（娄底市疾病预防控制中心职业病医院 湖南娄底 417000）
摘要：目的 应用线性探针技术研究娄底市结核菌的耐药检验，从而获取该技术有效的价值评价。方法 收集2015年10月-2017年10月娄底市255例肺结核患者，其中初治涂阳患者225例，复治涂阳患者30例。并对所有患者的痰涂片进行线性探针技术进行检验，同时加以药敏试验作为对照。结果 线性探针技术和对照药敏试验异烟肼耐药率分别为9.0%和9.8%。利福平耐药率分别为5.5%和5.9%。2种方法的耐药率差异均无统计学意义（P＞0.05）。在与比例法药敏试验对照的情况下，线性探针技术检测异烟肼、利福平的耐药率分别为98.0%和98.8%。异烟肼的敏感度为80.0%，特异度为100%。利福平的敏感度为82.4%，特异度99.6%。结论 娄底市结核杆菌对异烟肼和利福平的耐药率低于全国水平。线性探针技术检测异烟肼和利福平有较高的敏感度。故该技术对结核患者的病情，尤其是产生多重耐药性患者的诊治有较大帮助。
关键词：线性探针技术；肺结核；利福平；异烟肼；药敏试验
Value evaluation of linear probe technique in drug resistance test of Mycobacterium tuberculosis in Loudi
Abstract Objective：To study the drug resistance test of Mycobacterium tuberculosis in Loudi city by linear probe technique，and to obtain the effective evaluation of the technique. Methods：a total of 255 patients with pulmonary tuberculosis were collected from October 2015 to October -2017 in Loudi，including 225 cases of initial smear positive patients and 30 cases of Retreatment Smear Positive patients. The sputum smear of all patients was tested by linear probe technique，and the drug sensitivity test was used as control. Results：linear probe technique and controlled drug sensitivity test showed that isoniazid resistance rates were 9% and 9.8%，respectively. Rifampin resistance rates were 5.5% and 5.9% respectively. There was no significant difference in drug resistance rate between the 2 methods（P > 0.05）. When compared with the proportional drug susceptibility test，the linear probe technique for detection of isoniazid and rifampicin resistance rates were 98% and 98.8%，respectively. The sensitivity and specificity of isoniazid were 80% and 100%，respectively. The sensitivity and specificity of rifampicin were 82.4% and 99.6% respectively. Conclusion：the resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin in Loudi city is lower than that of the whole country. Linear probe technique has higher sensitivity in detecting isoniazid and rifampicin. Therefore，this technique is helpful for the diagnosis and treatment of tuberculosis patients，especially in patients with multiple drug resistance.
[Keywords] linear probe technique；pulmonary tuberculosis；rifampin；isoniazid；drug sensitivity test
结核病是可造成人类死亡的常见感染性疾病，是全球公共卫生面临的重大威胁[1]。而临床上抗生素的盲目使用和一系列不规范的化疗方案的制定使耐多药肺结核的发生率逐年增加。我国是耐多药肺结核的高发的地区之一。肺结核本身的治疗原则就为“早期-联合-适当-规律-全程”，再加上耐多药菌株的出现，使治疗变得更加棘手，病人不得不面对难以控制的感染和高昂的抗生素费用。而传统的病菌培养和药敏试验通常需要花费长达3个月的时间才能完成。显然这是与“早期”原则相悖。而线性探针技术是一种以DNA杂交技术为支撑的新兴技术，可快速且特异地检测出病原菌[2]。为进一步评估线性探针技术的价值及其应用于基层的可行性，我中心职业病医院进行了一系列研究及统计，结果报告如下。
