陈希哲[1]2001年在《含孔磷酸钙陶瓷为支架基因转染自体细胞成骨能力研究》文中进行了进一步梳理组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科。其是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上的又一里程碑，标志着人类将走出单纯器官移植领域，步入组织、器官再造的新时代。 骨是最早在实验室中获得组织工程化的组织之一。组织工程骨修复亟需研究的内容包括：①能分化为成骨细胞的多能干细胞；②介导多能干细胞游走、分化、增殖的促生长和分化因子；③可吸收的细胞外基质或称支架以支持干细胞在骨缺损区的游走及附着；④在整个新骨形成过程中血管网的构成。基于以上要求，本实验进行了四部分研究：1 按目前学术界普遍认可的方法进行了大鼠骨髓基质细胞的诱导培养，大鼠骨髓基质干细胞在含有地塞米松、左旋抗坏血酸、β—磷酸甘油钠等的培养基中原代培养2周已具明显成骨细胞表型；利用梯密度离心法分离并培养大鼠骨髓内皮细胞，证实了大鼠骨髓内皮细胞具有W—P小体以及其它内皮细胞共有的特征。这两种细胞都属有限细胞系，可传代、冻存及复苏。此部分结果为后续实验打下了基础。2 进行噬菌粒载体pBK-BMP_2的扩增、提纯及酶切鉴定，并利用脂质体将此穿梭质粒转染大鼠骨髓基质干细胞。通过免疫组化、原位杂交及Western Blot印迹杂交检测，从分子水平和蛋白质水平直接或间接地证实经筛选后的细胞克隆能表达、分泌外源性的BMP_2。3 应用纤连蛋白对含孔磷酸钙陶瓷进行表面修饰并证实其有利于成骨细胞的贴附和成骨表型；建立封闭群动物SD大鼠骨组织工程模型并证实其对小型试材骨修复的研究结果更接近临床；将rhBMP_2转染的自体细胞复合同体骨髓基质干细胞并种植于含孔磷酸钙陶瓷上，回植原动物皮下或肌肉内均表现明显的异位成骨能力；这种基因转染自体细胞—陶瓷复合体用于颅骨极量骨缺损的修复可取得与自体成骨细胞移植相同的效果，间接说明了转染细胞能在体表达BMP_2并促使未转染的基质干细胞分化为成骨细胞。4 通过颈总动脉墨汁灌注及透射电镜观察，系统了解并分析自体细胞—陶瓷陈希哲 下四军医大学博士学位论又 一Z一要合汁颅g极量骨缺殒修复过程中血管生成与骨形成及陶瓷降解Z问的X系，1实山向兰ISOtlS提供的含孔磷酸钙陶瓷作为骨组织工程细胞支架有利于血育和骨的丙十，随时问推移陶瓷本导可以降解；种植的成骨细胞与新上的血管内皮别胞关系密切，推测其卜必有某些问于引发的信号转导级联效口。实验设计及技术路线如下图： — — 大鼠左恻殴、温骨骨钮 1 Me＊＊＊－－H＿7w～？ri 一J～＼ F－－s－－－－－－－ WWWk’G一4％：PJ LHerylerx ’tyxtew—“。二｛ilZJZtr－ 成骨纽胞诱导培养 刀卫sC。rhB卜IP。基因转染 ＼＼／ — ———＠p—— 一 细胞一囚瓷 体构鱼 大气颅骨极量骨 修复／、 异位骨形成 回 憾
陈希哲, 杨连甲, 田卫东, 杨维东[2]2003年在《重组人骨形成蛋白2基因转染大鼠自体骨髓基质细胞成骨能力研究》文中研究表明目的 在构建的SD大鼠骨组织工程模型中 ,观察以含孔磷酸钙陶瓷为支架的基因转染自体骨髓基质细胞异位骨形成能力。方法 成年雄性SD大鼠 2 0只 ,全麻及无菌条件下取其左侧股骨及胫骨 ,将骨髓冲入75ml培养瓶中并在常规培养条件下进行体外扩增 ;5d后将部分骨髓基质细胞消化并通过LipofectAMINETM2 0 0 0介导进行重组人骨形成蛋白 (rhBMP2 )基因转染及G_4 18连续筛选 14d ;再将转染和未转染的自体细胞一同接种于经纤连蛋白表面修饰的含孔磷酸钙陶瓷上继续培养 10d,并将细胞陶瓷复合体对应地种植于大鼠背部皮下及肌肉内。分别于 2～ 2 0周处死动物 ,从形态学及组织学角度观察异位骨形成情况。结果 基因转染细胞陶瓷复合体无论种植于皮下或肌肉内均表现明显的异位骨形成能力 ;其同期骨形成与早期实验中的经诱导骨髓基质细胞陶瓷复合体异位骨形成相似。结论 应用以含孔磷酸钙陶瓷为支架的rhBMP2 基因转染自体骨髓基质细胞移植 ,可获得与诱导分化的自体骨髓基质细胞相同的成骨能力 ,说明基因转染自体骨髓基质细胞再次植入体内后 ,可相当于生物反应器 ,在增殖的同时促进干细胞的分化和成骨潜能。
