肖龙[1]2004年在《TGF-β_1的检测和慢性移植物失功的关系》文中研究说明目的 研究移植肾组织内转化生长因子β_1(TGF-β_1)的表达与慢性移植物失功的关系，探讨TGF-β1作为预测慢性移植物失功(late graft loss)的生物学指标的可能性。方法 采用免疫组化方法在分子水平上定量检测亲属活体供肾组5例、尸体供肾组6例、对照组6例肾穿刺活检标本中的TGF-β1表达结果，并将结果与组织学诊断比较分析。结果 (1)活体供肾组和尸体供肾组发生慢性移植物失功率无显着性差异(p＞0.05)。(2)尸体供肾组TGF-β1表达率高于活体供肾组和对照组(p＜0.05)。(3)随着时间的延长，其TGF-β1表达有逐渐增高的趋势，＞12月组TGF-β1表达率高于0～3月组(p＜0.05)。(4)肾功能不全患者TGF-β1表达明显增高，其表达率高于肾功能正常者(p＜0.05)。(5)病理诊断慢性移植物失功病例TGF-β1表达明显增高，其表达率高于非慢性失功组和对照组(p＜0.05)。(6)TGF-β1的表达与肾组织细微结构的损伤严重程度可能相关，损伤越严重，表达水平越高。结论 (1)TGF-β1的表达与移植肾慢性失功有关，可能作为早期预测慢性失功的指标。(2)TGF-β_1在肾功能不全及发生慢性失功的移植肾中表达率均明显增高。(3)TGF-β_1表达率随着移植肾的存活时间延长而增高。(4)肾移植术供肾均有组织细微结构的损伤，而这种损伤，很可能就是造成术后急性排斥反应、慢性移植物失功的主要原因之一。(5)移植肾穿刺活检有助于临床诊断移植肾慢性失功及调整免疫抑制剂用量。
肖龙, 马超龙[2]2005年在《TGF-β1的检测和慢性移植物失功的关系》文中认为目的:研究移植肾组织内转化生长因子β1 (TGF-β1)的表达与慢性移植物失功的关系,探讨TGF-β1作为预测慢性移植物失功(late graft loss)的生物学指标的可能性。方法:采用免疫组化方法在分子水平上定量检测亲属活体供肾组5例、尸体供肾组6例、对照组6例肾穿刺活检标本中
丁召[3]2009年在《腺病毒介导的反义细胞外信号调节激酶2基因治疗抑制肾小管上皮—间充质转化并延缓大鼠移植肾肾病》文中认为目的：探讨细胞外信号调节激酶2(extracellular signal regulated kinase 2，ERK2)对肾小管上皮细胞向间充质转化的调控效应；建立大鼠肾移植模型，探讨腺病毒介导的反义ERK2(Adenovirus-mediated antisense ERK2，Adanti-ERK2)对大鼠移植肾肾病的延缓作用。方法：(1)构建反义ERK2腺病毒载体Adanti-ERK2及对照病毒Ad-LacZ。(2)以结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)刺激肾小管上皮细胞，观测肾小管上皮细胞表型变化及ERK2蛋白表达情况。(3)Adanti-ERK2按不同转染强度(multiplicity of infection，MOI)转染肾小管上皮细胞，确定最适转染强度。按干预因素不同将肾小管上皮细胞分为对照组(无干预因素)、Ad-LacZ组(最适MOI的Ad-LacZ)、CTGF组(加入终浓度为5ng／ml的CTGF)和Adanti-ERK2组(加入终浓度为5ng／ml的CTGF和最适MOI的Adanti-ERK2)。将肾小管上皮细胞培养72h后，细胞免疫化学法检测各组上皮细胞表型蛋白E-Cadherin和间充质细胞表型蛋白Vimentin、α-SMA的表达，Western blot法检测各组ERK2蛋白的表达；Boyden小室在第一、叁和第五天检测各组肾小管上皮细胞迁移能力的变化。(4)建立Fisher344大鼠至Lewis大鼠的慢性移植肾肾病(chronic allograft nephropathy，CAN)模型。按不同干预因素将受体大鼠分为对照组、Ad-LacZ组和Adanti-ERK2组。在移植前，对照组供肾给予HTK液灌注；Ad-LacZ组给予含有1×10~9pfu Ad-LacZ的HTK液灌注；Adanti-ERK2组给予含有1×10~9pfu Adanti-ERK2的HTK液灌注。在移植术后24周，取移植肾脏进行病理学观察；免疫组织化学法检测肾小管上皮细胞E-Cadherin、Vimentin、α-SMA和TβRI的表达以及CD4~+T、CD8~+T、ED-1~+细胞的间质浸润情况；ELISA法检测血清中TGF-β1的含量。结果：(1)成功地构建了反义ERK2和LacZ腺病毒载体。(2)肾小管上皮细胞在CTGF刺激72h后，上皮细胞表型E-Cadherin表达减少，而间充质细胞表型蛋白Vimentin和α-SMA表达增加，肾小管上皮细胞在CTGF的作用下转化为间充质细胞。在CTGF刺激肾小管上皮细胞表型转化过程中伴随有ERK2蛋白的表达上调。(3)与MOI为50和200相比较，腺病毒载体以转染强度100转染肾小管上皮细胞2天后，有95％的细胞表达绿色荧光；并且在转染后第一天和第二天，细胞存活率与对照组和MOI 50组无显着差异，确定最适MOI值为100。(4)Adanti-ERK2组以Adanti-ERK2(MOI 100)转染组肾小管上皮细胞后，在CTGF刺激下其上皮细胞表型蛋白E-Cadherin表达较对照组未发生明显的变化，Vimentin和α-SMA的表达较CTGF组明显减少；同时伴有ERK2蛋白表达的下调。(5)Boyden小室检测发现，各组细胞在第一天迁移至滤膜对侧的细胞数目无差异；在第叁天CTGF组细胞迁移数开始高于其他叁组；在第五天迁移出细胞数明显高于其他各组(CTGF组VS对照组，Ad-LacZ组和Adanti-ERK2组：45．1±1．9 VS12．7±1．4，11．6±1．7和14．6±1．6；P＜0．05)，而Adanti-ERK2组与对照组和Ad-LacZ组间差异无统计学意义(Adanti-ERK2组VS对照组：14．6±1．6 VS 12．7±1．4，P＞0．05；Adanti-ERK2组VSAd-LacZ组：14．6±1．6 VS 11．6±1．7，P＞0．05)。(6)大鼠肾移植受体鼠在移植术后24周，对照组和Ad-LacZ组移植肾呈现典型的CAN表现，间质中CD4~+T、CD8~+T和ED-1~+细胞的浸润明显。在Adanti-ERK2组移植肾肾小球硬化不明显，间质纤维化病变轻微，间质内有少量CD4~+T、CD8~+T、ED-1~+细胞的浸润。(7)在受体鼠移植术后24周，对照组和Ad-LacZ组移植肾病变区，肾小管上皮细胞E-Cadherin表达减少(对照组VS Adanti-ERK2组：71．6±6．1 VS 160．7±11．1；P＜0．05)肾间质内Vimentin(对照组VS Adanti-ERK2组：110．3±7．2 VS 47．8±6．5；P＜0．05)和α-SMA表达显着增多。Adanti-ERK2组移植肾小管上皮细胞E-Cadherin表达基本正常，Vimentin和α-SMA表达未见明显的增多。(8)在移植术后24周，对照组和Ad-LacZ组血清中TGF-β1含量明显高于Adanti-ERK2组，同时移植肾组织中伴有TβR I(对照组VSAdanti-ERK2组：146．4±10．2 VS 82．6±6．5；P＜0．05)表达增加。结论：肾小管上皮细胞通过上皮—间充质转化途径增加了肌成纤维细胞的来源，其对移植肾术后纤维化的进程有着重要的意义。在体外，CTGF可以诱导肾小管上皮细胞发生向间充质细胞转化，以腺病毒介导的反义ERK2基因治疗可以有效地阻断CTGF诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转化；ERK2信号转导通路对CTGF诱导的肾小管上皮-间充质转化有调控作用。在体内以腺病毒介导的反义ERK2的基因治疗可以延缓移植肾肾病的进展，对移植肾具有保护作用。这种保护机制可能与减少炎性细胞的浸润、下调TGF-β1等致纤维化因子及其受体的表达以及抑制肾小管上皮细胞向间充质细胞的转化有关。针对ERK2信号转导通路的基因治疗为防治肾脏纤维化提供可能的新的治疗靶点。
