湖南省医药学院第一附属医院中方分院（湖南省中方县人民医院） 外科 418000
【摘 要】目的：探讨基质金属蛋白酶1即膀胱癌分子标志物尿液中的活性分析和可溶性表达。方法：行MMP1体外表达检测、明胶酶谱分析。结果：可浓性MMP1明胶降解比率为22.2%；复性MMP1明胶降解比率为14.4%，前者是后者的1.54倍。sMMP1明胶降解活性与体内MMP1明胶降解活性呈一致性，可通过对TrxA蛋白融合，对MMP1在体外的可溶性表达实现，且可溶性MMP1相较复性MMP1蛋白，明胶降解活性居更水平，与体内MMP1明胶降解活性接近。结论：利用TrxA可在大肠杆菌中MMP1的可溶性表达进行实现，相较包涵体复性的MMP1，可溶性MMP1小分子探针筛选优势更为明显，可为MMP1检测的小分子探针对更可靠的分子靶点进行筛选。
基质金属蛋白酶（MMP）与肿瘤发生、发展关联密切，在乳腺癌、胰腺癌、大肠癌中均呈高表达。有研究显示，基质金属蛋白酶1（MMP1）可用于对患者有无向高级或晚期膀胱癌发展进行预测，属一项新型生物学标记物［1］。采用小分子探针筛选法对MMP1可溶性表达及于尿液中的活性进行分析，具高灵敏、高效特点，现将相关资料回顾如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 由上海精科实业有限公司对HD-9706型紫外检测仪进行提供；由美国Thermo Scientific公司对TCA0096型PCR仪进行提供；由北京市六一仪器厂对DYCZ-24DN型电泳仪进行提供。由Novagen公司对pET-32a载体提供，由Hyclone公司对胎牛血清提供，其它试剂均为分析纯。在含10%胎牛血清的DMEM中对HEK293细胞培养。
1.2 方法
1.2.1 MMP1体外表达检测方法 （1）MMP1表达质粒构建和cDNA克隆 Hek293细胞所具有的总RNA应用Trizol试剂进行分离操作。分别采用正、反向引物逆转录PCR方法对MMP1的cDNA进行扩增。应用正、反向引物通过PCR方法对MMP1的催化结构域进行扩增。分别用Xho I和NcoI对扩增片段进行双酶切操作，在表达载体上进行连接。（2）MMP1蛋白表达：对实验用表达载体作向大肠杆菌BL21细胞进行转化的操作，细胞转化完成后，于培养基3ml LB中接种，于180r/min条件下，行12h的过液培养处理，次日将菌液于新鲜的含氨苄青霉素100μg /mL的LB培养基中接种，于37°C下行振幅培养操作，OD600为1mmol/L（包涵体）或0.5mmol/L( 可溶)的IPTG，在培养基中加入，对重组蛋白质的表达进行诱导构建，在25°C下诱导2h，在4°C条件下行6000r/min离心，对细胞进行收集，并用pH8.0缓冲液行2次洗涤，并做收集及沉淀处理，于－80°C下进行保存。（3）纯化包涵体复性和可溶性MMP1：经冷冻体对可溶性表达蛋白进行沉淀操作，于20mmol/L含溶菌酶1mg/ml的Tris-HCL缓冲液中重新进行悬浮，室温条件下，安排30min孵育。4°C条件下，开展12000r/min的离心，时间为30min，对呈不溶状态的细胞碎片和上清液进行收集，行SDS-PAGE电泳分析。针对获取的可溶部分，在Tris-HCL溶液20mmol/L中实施透析过液。对含组氨酸标签的实验用TRX-MMP1蛋白应用镍离子螯合琼脂糖进行亲和层析纯化处理。对副合蛋白含量呈最高显示的洗脱过的组分进行收集，并在裂解缓冲洗中透析过夜。自融合蛋白中，将TrxA用肠激酶裂解进行移除，可溶性MMP1应用镍离子螯合层析柱进行纯化处理。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆在对包涵体蛋白质进行处理时，在Tris-HCL缓冲液20mmol/L中对冷冻细胞颗粒进行悬浮，对细胞进行超声裂解操作，于4°C条件下，行12000r/min离心操作，时间为10min，对包涵体进行收集，完成3次洗涤处理，将包涵体于20mmol/L Tris-HCL缓冲液20ml中进行溶解，行2h的搅拌处理。