越高，产物的抗氧化性也越高。花生粕酶解液及其肽段中的挥发性风味物质种类较少，以醛类和乙酸为主。对其加热可产生系列的醛类物质和呋喃类物质，而美拉德反应可形成更多的含氮化合物。此外，研究表明卵磷脂的降解或氧化产物与美拉德反应的中间产物可形成更多的含氮化合物，一方面丰富产物的风味，同时也提升了产物的抗氧化活性。
于康宁[9]2009年在《植物硫肽素[1-3]PSK的液相合成研究》文中研究指明植物硫肽素(PSK)是近年来新发现的一种植物多肽激素,这种激素是一种硫酸化的五肽,结构特征为[Tyr(SO_3H)-Ile-Tyr(SO_3H)-Thr-Gln-OH](PSK-α)或[Tyr(SO_3H)-Ile-Tyr(SO_3H)-Thr](PSK-β)。相关资料表明这种激素普遍存在于植物体内,并对植物的生理起着重要的调节作用,但是由于在植物体内含量很低,不易提取分离,限制了人们对这种激素的进一步研究与开发。目前,虽然对PSK已经成功进行了固相合成,但是产率并不理想,而且并未利用液相合成技术对其合成工艺进行研究,以提高产率。PSK的的五肽分子中,[1-3]PSK作为分子的活性中心存在有酪氨酸硫酸化的现象,而这种硫酸化的酪氨酸作为许多多肽类激素的活性位点,在发挥激素的生理调节中起着不可替代的作用。但是由于硫酸化的酪氨酸稳定性差,容易分解,在分析以及制备时,硫酸基容易丢失,限制了人们对硫酸肽的发现与研究。因此,针对以上几点,本论文采用TBTU/DIEA/HOBt多肽缩合试剂,对[1-3]PSK分子进行了液相合成,在合成中对氨基酸的保护以及脱保护条件进行了优化,并对酪氨酸成功进行了硫酸化修饰,利用高效液相对硫酸化酪氨酸的稳定性进行了研究。实验结果表明:酪氨酸的Fmoc保护在冰浴条件下反应30min、室温反应5小时后保护产率最高,收率达到82%,在相同的条件下,苏氨酸和异亮氨酸的收率分别为88%和83%;通过在实验室制取异丁烯,对酪氨酸的羧基进行了叔丁酯保护,产率为43%。利用制备的SO_3-DMF硫酸化试剂对酪氨酸进行了硫酸化修饰,正丁醇/乙酸乙酯体系萃取,硫酸化物的产率可达到80%,避免了以往方法中过硅胶柱等繁琐的纯化条件。分别在90%、60%、30%的叁氟乙酸浓度和50℃,35℃,26℃,0℃的温度条件下,对硫酸化酪氨酸的稳定性进行了研究,并与硫酸化的苏氨酸进行了稳定性的比较,结果发现硫酸化的酪氨酸随着酸浓度的增大和温度的升高,硫酸基的分解加快,而且温度是影响硫酸基分解更重要的因素,即使在90%的叁氟乙酸中,只要保持低温就可以很好的抑制硫酸基的分解。研究还发现,同样具有侧链羟基的苏氨酸也可以被硫酸化修饰,而且硫酸化的苏氨酸更稳定,在90%的叁氟乙酸中50℃时可以维持2.5小时以上,而硫酸化的酪氨酸在相同的条件下30min内已经基本分解完全。利用TBTU/DIEA/HOBt多肽缩合试剂对[1-3]PSK分子进行了液相合成,并在合成中对Fmoc的脱除方法做了改进,首次利用甲醇/NaOH对Fmoc进行了脱除,避免了哌啶脱除时难以纯化的问题,硫酸化的叁肽最终得率达到68%。
刘聃[10]2013年在《花生蛋白肽的检测及抗氧化活性研究》文中进行了进一步梳理花生,作为一种油料经济作物,在世界范围内受到广泛的栽种,拥有巨大的生产和消费需求。花生含有丰富的营养物质,脂肪占50%,蛋白质占24%-36%,矿物质占3%、以及少量的维生素、植物固醇等。目前仅有27%的花生被用来食用,远低于国外40%的食用率。数据显示,花生的初级加工产品的出口额占其出口总额的92.7%,而精深加工产品仅占了7.3%。实际上,精深加工产品可增值2-10倍,而初级加工产品仅可增值0.5-1.0倍,因而为了提高花生的经济效益,需不断进行精深加工研究。花生肽属于花生蛋白的精深加工产品,经分解得到,属于小分子的氨基酸聚合物,是一种功能性物质。本文主要研究氨基酸分析仪测定法、双缩脲法、凯氏定氮法和紫外分光光度法在花生肽含量测定中的应用,并通过对纯化花生肽的分析,了解其特性,制备抗氧化性花生肽。(1)蛋白质沉淀剂的筛选及应用条件八种试剂叁氯乙酸、草酸、磺基水杨酸、硫酸、盐酸、磷酸、乙醇和丙酮的沉淀效果经比较发现,采用双缩脲方法时,叁氯乙酸为最佳沉淀剂；采用凯氏定氮法测定时,叁氯乙酸、草酸、磷酸和乙醇可作为沉淀剂。叁氯乙酸为最佳沉淀剂,两种方法皆可选用。用最佳沉淀剂叁氯乙酸沉淀样品中的蛋白质,其浓度可在0.66-1.32mol/L范围内选择。当0.66rmo1/L叁氯乙酸与样品1：1混匀反应,40min内,离心过滤,4h内完成测定。当1.32mol/L叁氯乙酸与样品1：1混匀反应,沉淀30min后离心过滤,2h内完成测定。