李毅[4]2007年在《细胞因子基因型与慢性移植肾肾病关系的临床研究》文中指出细胞因子基因多态性影响移植物预后的确切关系尚未完全阐明。近年来有研究表明,肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)与肾移植术后急性排斥反应的关系密切,转化生长因子β1(Transforming growth factor-beta,TGF-β1)与移植肾的急性排斥反应、慢性移植肾肾病均相关联,而干扰素-γ1(Interferon-gamma,IFN-γ)与慢性移植肾肾病密切相关。本文采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定了IFN-γ、TNF-α两种细胞因子的血清浓度,分析了这两种细胞因子的表达水平与基因型之间的关系;同时采用序列特异引物聚合酶链反应方法(Polymerase chain reaction-sequence specific premier,PCR-SSP)检测了肾移植供受者的细胞因子基因型,分析其与慢性移植肾肾病发生之间的关系,并探讨了免疫抑制剂用量与细胞因子表达的关系。研究结果表明,随着细胞因子基因型由低分泌型向高分泌型过渡,血清细胞因子水平逐渐升高。IFN-γ高分泌基因型组的血清IFN-γ浓度为57.18±9.16 pg/ml,明显高于低分泌基因型组(31.86±5.67 pg/ml)。TGF-β1高分泌基因型组的血清TGF-β1浓度(998.7±83.4ng/ml)、中分泌基因型组(462.3±72.4ng/ml)、低分泌基因型组的血清TGF-β1浓度(131.3±63.8ng/ml)3组比较具有统计学意义(P<0.01),两两比较差异显着,具有统计学意义。受者IFN-γ为高分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率较高(35/83,42.2%),而受者IFN-γ为低分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率较少(5/39,12.8%)。经统计学处理,两组间差异显着(χ2=10.370,P<0.05)。与此类似,受者TGF-β1为高分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率较高(39/80,48.8%),而受者TGF-β1为中/低分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率较少,两组间存在极显着性差异(8/42,19.0%,χ~2=10.259,P<0.01)。而受者TNF-α、IL-6、IL-10基因型与慢性移植肾肾病发生率之间无统计学意义。与此类似,供者细胞因子基因型亦分为高分泌型和中+低分泌型两组。供者TGF-β1为高分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率为44.4%(12/27),供者TGF-β1为低分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率为28.7%(25/87)。经统计学处理,两组间无显着性差异(χ~2=2.319,P>0.05)。与此类似,供者IFN-γ为高分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率为32.5%(26/80),供者IFN-γ为低分泌型等位基因时,慢性移植肾肾病的发生率为32.35%(11/34)。经统计学处理,两组间亦无显着性差异(χ~2=0.001,P>0.05)。综合分析供、受者关系:受者高分泌/供者高分泌IFN-γ基因型组合的受者慢性移植肾肾病发生率(6/8,75%)比所有其它基因型组合者(29/106,27.4%)明显升高(χ~2=7.935,P<0.01)。与此相反,受者低分泌/供者低分泌IFN-γ基因型受者慢性移植肾肾病发生率(11/59,18.6%)比所有其它基因型组合者(24/55,43.6%)低(χ~2=8.357,P<0.01)。而受者高分泌/供者高分泌TGF-β1基因型组合的受者慢性移植肾肾病发生率(4/4,100%)比所有其它基因型组合者(31/110,28.2%)明显升高(χ~2=9.357,P<0.01)。相反,受者低分泌/供者低分泌TGF-β1基因型受者慢性移植肾肾病发生率(12/61,19.7%)比所有其它基因型组合者(23/53,43.4%)低(χ~2=7.502,P<0.01)。在与使用免疫抑制药物关系方面,肾移植受者IFN-γ高分泌型/CsA中低剂量组慢性移植肾肾病的发生率较高(23/31,74.2%),而IFN-γ低分泌基因型/CsA用量其它组合组慢性移植肾肾病的发生率较少(19/91,20.9%,),经统计学处理,二组间存在极显着性差异,χ~2=34.783,P<0.01。IFN-γ高分泌型/CsA高剂量组慢性移植肾肾病的发生率为40%(2/5),而IFN-γ基因型/CsA用量其它组合组慢性移植肾肾病的发生率为34.2%(40/117),经统计学处理,二组间无显着性差异,χ~2=0.072,P>0.05。肾移植受者IFN-γ低分泌型+CsA高、中剂量组慢性移植肾肾病的发生率无显着性差异(P>0.05),此外,肾移植受者IFN-γ低分泌型/CsA高剂量组,慢性移植肾肾病的发生率为36.4%(4/11,),而IFN-γ低分泌型/CsA中剂量组慢性移植肾肾病的发生率为17.3%(13/75),经统计学处理,二组间无显着性差异,χ~2=2.191,P>0.05。相类似的结果,肾移植受者TGF-β1高+中分泌型/CsA中低剂量组慢性移植肾肾病的发生率较高(15/25,60%),而TGF-β1基因型/CsA用量其它组合组慢性移植肾肾病的发生率较低(27/97,27.8%,),经统计学处理,二组间存在极显着性差异,χ~2=9.110,P<0.01。TGF-β1高+中分泌型/CsA高剂量组慢性移植肾肾病的发生率为33.3%(1/3),而基因型/CsA用量其它组合组慢性移植肾肾病的发生率为34.5%(41/119),经统计学处理,二组间无显着性差异,χ~2=0.001,P>0.05。肾移植受者TGF-β1低分泌型/CsA高剂量组慢性移植肾肾病的发生率为43.8%(7/16),而TGF-β1低分泌型/CsA中剂量组慢性移植肾肾病的发生率为24.4%(19/78),经统计学处理,二组间无显着性差异,χ~2=0.649,P>0.05。研究结果表明:1、正常人群中,IFN-γ、TGF-β1细胞因子基因多态性是影响其血清细胞因子浓度高低的决定性因素。2、受者IFN-γ和TGF-β1基因型与慢性移植肾肾病有关。3、供者各种基因型未发现有能明显影响肾移植预后的证据。4、IFN-γ和TGF-β1为高分泌基因型的受者,肾移植术后用高剂量CsA治疗可减少慢性移植肾肾病发生率,而IFN-γ和TGF-β1为低分泌基因型的受者,肾移植术后没有必要使用高剂量的CsA。因此,肾移植术前常规检测供受者细胞因子基因多态性对于预测移植肾长期存活情况及慢性移植肾肾病发生的可能,更加合理地选择肾移植供受者和指导肾移植术后免疫抑制剂的个体化用药方案具有重要意义。