1资料与方法
1.1资料
2015年10月-2017年10月娄底市登记的255例患者，其中初治涂阳患者225例，复治涂阳患者30例。男性201例，年龄跨度为22岁-65岁，平均年龄37岁；女性患者54例，年龄跨度为20岁-71岁，平均年龄为42岁。
1.2方法
1.2.1标本收集
对每一例涂片阳性的患者留取的痰标本进行罗氏培养，并与3天内进行线性探针技术检测。
1.2.2线性探针技术检测方法[3]
1.2.2.1DNA提取
取处理后的痰标本500μl加入离心管内，10 000g离心后，弃上清，加入去离子水，涡旋振荡重悬沉淀物，10 000g离心15 min；95℃水浴中孵育20 min，裂解15 min后，12 000g离心10 min，取5μl上清液用于PCR检测。
1.2.2.2扩增
扩增程序：20 min 95℃，1个循环；30 s 95℃，3min 58℃，10个循环；30 s 95℃，50 s 53℃，40 s 70℃，25个循环；0min 70℃，1个循环；54℃24 h。
1.2.2.3杂交
取PCR扩增产物和变性裂解液各20μl加入杂交反应板混匀，孵育5 min，然后加入杂交缓冲液1 ml，混匀，将标记好的探针试条加入槽中，在杂交仪上45℃孵育30 min后将杂交液彻底吸出，再加入1 ml严格漂洗液，45℃杂交仪孵育15 min。向每个槽中加入1 ml按1：100稀释的标志物，杂交仪振动平台上孵育30 min。再向每个槽中加入1 ml按1：100稀释的底物并静止避光孵育15min。将试条取出，干燥，然后粘贴在判读表上。
1.2.2.4判读
线性探针技术试条共有27个反应条带，可分为4个区。第1区是3条质控条带，后3区均为耐药相关基因探针区。第2区是与利福平耐药相关的rpo B基因探针组。第3区和第4区分别是与异烟肼耐药相关的kat G基因探针组和inh A基因探针组。这3区均是第1个条带为基因位点质控带，后面为野生位点探针和突变位点探针。判读时野生条带都显色，突变条带不显色判为敏感；而野生条带有缺失，或突变条带显色则判为耐药。
1.2.3分枝杆菌固体培养和药敏试验方法[4]
1.2.3.1分枝杆菌固体培养
痰标本经2倍于痰标本量的4%Na OH消化液进行前处理，接种到酸性罗氏培养基培养。
1.2.3.2比例法药敏试验
用接种环取一环培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对制成1 mg/ml菌悬液，梯度稀释为10 mg/ml~2 mg/ml和10 mg/ml~4 mg/ml，分别接种含异烟肼（0.2μg/ml）和利福平（40μg/ml）的药敏试验培养基，放入细菌培养箱中，37℃培养6周，观察结果。
1.3统计学处理
采用SPSS 16.0软件进行数据统计，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1耐药情况
对227例具有完整耐药结果的患者进行线性探针和比例法药敏对照分析，线性探针试验和比例法药敏试验异烟肼耐药率分别为9.0%和9.8%，差异无统计学意义（P＞0.05）；利福平耐药率分别为5.5%和5.9%，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。
表1 耐药情况对比（n，%）
3讨论
近年来全球结核病的发病率呈上升趋势，这与临床上抗生素的滥用和错用有着很大的关系。耐多药结核菌株病的出现、人口老龄化的加剧、人类生活环境条件的恶化等多因素共同作用下，该疾病变得越来越棘手。目前，我国耐多药结核病中获得性耐多药率处于较高水平[5]。而目前不合理用药、尚不完善的治疗管理措施、稀缺的高质量药物与间断的不规律用药等多种隐私共同导致耐多药菌株的繁殖率不断攀升，已成结核病防治的重中之重。早期准确的诊断以及及时且规律的治疗是控制耐药结核病的关键[6]。传统细菌培养及药敏比例法一般需要2-3月之久的时间。而且在确诊前，耐多药结核病的患者的身体情况大多对初期的化疗方案不耐受，导致治疗效果较差，同时可能存在的药物错用会造成耐药谱进一步扩大，增加传播风险。而线性探针技术对诊断耐多药肺结核，不仅诊断多在24 h内得出，解决了传统固体细菌培养和药敏试验时间过长的问题，具有快速、准确的特点[7]。本次研究得出检测耐异烟肼敏感度80.0%，特异度为100.0%，耐利福平敏感度为82.4%，特异度为99.6%，接近赵雁林等报到文献的结果[8]。本研究结果显示线性探针技术与固体药敏试验之间，二者耐异烟肼一致率达98.0%，耐利福平一致率更是高达98.8%，说明该技术对诊断耐药结核病具有较好的可靠性。
综上所述，线性探针技术对于检测和诊断耐药肺结核具有较高的敏感度。为耐药肺结核提供了诊断依据，避免了治疗初期的盲目用药，缩短了患者的病程，大大降低患者的负担，同时还保护了众多高风险人群免于罹患此病，做到早发现，早治疗。
参考文献
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[8]李强，赵雁林.197例临床结核杆菌分离株的快速耐药性检测报告[J].中国防痨杂志，2009，31（12）：709-712.
论文作者:周百花,王小菊
论文发表刊物:《航空军医》2017年24期
论文发表时间:2018/2/4
标签：探针论文; 线性论文; 异烟肼论文; 利福平论文; 娄底市论文; 患者论文; 技术论文; 《航空军医》2017年24期论文;