高全文[3]2003年在《VEGF基因转染的骨髓基质细胞复合磷酸钙陶瓷成骨能力研究》文中进行了进一步梳理组织工程是应用细胞生物学和工程学原理，对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科。其目的是研究和开发组织替代物。本研究对用组织工程方法再造骨组织进行了一系列的研究。 1．骨髓基质细胞成骨能力的实验研究 方法：体外分离、培养MSCs，观察其生长特点并进行碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色；用矿化液连续培养，观察其骨形成能力。结果：倒置显微镜下观察，在矿化条件下，细胞传代培养5—6天后，长至铺满，细胞连续培养30天，Von-Kassa染色显示有局灶状钙盐沉积。结论：MSCs易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质细胞在体外即具有很强的成骨能力，可以形成矿化结节。因而可以作为种子细胞，用于骨组织工程。 2．人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建及鉴定 方法：利用基因克隆技术，将位于原核克隆载体pSP73上的目的基因VEGF_(165)克隆到真核表达载体pcDNA3.1上。将获得的真核表达质粒pcDNA3.1进一步用限制性内切酶酶切鉴定及基因测序，证明人VEGF_(165)基因正确克隆到pcDNA3.1真核表达载体上。 3．人血管内皮生长因子165基因转染骨髓基质细胞 方法：利用基因转移技术，将构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF_(165)通过脂质体介导转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆，用免疫细胞化学方法鉴定。免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF_(165)基因的表达。 4．骨髓基质细胞诱导培养后与磷酸钙陶瓷复合的实验研究 方法：分离的骨髓基质细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养，经矿化液诱导培养后分化为成骨细胞。将该细胞与预备处理后的磷酸钙陶瓷复合，通过细胞计数检测附着后的细胞生长增殖特性，并在扫描电镜下观察细胞 第四军医大学硕士学位论文在磷酸钙陶瓷表面的贴附情况。结论：磷酸钙陶瓷的生物相容性良好，细胞贴附后继续保持成骨细胞的表型，可以作为骨组织工程的支架材料。 5．基因转染的自体细胞与磷酸钙陶瓷复合异位成骨的研究 方法：成年雄性 SD大鼠 12只，全麻及无菌条件下取其左侧股骨、胜骨。将骨髓细胞接种入培养瓶中体外扩增培养，第sd开始用矿化液诱导培养持续1周，骨髓基质细胞向成骨细胞分化，诱导后的细胞行传代培养。l周后将骨髓基质细胞消化并在脂质体介导下进行VEGF；6s转染及G－418连续筛选 14d。然后将转染的和末转染的自体细胞混合一同接种于磷酸钙陶瓷上体外继续培养7d。最后将细胞一陶瓷复合体植入大鼠背部皮下和肌肉内。结论：应用以磷酸钙陶瓷为支架的VEGF165基因转染自体骨髓基质细胞种植，在组织工程骨周围有较多的血管形成，异位骨形成能力较好。
陈希哲, 杨连甲, 田卫东, 刘宝林[4]2002年在《重组人骨形成蛋白2基因转染大鼠自体骨髓基质细胞成骨能力研究》文中指出含孔磷酸钙陶瓷为支架基因转染自体细胞成骨能力研究
金合[5]2010年在《可注射骨修复材料结合骨碎补总黄酮修复鼠骨缺损》文中认为研究背景骨折不愈合、骨缺损发生率为5%～10%,对大范围骨缺损的修复是世界性难题。自体骨移植具有骨传导和骨诱导的双重作用,被认为是修复骨缺损的金标准,但来源有限。异种骨或同种异体骨移植有众所周知的免疫排斥限制了其使用。清华大学材料科学与工程系按照仿生思路设计的纳米复合多孔材料,以胶原分子为模板,调制钙磷盐沉积到有序排列的胶原纤维上,自组成装具有天然骨分级结构和特性的纳米晶磷酸钙／胶原复合材料(nano-hydroxyapatite/collagen composite,简称nHAC),有良好的生物相容性和可吸收降解性,以nHAC为基础制备微创原位成型可注射骨修复材料(injectable bone regeneration composite, IBRC),既可以保持仿天然骨结构的特征,又赋予了材料可注射性能,具有广阔的应用前景。中药骨碎补(Drynaria fortunei (Kunze) J. S,简称DR)具有强筋壮骨、益肾固精、散瘀止痛的作用,现代药理研究证实骨碎补总黄酮(assemble flavone of rhizome drynaria,简称AFDR)对骨折的修复有促进作用,改善微循环障碍,治疗骨质疏松症,并有一定抗炎、镇痛等作用。骨形态发生蛋白2 (Bone morphogenetic protein,BMP2)是在骨折愈合和骨改建中发挥重要作用的生长因子,已成功用于骨折不愈合及骨缺损的治疗,骨缺损应用IBRC材料修复,结合使用AFDR或BMP2,可能减轻创伤反应,提高修复质量,是中西医结合治疗骨缺损一种模式的探索。