高英[5]2009年在《寻找慢性移植肾失功患者血清标志物及对候选标志物Galectin-7的初步研究》文中研究表明目的：慢性移植物失功(chronic allograft dysfunction，CGD)是影响移植肾长期存活的最重要的因素，但是它准确的诊断、发病机制和治疗措施还不十分明确。肾移植后诊断慢性移植物失功最可靠的方法是肾穿刺活检，但这种侵入性的诊断方法存在一些并发症，严重的可造成患者死亡。本研究的目的是利用蛋白组学二维差异性凝胶电泳(two-dimensional differential in-gel electrophoresis，2-D DIGE)和反相高效液相色谱法(reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)联合电喷射离子化质谱(electrospray ionization mass spectrometry mass spectrometry，ESI／MS)技术寻找慢性移植肾失功患者血清生物标志物，并对找到的血清候选标志物半乳糖苷凝集素-7(Galectin-7)在慢性移植物失功患者移植肾组织的表达以及其对免疫功能的影响进行了进一步的研究。方法：：1、血清样本分成4组：慢性移植物失功组(CGD)、移植后长期肾功能稳定组(long-term stable renal function，SRF)、急性排斥组(acute rejection，AR)和健康对照组(normal volunteer，N)。血清样本经多重亲和吸附柱去除高丰度蛋白处理后，使用2-D DIGE技术找到差异蛋白点。切下这些差异蛋白点，胰蛋白酶消化，经RP-HPLC-ESI／MS分析鉴定，在另一独立样本中对鉴定出的差异蛋白Galectin-7和Clusterin进行了ELISA验证；2、利用免疫组化的方法对慢性移植物失功(CGD)，移植后长期肾功能稳定(SRF)和急性排斥(AR)患者移植肾活检标本Galectin-7的表达进行了检测；3、在体外利用不同浓度(0．2μg／mL，0．5μg／mL，1μg／mL，2μg／mL)的重组Galectin-7蛋白在有或无抗CD3和CD28抗体存在时与纯化的小鼠T淋巴细胞共同培养5天，流式细胞仪检测T淋巴细胞及各亚群的增殖情况。在体外利用另一浓度梯度(2ng／mL，4ng／mL，8ng／mL，20ng／mL，200ng／mL)的重组Galectin-7蛋白与纯化的小鼠T淋巴细胞共同培养4小时和24小时，流式细胞仪检测T淋巴细胞的早期凋亡和中晚期凋亡的情况。结果：1、慢性移植物失功(CGD)组与其它叁组比较，血清中的差异表达蛋白有39个，质谱鉴定出22个差异表达蛋白，包括载脂蛋白A-I前体、补体C4-A前体、补体H因子相关蛋白1前体、补体C9前体、Galectin-7、Clusterin前体、homerin、β2糖蛋白1前体等。ELISA结果提示，慢性移植物失功(CGD)患者血清中Galectin-7的表达较移植后长期肾功能稳定(SRF)患者和健康志愿者(N)有明显增高，慢性移植物失功(CGD)患者血清中Clusterin的表达较移植后长期肾功能稳定(SRF)患者有明显增高。2、在慢性移植物失功(CGD)患者移植肾活检标本中发现萎缩的肾小管上皮细胞的胞浆有Galectin-7的高表达，并且慢性移植物失功(CGD)组肾活检标本每个高倍视野下Galectin-7阳性细胞数较移植后长期肾功能稳定(SRF)组和急性排斥(AR)组明显增多；3、体外研究发现，重组Galectin-7蛋白(0．2μg／mL，0．5μg／mL，1μg／mL，2μg／mL)能明显诱导小鼠T淋巴细胞的增殖，在与抗CD3和抗CD28抗体联用时能协同促进T淋巴细胞增殖反应，增殖的细胞主要为CD8+T淋巴细胞；重组Galectin-7蛋白(2ng／mL，4ng／mL，8ng／mL，20ng／mL，200ng／mL)在与小鼠T淋巴培养4小时和24小时后发现Galectin-7对T淋巴细胞的早期凋亡和中晚期凋亡均无影响。结论：移植肾慢性移植物失功患者血清中有一组表达差异的蛋白质，可区别于移植后长期肾功能稳定、急性排斥者和健康对照者，这些血清差异蛋白具有不同的生物功能，本研究的探索为大样本、多中心的验证奠定了基础。Galectin-7和Clusterin可能是慢性移植物失功(CGD)的血清标志物。Galectin-7在慢性移植物失功(CGD)患者血清和移植肾活检组织中高表达；重组Galectin-7蛋白在体外具有诱导和促进T淋巴细胞增殖的作用，提示Galectin-7可能在慢性移植物失功(CGD)的发病机制中发挥重要作用，Galectin-7可能成为慢性移植物失功(CGD)治疗的新靶点。
王伟林[6]2006年在《基因多态性对中国肝移植受体预后的影响》文中研究指明【前言】普乐可复(FK506，Tacrolimus)是一种新型的钙调磷酸酶(Calcineurin)抑制剂，临床研究已证实其在预防实体器官移植后急性排斥反应的发生中有卓越的效果，但是有效治疗剂量范围较窄和药物体内动力学变化大是限制其最大限度发挥疗效的障碍。近来的研究都纷纷把研究重点放在了造成钙调蛋白抑制剂个体间效果差异上来。已有研究证明，P-糖蛋白(PGP1)的生物活性对药物的个体间差异有明显的影响。PGP1是MDR1基因的编码产物，其作为一种转运蛋白可以将其作用底物从细胞膜的胞浆面泵出至细胞外，这些底物包括多种内源性代谢产物以及各种药物，而普乐可复就是其底物之一。PGP1主要分布于肝脏、肾脏以及小肠中，小肠中的PGP1主要位于成熟肠粘膜的凸向肠腔的顶端，其通过将外源性物质主动从细胞内转运至肠腔来减少肠道对这些物质的吸收。有研究证明，造成钙调蛋白抑制剂药物动力学的个体间差异的主要原因在于PGP1的蛋白活性的个体间不同。而MDR1基因(ABCB1)第3435位点(第26外显子内)的核苷酸由C突变为T将明显降低PGP1蛋白的表达。由此推测这种单核苷酸多态性可能解释了造成普乐可复个体间药动学存在较大差异的部分原因，也可能影响了此类药物口服后的吸收。【目的】探讨肝移植供受体多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)(ABCB1)3435位点多态性对受体服用普乐可复(FK506，Tacrolimus)剂量和血药浓度个体差异间的关系。【方法】选择2004年7月至2005年3月在我院接受原位肝移植术患者50例，监测口服普乐可复肝移植受体的体重、服药剂量、全血药谷浓度，在服药后1周、2周和1月设置统计检测时间点。