清液可在低温下进行短期的保藏。(2)酸溶花生肽含量的测定经氨基酸分析仪测定酸溶花生肽的游离氨基酸和水解氨基酸的含量,算得酸溶花生肽的含量为0.49g/100g。双缩脲法的测定条件：保持清液温度与环境温度一致；TCA浓度为1.32mol/L时,至少需反应20min;低于该浓度,至少需反应30min；保持反应体系pH稳定,清液与双缩脲试剂的最佳体积比为1：3。双缩脲法测得酸溶花生肽的含量为0.69g/100g。与氨基酸分析仪测定的含量值相比,该法的测定结果偏大。根据酸溶花生肽转化系数的五种计算方式,算得KA、KA'、KP、K、K'值,分别为4.90、4.70、3.55、4.22、4.13,相应的酸溶花生肽含量分别为0.57g/100g、0.54g/100g、0.38g/100g、0.47g/100g、0.46g/100g。比较发现,K值计算得到的肽含量值0.47g/100g最接近氨基酸分析仪测得的含量值0.49g/100g。故花生肽的转化系数为4.22,远低于花生蛋白的转化系数5.46。(3)花生肽的纯化工艺按原产品工艺制备花生蛋白酶解物,将其进行脱脂和大孔树脂纯化实验。脱脂工艺：每5.00g花生肽60℃干燥3h,加入30.00mL正己烷,在70℃下,脱脂6h。大孔树脂纯化工艺：用DA201-C型大孔树脂填充柱子,将50.00mL30.00mg/mL的脱脂花生蛋白酶解物以0.5mL/min的速度上样,并用75%的乙醇以2.0mL/min的速度洗脱柱子,收集278nm波长下的纯化副产品PP1,和250nm紫外波长下的花生肽PP2。(4)纯化花生肽含量的测定10.00mg/mL PP1和PP2,经紫外分光光度法和荧光探针法测定,两者的含量值与疏水值分别为(9.47±0.086mg/mL,1328.70)、(28.13±0.13mg/mL,8146.00)。由此表明,疏水性大的,紫外测定结果偏大。双缩脲法测定时发现,10.00mg/mL PP1和PP2含量分别为1.40±0.065mg/mL.0.68±0.052mg/mL。测定结果远小于紫外测定结果。(5)纯化花生肽的抗氧化分析PP1和PP2清除羟基自由基的能力分别为4.32%和35.97%。将PP2用Sephadex G-25凝胶过滤,根据凝胶过滤的原理,按出峰顺序可知,组分分子量的大小为：组分1>组分2>组分3,而各组分清除羟基自由基的能力强弱为：组分2(42.09%)>组分1(32.01%)>组分3(19.42%),故肽的分子量越小并不意味着清除羟基自由基的能力越强。调节PP2溶液pn值,比较各pH下沉淀出的肽清除羟基自由基的能力,发现pI3肽清除能力最强。(6)含有抗氧化花生肽水解液的制备工艺以抗氧化花生肽(pI为3)清除羟基自由基的能力作为指标,对加酶量、酶解时间、酶解pn和酶解温度的正交实验水平进行选择,正交实验结果表明,最佳实验条件为：向80.00mL花生蛋白液中,加入90.00mg花生复合蛋白酶,在pn8.0、55℃下,水解2.0h。(7)抗氧化花生肽水解液中肽的转化系数及抗氧化性氨基酸的百分含量分析经计算,新工艺水解液中花生肽的转化系数为4.11。经氨基酸分析,发现水解液中酸溶花生肽抗氧化性氨基酸百分含量为28.20%；水解液中抗氧化花生肽抗氧化氨基酸百分含量为36.25%。
参考文献：
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[2]. Fmoc系列保护氨基酸的制备研究[D]. 杜秀敏. 南京工业大学. 2004
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[4]. 手性氨基醇的合成研究[D]. 何洪华. 南京工业大学. 2005
[5]. N-Boc保护氨基酸的酯化方法研究[J]. 孟庆国, 褚征, 刘克良. 中国药物化学杂志. 2005
[6]. 小牛血及血清去蛋白提取物注射液的质量控制方法研究[D]. 虞惟俊. 东华大学. 2008
[7]. 聚氨基酸/介孔二氧化硅纳米载药系统的制备及应用研究[D]. 李泽勇. 武汉大学. 2014
[8]. 花生粕酶解及其产物呈味特性研究[D]. 苏国万. 华南理工大学. 2012
[9]. 植物硫肽素[1-3]PSK的液相合成研究[D]. 于康宁. 华中农业大学. 2009
[10]. 花生蛋白肽的检测及抗氧化活性研究[D]. 刘聃. 西南大学. 2013
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