研究目的观察和对比研究IBRC结合AFDR或BMP2对骨缺损的修复效果,初步探讨中西医结合治疗骨缺损的一种模式。研究方法1)随机对照实验,以SD大鼠80只,均行双侧直径5mm的颅骨缺损模型,左侧空置做对照。分为3组处理, A组(IBRC+AFDR, n=30):右侧颅骨缺损以IBRC材料修复,AFDR灌胃2-8周；B组[IBRC+去离子水(deionized water,DW), n=30)]:右侧颅骨缺损以IBRC修复,DW灌胃2-8周；C组[IBRC-HA (Hydroxyapatite, HA)+DW,n=20]：右侧颅骨缺损以IBRC-HA材料修复,DW灌胃灌胃2-8周。分2、4、8周叁个时间点处死大鼠,抽取腹主动脉血化验血清钙、磷、碱性磷酸酶、肌酐、谷丙转氨酶；颅骨标本蜡块包埋并切片,进行苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、Masson染色观察组织学变化,碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原免疫组化染色,以及BMP2原位杂交,进行显微镜图像采集和分析光密度值,指标进行统计学处理。2)随机对照实验,以SD大鼠40只,颅骨行8mm直径的极量骨缺损,随机分为4组,A组(IBRC+AFDR,n=12)植入IBRC材料,AFDR灌胃2-8周；B组(IBRC+DW,n=12)：植入可注射IBRC材料,DW灌胃2-8周；C组(IBRC+rhBMP2, n=13)IBRC材料复合rhBMP2(15ug/ml);D组(n=3)：空白不植骨。分时间点2、4、6、8、12周处死大鼠,分别进行Micro-CT检查和HE及Masson染色组织学检查,观察修复效果。研究结果IBRC结合AFDR修复颅骨缺损实验中,血清钙、磷值及钙磷乘积在AFDR组2周时无变化,4周时均较对照组明显升高(P<0.05),8周时两组无明显差异；碱性磷酸酶在AFDR组2周时明显升高(P<0.05),4周及8周时无差异；肌酐在8周时AFDR组与DW组对比显着降低(P<0.05)。组织学观察骨缺损修复效果：IBRC+AFDR组优于IBRC+DW灌胃组,而HA组修复效果较前两者均差；碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原免疫组化染色,以及BMP2原位杂交的图像分析表明,IBRC+AFDR组较后两组阳性表达明显。颅骨极量骨缺损的实验中,IBRC+rhBMP2组修复效果最为理想,IBRC+AFDR组优于IBRC+DW组。结论1)AFDR在IBRC材料修复骨缺损的过程中,2周时提高血清碱性磷酸酶的水平,4周时可以提高血清钙、磷及钙磷乘积水平,从而对骨修复有促进作用。2)IBRC材料结合AFDR修复骨缺损,能提高修复质量,缩短修复时间。3)IBRC材料结合AFDR修复骨缺损,可以提高BMP2的阳性表达,促进修复材料的诱导成骨作用。4)IBRC械料结合AFDR修复骨缺损,能够提高Coll-Ⅰ和ALP的阳性表达,有利于骨修复的骨基质形成和矿化。5)本实验观察IBRC材料修复骨缺损主要是软骨内成骨模式。6)IBRC材料可用于修复大鼠极量骨缺损,结合AFDR能明显提高修复速度及质量,但不及IBRC材料复合BMP2的修复速度及质量。7)IBRC材料结合AFDR修复骨缺损,其效果不及IBRC材料结合BMP2的修复效果,验证了rhBMP2的有效,同时对中药促进骨修复提出挑战,传统中医治疗骨折以复方为主,深入开展复方的研究成为必要。8)AFDR按人鼠换算剂量连续灌胃8周大鼠未见肝肾毒性,并可能有增加肾小球滤过功能的作用。
参考文献：
[1]. 含孔磷酸钙陶瓷为支架基因转染自体细胞成骨能力研究[D]. 陈希哲. 第四军医大学. 2001
[2]. 重组人骨形成蛋白2基因转染大鼠自体骨髓基质细胞成骨能力研究[J]. 陈希哲, 杨连甲, 田卫东, 杨维东. 华西口腔医学杂志. 2003
[3]. VEGF基因转染的骨髓基质细胞复合磷酸钙陶瓷成骨能力研究[D]. 高全文. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[4]. 重组人骨形成蛋白2基因转染大鼠自体骨髓基质细胞成骨能力研究[C]. 陈希哲, 杨连甲, 田卫东, 刘宝林. 第叁届中国国际暨第六届全国口腔颌面外科学术会议论文集. 2002
[5]. 可注射骨修复材料结合骨碎补总黄酮修复鼠骨缺损[D]. 金合. 北京中医药大学. 2010