取供体和受体外周血、病肝或脾脏标本，提取基因组DNA，PCR扩增MDR1基因，用限制性位点多态性分析(Restriction site Polymorphism，RSP)的方法检测供受体MDR1第3435位C／T基因型，同时用DNA直接测序法检测MDR1 3435位点基因型，验证PCR-限制性位点多态性分析结果。计算每日每公斤体重的FK506用量、血药浓度与每日每公斤体重的FK506用量的比值，以此对供受体MDR1基因型与受体用药间的关系进行分析。【结果】在50例受体中，MDR1基因第3435位点CC基因型、CT基因型和TT基因型各有8例(16％)、35例(70％)和7例(14％)。50例供体中有CC型15(30％)例，CT型29(58％)例，TT型6(12％)例。供受体MDR1基因型17例不符，而供受体基因型构成比无统计学差异(P＞0.05)。在本研究所观察的100例人群中，MDR1第3435位点CC型、CT型和TT型各占23％、64％和13％。为维持受体术后的目标血药浓度水平，其服用FK506的剂量存在较大的个体间差异，肝移植受体在服用FK506 1周、2周和1月时，FK506口服用药剂量分别为0.014～0.175mg／kg／d、0.017～0.182mg／kg／d、0.022～0.179mg／kg／d。MDR1CC基因型受体在术后1周、2周和1月时，每日每公斤体重的FK506用量均明显高于CT和TT基因型受体，前者血药谷浓度与每日每公斤体重的FK506用量的比值均显着低于后两者。供体MDR1基因型对这些指标无明显影响。【结论】1．肝移植术后要维持一定的血药浓度，FK506口服需药剂量在个体之间存在极大差异。2．个体之间FK506口服需药量的这种差异与其MDR1的遗传多态性密切相关。3．受体MDR1基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)较供体对这种差异的影响更大。检测受体的MDR1基因多态性对预测个体的FK506给药剂量有参考意义。【前言】随着免疫抑制治疗及预防原发病复发治疗的方案不断发展，近十年来肝移植存活率及术后生存率得到明显提高。但是，术后移植物失功仍较常见，文献报道第一年出现移植肝失功的比例大约为13％，而五年内达到35％。而出现这种情况最主要的两种原因仍然是免疫相关的移植物急、慢性排斥反应及肝脏原发疾病(在中国主要为乙型肝炎和肝癌)的复发。免疫反应的发生、发展与人体内环境的改变密切相关，而免疫活性细胞及间质细胞分泌的细胞因子决定了内环境的进一步发展。细胞因子网络在患者移植后的免疫环境中起了很大的作用，所以它们与移植后排斥反应的发生及原发病的复发等并发症息息相关。细胞因子在调节免疫反应中起了很大的作用，而且其表达量的轻微改变是乎就可以导致不同的反应结果。细胞因子的产量主要由基因控制，而其基因型在遗传上存在多态性，所以其合成量及水平存在很大的个体差异。例如，有研究显示TNF-α在启动子位置-308位点稀有碱基(G＞A)的出现可以影响其转录水平增加6至7倍。然而，IL-10-1082位G到A的突变会减少IL-10的产量。人体内的各种免疫反应或者排斥反应的发生肯定受到个人由于基因多态性造成的细胞因子产物量不同影响。目前有很多中心报道了关于细胞因子多态性与肝移植后急性排斥反应的关系，但是结果很不一致，而且此些研究主要集中高加索人种。国外有研究报道TNF-α、IL-10等细胞因子基因多态性与肝移植后丙肝复发相关，但未见与乙肝复发关系的研究报道。明确细胞因子基因多态性与肝移植后急性排斥反应和乙肝复发的关系，可制定免疫抑制剂及预防乙肝复发治疗的个体化用药方案。为此，本研究欲检测国外研究比较热，争议也比较多的叁个细胞因子，TNF-α，IL-10，和TGF-β1的基因多态性，明确其与中国肝移植患者预后的关系。【目的】本研究的目的为明确细胞因子基因多态性与中国人肝移植后急性排斥反应及乙肝复发的关系，寻找可以预测肝移植预后的基因标记，为以后制定个性化的免疫抑制及预防乙肝复发方案提供指导。【方法】随访2004年1月至2005年12月在本中心接受肝移植合并乙肝相关性疾病的患者186例，其中男性165例，女性21例，平均年龄46±9岁(19-67岁)。术后免疫抑制剂采用以环孢霉素(CSA)或他克莫司(FK506)为主的叁联方案；预防乙肝复发采用乙肝免疫球蛋白(HBIG)+拉米呋啶方案。术后对临床表现、实验室检查提示可能发生排斥反应的患者，常规B超引导下行肝穿刺活检，进行病理检查，根据病理结果诊断急性排斥反应。术后复查乙肝叁系，血清中HBsAg再次阳性定义为乙肝复发。提取入选患者肝脏或者外周血中DNA，经PCR扩增后采用ABI公司的BigDye3.1试剂盒测序，用Polyphred分析基因组α-肿瘤坏死因子(TNF-α)(-308／-238)，IL-10启动子(-1082／-819／-592)，和β1-转化生长因子(TGF-β1)(-988／-800／-509／+869／+915)的基因多态性。为验证DNA直接测序结果的可靠性，实验随机提取60例样本对IL-10基因-819位点进行PCR-限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)法分析该位点多态性与直接测序进行对比。x2(卡方)检验比较在急性排斥反应组和无急性排斥反应组及乙肝复发组和无复发组中的基因型分布，P＜0.05表示差异有显着性。【结果】本组186例肝移植患者中，随访得到41例至少发生一次急性排斥反应，急性排斥反应发生率为22％。乙肝复发29例，乙肝总体复发率为15.6％。本研究人群中未检测到TNF-α-308AA／-238AA及IL-10-1082GG等细胞因子高分泌基因型。TNF-α-308GA／-238GA及IL-10-1082GA在急性排斥反应组的分布比例分别为14.6％、2.4％及12.2％，在无急性排斥反应组中的分布比例为10.3％、3.4％及11.7％，在两组中各基因型分布无显着性差异(P＞0.05)。在乙肝复发组中TNF-α-308GA／-238GA及IL-10-1082GA基因型分布比例分别为20.7％、6.9％及20.7％，而在无复发组中的分布比例为9.6％、2.6％及10.2％，两者也无显着性差异(P＞0.05)。IL-10-819／-592两单核苷酸位点呈完全连锁不平衡，其纯合突变(CC／CC)在人群中较少见(8％)。IL-10-819／-592不同基因型在急性排斥反应组与无急性排斥反应组分布比例分别为TT(AA)31.7％与44.8％，TC(AC)51.2％与49.7％，CC(CC)17.1％与5.5％，两组间TT(AA)与TC+CC(AC+CC)分布无显着性差别(P＞0.05)。在乙肝复发组与无复发组，TT(AA)44.8％与41.4％，TC(AC)44.8％与51.0％，CC(CC)10.4％与7.6％，两组间分布比例也无显着性差别(P＞0.05)。本研究人群中未发现TGF-β1-988／-800／+915位点单核苷酸多态性。TGF-β1-509TT／TC／CC在急性排斥反应组与无排斥组中的分布分别为24.4％与27.6％、61.0％与53.8％、14.6％与18.6％；TGF-β1+869CC／CT／TT在急性排斥反应组与无排斥组中的分布比率分别为24.4％与28.3％、53.7％与40.7％，21.9％与31.0％，两基因型在两组中分布无显着性差异(P＞0.05)。