在4°C条件行，行12000r/min的离心操作，行10min离心处理，用Ni 离子对上清液进行螯合层析纯化，对呈高含量显示的包涵体蛋白组分进行收集，用缓冲液对约100μg /mL左右的蛋白质溶液进行稀释。在不同浓度尿素的复性液中透析2h，并在复性不含尿素的缓解冲中进行透析12h。1.2.2 分离尿液MMP1 留取尿液4ml，用15ml超滤离心管（截留分子量50kD），经4°C条件下，5000r/min离心操作后30min，对滤出液收集，对10kD的分子量截取，离心30min，调整获取500μg浓缩样品。采用明胶酶谱法，对2.5μg总蛋白浓缩样品进行分析。
1.2.3 明胶酶谱分析 MMP1明胶酶谱条带灰度值采用Photoshop进行定量分析。在37°C条件下，安排18h孵育操作后，可对明显的蛋白降解带在实验中所需的MMP1蛋白量产生，即可定义为单位明胶酶活性。相对明胶降解活性（RDR）在相同蛋白浓度样量下进行计算，即（G0 Gs）/G0×100＝RDR(%)。其中，空白对照的降解条灰度值为G0，明胶降解条带的灰度值为Gs。
2 结果
可浓性MMP1明胶降解比率为22.2%；复性MMP1明胶降解比率为14.4%，前者是后者的1.54倍。sMMP1明胶降解活性与体内MMP1明胶降解活性呈一致性，可通过对TrxA蛋白融合，对MMP1在体外的可溶性表达实现，且可溶性MMP1相较复性MMP1蛋白，明胶降解活性居更水平，与体内MMP1明胶降解活性接近。
3 讨论
在小分子荧光探针筛选操作中，重组蛋白表达是运行基础，对呈天然构象的重组蛋白进行获取，是探针筛选中的难点和重点，应用明胶酶谱法可评估重组蛋白与源蛋白，以对分子探针筛选的进程进行改进［2-3］。相较包涵体复性蛋白，可溶性重组蛋白与天然构象更为接近，而在大肠杆菌中，MMP1蛋白重组表达易有包涵体形成，需行包涵体复性，以对活性蛋白获取［4］。本次研究示，TrxA可使MMP1溶解性提高，相较同包涵体获得的复性的MMP1，实验中可溶性MMP1所对应的明胶降解活性居更高水平，更与体内分布的MMP1活性接近。本次实验为MMP1小分子探针筛选就更可靠的分子靶点进行提供，表明明胶酶谱法为一项高灵敏、有效的检测MMP1方法。
综上，利用TrxA可在大肠杆菌中MMP1的可溶性表达进行实现，相较包涵体复性的MMP1，可溶性MMP1小分子探针筛选优势更为明显，可为MMP1检测的小分子探针对更可靠的分子靶点进行筛选。
参考文献：
[1] 栾婷，王海峰，王剑松.小干扰RNA技术在膀胱癌研究中的应用和展望[J].医学综述，2015,21(8)：1382-1384.
[2] Kiselyov A,Bunimovich-Mendrazitsky S,Startsev V.Key signaling pathways in the muscle-invasive bladder carcinoma:Clinical markers for disease modeling and optimized treatment[J].Int J Cancer,2016,138(11):2562-2569.
[3] 何俊，王海峰，王剑松.应用分子病理诊断膀胱癌的研究进展[J].医学综述，2017,23(3)：461-469.
[4] National Collaborating Centre for Cancer(UK).Bladder Cancer:Diagnosis and Management[M].London:National Institute for Health and Care Excellence,2015:117-118.
论文作者:张红祁,杨中华,刘能,蒋喜林
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年第7期
论文发表时间:2017/7/18
标签：可溶性论文; 复性论文; 蛋白论文; 活性论文; 探针论文; 分子论文; 缓冲液论文; 《中国蒙医药》2017年第7期论文;