TGF-β1-509TT／TC／CC在乙肝复发组与无复发组中的分布比率分别为27.6％与26.8％、44.8％与57.3％、27.6％与15.9％；TGF-β1+869CC／CT／TT在乙肝复发组与无复发组中的分布比率分别为31.0％与26.7％、31.0％与45.9％、38.0％与27.4％，两基因型在两组中分布也无显着性差异(P＞0.05)。TGF-β1-509／+869两单核苷酸位点呈连锁不平衡。【结论】1．细胞因子TNF-α，IL-10，及TGF-β1的基因多态性与中国人肝移植后排斥反应无明显相关性。2．细胞因子TNF-α，IL-10，及TGF-β1的基因多态性与中国人肝移植后乙肝复发亦无明显相关性。3．在中国人中细胞因子TNF-α-308AA／-238AA及IL-10-1082GG等高分泌基因型极少见。4．TGF-β1-988／-800／+915的单核苷酸多态性在中国人中也极少见。【前言】乙肝免疫球蛋白(HBIG)对于乙肝相关肝移植受体术后乙肝复发有明显的抑制作用，但是临床研究发现，乙肝相关性肝病患者肝移植后使用相同的药物(拉米呋啶+HBIG)预防乙肝治疗后，仍有部分患者复发了乙肝，提示乙肝相关肝移植受体对于HBIG治疗的敏感性可能存在个体差异。HBIG作为IgG抗体的一种，其在体内通过与Fc受体结合后发挥抗乙肝病毒的疗效。研究显示人白细胞表面FcγRⅢ(CD16)与ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)过程有密切关系，而其中的FcRⅢ-A是NK细胞和单核细胞表面跨膜受体，其主要作用是结合IgG，其编码基因FCGR3A第559位点具有单核苷酸多态性(T／G)，不同的等位基因分别编码氨基酸序列158位的苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)，研究显示FcγRⅢa-158V比FcγRⅢa-158F可以结合更多的IgG1和IgG3。而HBIG是IgG的一种，因而推测HBIG必然会受到FcR基因多态性的影响，从而抑制乙肝复发的效果。【目的】本研究通过检测因乙肝相关性肝病行肝移植患者的FCGR3A基因多态性，研究其人群分布特点，并分析其对HBIG临床应用效果的影响，探索FCGR3A基因多态性T／G与肝移植患者预后的关系，为更好地指导临床用药及判断预后提供参考。【方法】随访浙江大学附属第一医院肝移植中心2004年1月至2005年11月间术前诊断为乙肝相关性肝病(暴发性肝炎，急慢性重症肝炎，乙肝肝硬化，乙肝后肝癌等)施行肝移植，术后使用HBIG预防乙肝复发治疗，且存活时间大于1年的患者共77例。提取入选患者的DNA，经PCR扩增后采用ABI公司的BigDye3.1试剂盒对77例患者的FCGR3A基因型进行测序，用Polyphred分析其559核苷酸位点(T／G)的单核苷酸多态性，x~2(卡方)检验比较在乙肝复发组及无复发组中的基因型频率，Kaplan-Meier法检验比较基因型不同组间乙肝无复发累计生存率，进而分析FCGR3A基因第559位单核苷酸多态性与乙肝复发的关系。P＜0.05认为差异统计学上有显着性意义。【结果】本组77例肝移植受体(其中男性70例，女性7例)，平均年龄45.2±8.1岁，平均随访时间623±169天(360—996天)，乙肝复发16例。术后乙肝1年和2年复发率分别为14.3％和18.2％，复发时间从4天到627天(中位复发时间231天)。基因测序发现FCGR3A基因型TT 35例(45.4％)，TG 31例(40.3％)，GG 11例(14.3％)。559G基因携带组(基因型为TG或GG)42例(54.5％)，乙肝复发率为9.5％，1年和2年无复发累计生存率分别为95.2％和88.7％；559G基因未携带组(基因型为TT)35例(45.5％)，乙肝复发率为28.6％，1年和2年无复发累计生存率分别为74.3％和69.3％。x~2检验示559G基因携带组和未携带组之间乙肝复发率有显着性差异(P＜0.05)，Kaplan-Meier检验示两组肝移植术后无复发累计生存时间有显着性差异(P＜0.05)。【结论】1．中国人FCGR3A基因559位点存在单核苷酸多态性，且此突变在人群中较常见。2．HBIG预防中国乙肝相关肝移植受体术后乙肝复发的效果受FCGR3A基因559位点单核苷酸多态性影响。3．检测FCGR3A基因多态性对HBIG个性化用药有参考意义。
王平贤[7]2004年在《肾移植受者巨细胞病毒感染及其对移植肾影响的临床研究》文中认为由于免疫抑制剂的发展，特别是环孢素A(CsA)应用于临床，同种异体肾移植急性排斥反应的发生率和严重程度都已明显降低，肾移植近期效果得到了显着改善。然而，尽管应用了预防急性排斥反应足量的免疫抑制剂，肾移植远期效果却未能得以相应的提高，移植肾的平均半寿期(half-life)仍只有在7-10年，这主要是因为以间质纤维化为特点的慢性移植物肾病(CAN)缓慢而进行性地损害了移植肾，最终导致肾功能衰竭、患者恢复透析。CAN是目前移植肾长期存活的主要障碍和肾移植1年后移植物功能丧失的主要原因。CAN最基本的病理改变为细胞外基质沉积、间质纤维化。许多免疫和非免疫因素都可以导致CAN。在引起CAN的众多病因中，近年来动物实验发现巨细胞病毒(CMV)感染可能是又一个重要的原因。 CMV为人类病毒感染中常见的病原体。60～90％的健康成人曾经感染过CMV。CMV是一种弱致病因子，对免疫力正常的个体不具有明显毒力，但一旦感染，CMV即终生潜伏于宿主体内。当免疫功能下降时，机体又可新感染CMV、或潜伏的病毒再次激活、复制，形成活动性CMV感染。CMV还可与其它病原体构成二重或多重感染，严重时感染者死亡率高。 肾移植后早期由于应用了大剂量免疫抑制剂，患者术后发生活动性CMV感染高达60-80％，为此，CMV感染被认为不仅是肾移植受者术后近期死亡的重要原因，更重要的是它可能与远期慢性移植物失功有关，肾移植后能否有效、及时地防治CMV感染可能是影响移植效果的关键。 在正常情况下，只要血清抗CMV-IgM为阳性，或抗CMV-IgG由阴性转为阳性或双份血清显示抗CMV-IgG滴度升高4倍以上，即可诊为活动性CMV感染。然而，由于肾移植患者术后应用了大剂量的免疫抑制剂，其抗体反应弱而迟钝，在这个特殊的群体中，依靠血清学检查已不能做出正确的诊断。为了克服这一困难，近年来检测CMV-pp65抗原血症以判断体内有无活动性CMV感染正逐渐应用于临床。CMV-pp65为病毒的结构蛋白，它的出现是活动性CMV感染的标志。CMV-pp65抗原血症检测还可提供定量结果，抗原血症的强度可以反映机体内病毒的负荷、CMV感染的严重程度和抗病毒治疗效果等。 慢性移植物肾病(CAN)最基本的病理改变为间质纤维化。TGF-β_1是一个关键的纤第叁军医大学博士学位论文维发生因子，它通过刺激细胞外基质(胶元、蛋白多糖、纤维连接蛋白等)的合成、提高整合素(integrin)表达、降低基质降解蛋白酶的活性、调节细胞的生长分化、趋化成纤维细胞、促进某些间质细胞的增殖等，在组织的纤维化过程中起着重要的作用。TGF-pl的过度产生，在众多疾病中、特别是肾脏病中引起不可逆的组织纤维化。 目前，临床上肾移植患者术前活动性CMV感染的发生状况及其对术后CMV感染的影响、特别是 CMV感染与慢性移植物肾病的关系等问题尚未明了。虽然现在国内外对肾移植受者CMV感染的研究较多，但在临床上从CMV一pp65抗原血症定量分析的角度，研究肾移植受者术后早期不同cMv一pp65抗原血症水平与远期慢性移植物肾病(CAN)的关系至今尚未见文献报道。本研究的目的在于:①明确肾移植患者术前活动性CMV感染的发生状况及其对术后CMV感染的影响;②明确肾移植后早期活动性cMv感染是否与远期发生的慢性移植物肾病有关联、或者是哪种类型(即不同cMv一PP65抗原血症水平)的CMV感染才会导致慢性移植物肾病(C AN)的发生。③从CMv一pp65抗原血症水平上进一步明确肾移植后活动性CMV感染的发生规律。 该研究采用新桥医院1999年8月一2001年3月期间首次进行肾移植手术的217例患者为对象，术前检测患者血清抗CMV抗体和CMV一pp65抗原血症;术后对CMV一pp65抗原血症动态观察6个月;根据术后cMv一pp65抗原血症的水平和持续时间对CMV感染的严重程度进行量化、分组，对部分CMV感染严重的患者给予抗CMV治疗、或使用血管紧张素H受体拮抗剂抑制肾内TGF一p;的合成和分泌;对各组患者进行3年以上的前瞻性观察;对移植肾进行穿刺活检，明确不同类型CMV感染对移植肾内关键的纤维发生因子TGF一p lmRNA和蛋白表达的影响;检测血、尿TGF一pl浓度，明确血、尿TGF一p，浓度与远期肾功能的关系等。 通过对200多例患者前后共长达四年多的密切观察、对大量的临床移植肾穿刺标本的直接研究，本实验得出如下结论: 1、’肾移植前不仅患者CMV感染率高，而且有12.4%的患者存在着活动性CMV感染; 2、’肾移植患者术后6个月内，活动性CMV感染者发生率高达87.1%; 3、肾移植前活动性CMV感染，是导致肾移植后发生高活动性CMV感染和CMV病的重要原因; 4、在肾移植后最初6个月内，长时间高活动性CMV感染是导致移植肾远期功能损害、引起慢性移植物肾病的重要原因，而短时间高活动性CMV感染或长时间低活动性CMV感染均不会导致上述结果;第叁军医大学博士学位论文 5、长时间高活动性CMV感染在导致移植肾远期功能损害的过程中，TGF一p;起着重要的介导作用; 6、对CMV感染严重的患者，如及时给予抗CMV治疗，或使用血管紧张素H受体拮抗剂抑制肾内TGF一pl的产生，均能有效地减少肾内TGF一pl的分泌和远期慢性移植物肾病(CA
王玉新, 徐琴君, 邹和群[8]2004年在《肾移植术后高脂血症患者转化生长因子β_1及受体mRNA的表达及洛伐他汀的对其影响》文中研究说明目的研究肾脏移植术后高脂血症同转化生长因子β1(TGFβ1)及其受体TGF R3 mRNA表达之间的关系,探讨其导致慢性移植物失功的可能机制。方法肾移植术血脂正常(A组)、血脂增高患者(B组)及正常对照组各30例,B组应用洛伐他汀20mg/d进行降脂治疗,于服药后1.5、3个月法复查血脂;同时于不同时段应用逆转录一多聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测外周血单个核细胞TGF β1及其受体TGF R3 mRNA表达。结果B组血清胆固醇、甘油叁酯、低密度脂蛋白胆固醇水平均显着高于A组及对照组(P=0.000),洛伐他汀降脂治疗1.5个月、3个月后血清胆固醇、
解水勇[9]2009年在《慢性移植肾肾病肾纤维化分子病理机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景肾脏移植是终末期肾病的最佳治疗手段。虽然随着移植手术技巧的改进,组织配型、器官保存技术的提高,新型免疫抑制药物的应用,围手术期并发症及早期急性排斥反应发生率明显降低,大大增加了移植物一年的存活率,然而移植物的半寿期仍徘徊在11～12年。在过去的二十多年里,尸体肾移植的1年存活率已经普遍超过80%,而亲属供肾存活率则达到90%～95%水平。这些成就归功于我们对移植免疫学理解的加深和良好的组织配型、器官保存及普乐可复、环孢素等更强、更具选择性的免疫抑制剂的应用。虽然普乐可复、环孢素的应用明显减少了急性排斥反应的发生率及严重程度,然而在过去二十多年里的应用证明它们对于治疗移植肾慢性功能衰竭并没有多大效果,而且移植肾的半数存活率也没有明显提高。近50%的移植肾在移植后十年左右即出现移植肾功能衰竭而要重新进行血透或进行再移植治疗。目前有研究数据表明,尽管移植肾1年存活率普遍可以达到90%以上的水平,但通常每年仍然有4%～5%移植肾逐渐丧失,导致移植肾5年存活率大概为70%,10年存活率仅为50%左右。引起远期移植肾功能衰竭的最常见原因是慢性移植肾肾病,现在定义为无明确病因的移植肾间质纤维化和小管萎缩,它所引起的移植肾功能衰竭占肾移植1年后因为各种原因发生移植肾功能衰竭构成比的50%～80%。慢性移植肾肾病最主要的特征就是移植肾纤维化。肾间质纤维化是由各种细胞、细胞因子、炎症因子、炎症介质等诸多因素相互作用,导致细胞外基质(ECM)代谢失衡,在间质异常积聚所致,是一个非常复杂的过程,至今,移植肾纤维化发生、进展的关键环节和确切发病机制并未完全阐明。进一步研究慢性移植。肾纤维化的发病机制,能为寻求有效阻断CAN病变发生发展的治疗措施提供理论依据,为临床CAN的治疗及移植肾的长期存活带来曙光。目的1、研究慢性移植肾肾病(CAN)组织病理学特点。2、探讨整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、E-钙蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅳ型胶原蛋白(CollagenⅣ)在移植肾组织中表达的变化及其意义。3、探讨ILK在CAN患者移植肾纤维化中的作用及机制,进一步阐明移植肾慢性纤维化的分子病理机制,为临床治疗CAN提供相应的理论及思路。方法收集30例经移植肾穿刺活检病理确诊为无明确病因的肾间质纤维化和小管萎缩的移植肾活检标本。患者为同种异体肾移植术后1～15年出现移植肾功能减退者,平均肾移植时间为(4.5±3.2)年,其中男22例,女8例,年龄21～59岁,平均(42.4±9.0)岁。25例接受CsA+MMF+Pred叁联免疫抑制治疗方案,5例接受FK506+MMF+Pred方案治疗。供、受者血型相同,淋巴细胞毒交叉配型试验(CDC)＜10%,群体反应性抗体(PRA)＜10%,HLA之A、B、Dr位点至少有2个位点相配。另以10例正常肾组织作为对照组(正常组),均为正常供体尸肾术前穿刺活检标本,病理检查无异常,均为男性,年龄25～50岁,平均(34.8±9.6)岁。40例肾组织标本均制成蜡块,同时进行HE染色,PASM染色和Masson叁色染色,同时行IgG、IgA、IgM、Clq和C4c免疫组化检测,光镜下观察移植肾病理改变。对移植肾组织标本按照“Banff'2007”移植肾病理分类标准进行病理诊断及分级,将病理诊断为无任何特殊病因的间质纤维化和小管萎缩(IF/TA)分为:Ⅰ级轻度间质纤维化和肾小管萎缩(＜25%的皮质受累);Ⅱ级中度间质纤维化和肾小管萎缩(26%～50%的皮质受累);Ⅲ级重度间质纤维化和肾小管萎缩或丧失(＞50%的皮质受累),可以包括非特异的血管和肾小球硬化但以小管间质病变严重性分级。所有标本均采用免疫组织化学ELiVision~(TM) plus二步法检测肾组织中TGF-β1、ILK、E-cadherin、α-SMA、CollagenⅣ的表达。图像分析方法采用Leica Qwin高清晰度彩色病理图像分析系统(型号DMR+Q550),通过光学显微镜放大400倍摄取并分析图像。每例标本连续选取10个不重迭(避开肾小球和大血管)的肾小管间质高倍视野(×400,HPF),观察部位包括肾皮质、皮髓交接处和髓质部的肾小管间质,每例肾小管总数＞60个。对所选视野中的阳性信号进行图像分析,用半定量法估计各因子的表达情况。在免疫组化标本中,计算每个视野中肾小管和肾间质阳性着色的面积与视野内肾小管间质总面积(去除肾小管管腔)的比值,计算其均值代表此例患者某种成分在肾小管和间质的相对含量。统计学处理方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,ILK、TGFβ1l、E-cadherin、α-SMA和Ⅳ型胶原的表达量进行方差齐性检验(Levene检验)后,方差齐者采用单因方差分析(one-way ANOVA)比较各指标的组间差异,并采用LSD法进行两组间的多重比较;方差不齐者则采用F检验Welch法进行比较,并采用Dunnett'T3法进行两组间的多重比较,双变量相关性采用Pearson相关或(Spearman相关系数)等级相关分析,取双侧,检验水准α=0.05,P＜0.05被认为差异有统计学意义。结果1、慢性移植肾肾病患者移植肾组织学改变主要表现肾间质弥漫性纤维化,伴有淋巴细胞、浆细胞、单核细胞浸润;肾小管不同程度萎缩,排列较紊乱,基底膜增厚,部分髓质集合管代偿性扩张,蛋白管型常见;肾小球系膜基质及系膜细胞增生,基底膜增厚,肾小球毛细血管丛节段性硬化甚至肾小球完全玻璃样变,部分病例细小动脉内膜向心性纤维性增殖,管腔狭窄或闭塞。2、肾小管间质ILK、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA和Ⅳ型胶原的表达变化免疫组织化学染色显示:在正常肾脏组织,ILK无或仅有极少量表达;TGF-β1主要表达于肾小管上皮细胞胞浆中,多呈弱阳性表达;E-cadherin在小球和小管的上皮细胞胞膜上有大量表达,胞浆中有少量表达;α-SMA仅表达于血管平滑肌肌层,在肾间质偶有表达,小管上皮细胞无表达;Ⅳ型胶原主要分布在肾小球、肾小管基底膜、肾小球包曼氏囊壁和系膜区,肾间质中少量散在分布,肾小管上皮细胞中未见表达。而在慢性移植肾肾病患者移植肾组织中,ILK主要表达于肾小管上皮细胞和间质细胞胞浆中,表达水平较正常肾组织明显增强,随着间质病变程度的加重,ILK表达显着增加,分布于从近端小管到髓质集合管上皮细胞胞浆,萎缩变性的肾小管表达最为强烈,一些发生变性、坏死、脱落到管腔的小管上皮细胞也可以见到ILK阳性颗粒,肾间质细胞中亦可见到ILK表达,间质病变越重,表达量越多,范围越广;TGF-β1在小管上皮细胞、间质成纤维细胞胞浆中及间质基质区多呈强阳性表达,部分肾小球包曼氏囊壁亦有表达,偶见于间质小血管周围和血管内皮细胞中;α-SMA除表达于血管平滑肌肌层外,广泛分布于间质区域,一些管腔破坏和萎缩的肾小管上皮细胞胞浆也可见表达;E-cadherin在肾小管的上皮细胞胞膜上的表达较正常肾组织显着减少,小管间质损害越重,表达量越少;Ⅳ型胶原除在肾小球和肾小管基底膜、肾小球包曼氏囊壁和系膜区的表达较正常肾组织有不同程度增加外,在肾间质中表达亦显着增加,而且在小血管周围和管壁中也有表达,肾小管上皮细胞中则无表达。3、统计学分析结果显示,ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型胶原在移植组肾小管、间质的表达比正常肾组织显着增多,两者间差异均有显着性(P值均＜0.001),ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型胶原的表达随移植肾IF/TA的病理分级的加重而呈增加的趋势,但α-SMA在移植肾IF/TAⅡ级和Ⅲ级组间表达量差异不显着(P＞0.05)。E-cadherin的表达在移植组肾小管、间质的表达比正常肾组织显着减少(P＜0.001),并随移植肾IF/TA的病理分级的加重而呈减弱的趋势。经等级相关分析,ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型胶原表达水平均与移植肾IF/TA的病理分级程度呈正相关,(r分别为0.802、0.939、0.858和0.887,P＜0.001),而E-cadherin的表达水平与移植肾组织小管间质病变程度呈负相关(r=-0.868,P＜0.001)。在CAN患者移植肾组织中,ILK与TGF-β1、α-SMA和CollagenⅣ的表达量均呈正相关(r=0.815,r=0.700,r=0.727,P＜0.001),与E-cadherin表达量呈负相关(r=-0.618,P＜0.001),ILK与CAN患者的SCr之间呈正相关(r=0.662,P＜0.001)。TGF-β1与α-SMA、CollagenⅣ在移植肾小管间质中的表达量均呈正相关(r=0.805,r=0.870,P＜0.001),而与E-cadherin表达量呈负相关(r=0.779,P＜0.001)。结论1、慢性移植肾肾病患者移植肾组织学改变主要表现为肾间质纤维化、小管萎缩,肾小球硬化、血管内膜增生和单个核细胞浸润。2、CAN患者移植肾小管间质中ILK呈高表达,其表达水平随移植肾IF/TA的病理分级的加重有增加的趋势,与CAN患者SCr上升呈正相关,提示ILK的增加与移植肾病理改变的发生机制有关,并与CAN患者的移植肾功能减退有关。3、CAN患者移植肾小管间质中Ⅳ型胶原表达水平较正常对照显着增加,并有随移植肾IF/TA的病理分级增加而增多的趋势,说明Ⅳ型胶原的异常沉积是CAN患者移植肾纤维化的重要表现。4、正常对照肾组织中的小管上皮细胞的胞膜上有大量的上皮细胞标志物E-cadherin的表达,无肌成纤维细胞的标志蛋白α-SMA的表达,而在CAN患者移植肾坏死和萎缩的肾小管上皮细胞胞膜上的E-钙蛋白表达量明显减少,且E-钙粘蛋白的表达水平有随移植肾IF/TA的病理分级增加而呈逐渐减弱的趋势,并出现了肌成纤维细胞的标志物α-SMA,后者广泛分布于间质区域,一些管腔破坏和萎缩的肾小管上皮细胞胞浆也可见表达。这些结果提示EMT可能参与了CAN患者移植肾纤维化的发生、发展。5、在移植肾组织中,TGF-β1呈高表达,其表达水平有随IF/TA的病理分级的增加而增多的趋势,同时与Ⅳ型胶原及肌成纤维细胞的标志性蛋白(α-SMA)表达水平呈正相关,而与E-钙粘蛋白的表达呈负相关性,提示TGF-β1的上调可能诱导移植肾小管发生EMT而参与移植肾的纤维化形成。6、CAN患者移植肾组织中,ILK的表达与TGF-β1、α-SMA和CollagenⅣ的表达均呈正相关,而与E-cadherin的表达水平呈负相关。这些结果提示,ILK可能参与了TGF-β1诱导移植肾小管EMT过程,最终导致移植肾纤维化,在慢性移植肾纤维化进程中发挥了重要作用。
陈正[10]2013年在《BM-MSC诱导移植免疫耐受和修复慢性移植肾损伤的初步研究》文中提出目的：探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSC)分离、纯化和细胞鉴定的方法和超顺磁氧化铁(SPIO)标记BM-MSC方法的安全性及可行性,分析BM-MSC在体内分布与细胞输注途径的关系,以确定BM-MSC的最佳输注途径。方法：取西藏小型猪骨髓,采用密度梯度离心法对骨髓间充质干细胞进行分离和纯化,观察其生长曲线。对所获取的细胞进行成脂、成骨诱导分化,并应用流式细胞术检测细胞表面标志物CD45/CD90/CD105,以鉴定所纯化细胞是否为BM-MSC。应用SPIO对BM-MSC进行体外标记,用MTT法检测不同浓度SPIO对标记后细胞活力和增殖能力的影响。建立西藏小型猪同种异体肾移植模型,分别经移植肾动脉和经髂总静脉输注SPIO标记的BM-MSC,切取受体猪各器官,通过普鲁士蓝染色和透射电镜观察标记的BM-MSC在移植肾、肺脏及其他器官的分布情况。结果：应用梯度密度离心法可获取高纯度的BM-MSC,细胞具有良好的生长活力和传代能力。BM-MSC可经诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,应用茜红素和油红O染色可检测出细胞中钙结节和脂肪颗粒；经流式细胞术检测细胞表面标志物CD90阳性率为96.9%,CD105阳性率为95.7%,CD45阳性率为1.1%(阴性)。SPIO对BM-MSC的标记率接近100%,通过MTT法检测25ug/ml的SPIO对BM-MSC的增殖能力影响较少、又可有效标记细胞是比较适宜的标记浓度,50ug/ml的SPIO标记细胞2天后细胞活性减退。透射电镜可观察到BM-MSC细胞内小囊泡包含的高密度铁粒子。采用供肾动脉与髂总动脉、供肾静脉与髂总静脉端侧吻合的方式成功建立西藏小型猪肾移植模型,将标记的BM-MSC分别经移植肾动脉和髂总静脉输注后,观察BM-MSC在受体猪体内分布显示：经移植肾动脉输注组,BM-MSC在移植肾内定植的细胞数明显多于经髂总静脉输注组,且存在统计学差异；经髂总静脉输注组,肺内的细胞数增加,有统计学差异。两种输注途径均未发生血管栓塞、感染等并发症。结论：采用密度梯度离心法可获取高纯度、生长活力良好的BM-MSC;利用细胞外形特征、诱导定向分化和细胞表面标志物可成功鉴定BM-MSC;应用SPIO标记BM-MSC的方法简便可行,易于细胞在体内示踪；经移植肾动脉输注BM-MSC是安全和理想的输注途径,有利于BM-MSC在移植肾内定植、分化。目的：通过对亲属活体肾移植受者输注自体间充质干细胞联合应用低剂量FK506进行免疫诱导,观察移植术后受者的移植肾功能、淋巴细胞亚群及比例和急性排斥反应发生率等指标,探讨自体骨髓间充质干细胞诱导移植免疫耐受的效果及其作用机制。方法：随机选择2009.9-2012.9在我中心拟行亲属活体供肾移植的慢性肾功能不全(尿毒症期)患者,按照纳入标准入组,分为不输注自体BM-MSC的对照组(10例)和输注白体BM-MSC的实验组(10例)。实验组在术前1月行自体骨髓间充质干细胞制备,分别在术中、术后1周和术后1月共3次输注自体BM-MSC。首次在术中经移植肾动脉输注,细胞数5×106；术后1周和1月经外周静脉输注,细胞数1×106/kg/次。对照组FK506初始剂量为0.08mg.kg-1.d-1,实验组FK506初始剂量为0.04-0.05mg.kg-1.d-1,吗替麦考酚和强的松用量两组相同。术后动态观察移植肾功能、24小时尿蛋白、淋巴细胞计数和比例,应用流式细胞术检测淋巴细胞亚群及比例,并行程序性移植肾穿刺活检,以观察急性排斥反应的发生率等。结果：采用梯度密度离心法可获取高纯度BM-MSC,其细胞表型为CD44+CD29+CD105+CD48+CD34+。20例受者手术成功,术后未发生移植肾动静脉栓塞、DGF、感染、GVHD等并发症。对照组中1例在移植术后7天发生急性血管性排斥反应并移植肾破裂,实验组未发生急性排斥反应。实验组与对照组均可维持良好的移植肾功能(Cr和Ccr)；实验组在术后早期(1周)24小时尿蛋白定量为308.1+55.1mg,低于对照组727.2±178.1mg, P<0.05,有统计学差异；实验组与对照组淋巴细胞计数和比例、NK细胞的比例、T淋巴细胞亚群CD3+CD4+、CD3+CD8+的计数和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、Treg细胞的比例在术后各时间观察点(术后1周、1月、3月和6月)均无统计学差异,P>0.05。结论：自体骨髓间充质干细胞联合低剂量FK506能获得理想的移植肾功能,在早期可促进移植肾急性损伤的修复；可获得有效的免疫抑制效果,对淋巴细胞计数和比例、NK细胞的比例、T淋巴细胞亚群计数及比值达到有效调节；可以上调Treg细胞的比例,在一定程度上诱导移植免疫耐受。目的：通过对慢性移植肾肾病(CAN)的患者输注骨髓间充质干细胞(BM-MSC),观察移植肾功能和移植肾间质纤维化等指标的变化,探讨BM-MSC对慢性移植肾肾病患者移植肾功能的影响和修复慢性移植肾损伤的机制。方法：选择2009.12-2012.6确诊为慢性移植肾肾病且符合纳入标准的的患者10例,制备第叁方健康骨髓间充质干细胞,予CAN患者共叁次输注BM-MSC,输注时间为0天、7天和1月。首次在DSA引导下经移植。肾动脉输注,细胞数1.0×106/kg；第2、3次经外周静脉输注,细胞量为5.0×106/kg。临床观察指标包括：Cr、BUN、Ccr、24小时尿蛋白、血/尿β2微球蛋白。在治疗前和治疗后6月行移植肾活检,应用JD图像分析系统检测肾间质纤维化指标(LN、FN、TGF-β、 CTGF)的变化。结果：除1例患者在第2次输注BM-MSC时出现过敏反应外,未发生出血、移植肾动脉栓塞、假性动脉瘤和感染等与BM-MSC输注相关的并发症。移植肾功能Cr和BUN在治疗前为203.7±46.4umol/L、15.43±8.46mmol/L,治疗后1周、1月分别为185.5±46.2umol/L,12.15±4.96mmol/L和172.6umol/L、11.76±5.12mmol/L,与治疗前比较有下降,差异有统计学意义,P<0.05；而3月及以后的移植肾功能Cr、BUN与治疗前比较,差异无统计学意义。Ccr在治疗后7天、1月、3月分别为43.18±18.04ml/min,43.18±18.04ml/min,48.04±22.34ml/min,较治疗前38.01±12.96ml/min增加,差异有统计学意义,P<0.05。治疗后1月24小时尿蛋白定量为478.5±289.3mg,较治疗前(105.6±327.3mg)减少,差异有统计学意义,P<0.05；治疗后3月及以后则无统计学差异。肾间质纤维化指标FN、LN在治疗6月后的平均光密度值为(0.174±0.027,0.199±0.015)与治疗前(0.182±0.019,0.212±0.013)相比有下降,但差异无统计学意义,P>0.05; TGF-β和CTGF在治疗6月后的平均光密度值为(0.16±0.015,0.139±0.025)与治疗前(0.212±0.017,0.192±0.010)相比有下降,且差异有统计学意义,P<0.05。结论：慢性移植肾肾病在接受BM-MSC治疗后,血肌酐和尿素氮在1月内均有降低,内生肌酐清除率在3月内有所增加；24小时尿蛋白定量在1月内有所减少；肾间质纤维化相关的指标TGF-β和CTGF的表达减少。
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