哈尔滨市传染病院 黑龙江 哈尔滨 150030
【摘要】：目的 观察分型哈尔滨市丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒（HCV）基因分型情况。方法 选择我院2012年9月-2017年8月收治的158例丙型肝炎患者的血清样本作为研究对象，使用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增，PCR产物纯化后进行测序分析，测序结果与参考序列共同构建系统进化树，得到病毒的基因型并进行分析。结果 本组158例丙肝患者血清标本中，成功扩增core片段139例，扩增成功率为87.97%。在139例片段中，HCV 1a型8例，占5.76%；HCV lb型67例，占48.20%；HCV 2a型42例，占30.22%；HCV 3a型11例，占7.91%；HCV 3b型5例，占3.60%；HCV 6a型6例，占4.32%。结论 哈尔滨市HCV基因型主要以1b型为主，其次为2a型，与中国其他地区HCV基因型的分布比较一致。
【关键词】：RT-PCR；丙型肝炎病毒；测序；基因分型
Distribution and Clinical Significance of Hepatitis C Virus Gene Classification in Harbin
bstract: Objective To observe the genotyping of hepatitis C virus(HCV) in patients with hepatitis C in Harbin. Methods The serum samples of 158 patients with hepatitis C admitted to our hospital from September 2012 to August 2017 were selected as the subjects for study, and were amplified using the reverse-polymerase chain reaction(RT-PCR) andpurified for sequencing analysis. Sequencing results and reference sequences were used to construct the phylogenetic tree to obtain the genotype of the virus and analyze it. Results in 158 patients with hepatitis C, 139 cases of core fragment were successfully amplified, and the success rate was 87.97 %. Of the 139 cases, 8 were HCV 1A, accounting for 5.76 %; 67 cases of HCVlb type, accounting for 48.20 %; 42 cases of HCV2a, accounting for 30.22 %; 11 cases of HCV3a, accounting for 7.91 %; 5 cases of HCV3b, accounting for 3.60 %; 6 cases of HCV6a, accounting for 4.32% Conclusion The genotype of HCV in Harbin is mainly type 1B, followed by type 2A, which is consistent with the distribution of HCV genotype in other parts of China.
[Keywords]: RT-PCR; Hepatitis C virus; Sequencing; Gene typing
丙型肝炎是临床上常见的肝炎类型之一，丙型肝炎病毒(HCV)是导致丙型病毒性肝炎的主要病原菌。HCV为单正链RNA病毒，由于HCV-RNA病毒聚合酶的特点，其自身基因极易发生变异，分为6个基因型和11个亚型，且HCV基因型的分布具有明显的地域性，我国HCV的主要基因型为1、2、3型[1]。为全面哈尔滨市HCV基因型的分布情况及其临床特点，本文检测了院2012年9月-2017年8月收治的158例丙型肝炎患者的血清样本，对病毒基因分型进行检测，以期为丙肝的防治方案提供科学参考依据。
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1 资料与方法
1.1一般资料 选择我院2012年9月-2017年8月收治的158例丙型肝炎患者的血清样本作为研究对象。所有患者均为赤峰地区户籍，均为汉族。其中，男性患者84例，女性患者74例，年龄19-76岁，平均年龄（51.2±10.3）岁。
1.2仪器与设备 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定血清中HCV RNA的含量，检测设备购自美国ABl7500荧光定量PCR仪，HCV RNA定量试剂盒购自上海科华公司。同时，采用sanger测序法检测HCV基因型，检测设备购自美国公司生产的ABl3730基因测序仪。
1.3 PCR以及测序引物设计 自GenBank下载HCV 1-6各亚型核酸序列，进行序列联配后，选择NS5B区的保守序列设计简并引物，序列如下：HCV-Fa为：TTCTCRTATGAYAC-CCGCTGYTT；HCV-Ra为：CCTVGTCATAGMCTCCGT-GAA；HCV-Fb为：CCHATGGGCTTYTCTTACGACAC；HCV-Rb为:GGGGCYGAGTAYCTGGTCATGGC。其中，5型HCV应用HCV-Fa及HCV-Ra进行检测，6型HCV应用HCV-Fb以及HCV-Rb进行检测。引物由上海英潍捷基公司合成。
1.4病毒RNA提取及cDNA制备 使用病毒RNA纯化试剂盒抽提血清中的病毒RNA；经过37℃，60min逆转录为cDNA，存于-20℃冰箱中备用。
1.5 HCV NS5B区片段的扩增PCR体系 上下游引物各0.5μL，KOD酶0.4μL，cDNA 2μL，dNTP 2μL，KOD Buffer 10μL，总体积共20μL。PCR扩增条件如下：94℃2min，98℃10s，59℃30s，68℃25s，共进行40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
1.6 PCR产物测序取 CIP 0.1μL，Exonuclease I 0.5μL，ddH2O 1.4μL，PCR产物9μL进行纯化；然后，取纯化产物按ABI试剂盒使用说明加入BigDye进行测序反应，终产物经乙醇纯化后加入HiDi溶解，然后于ABI3500遗传分析仪上进行测序。每个样品均进行正反向测序。
1.7样本HCV基因型分析 将测序结果用Chromas进行核苷酸峰型校对，再通过DNA star软件的SeqMan模块进行序比对及联配，最终经MegAlign模块进化同源对比及系统进化树分析，获得基因分型结果。同时，与美国国立生物技术信息中心（NCBI）病毒基因分型数据库进行对比，以便进一步的确认检测结果。
2 结果 本组158例丙肝患者血清标本中，成功扩增core片段139例，扩增成功率为87.97%。在139例片段中，HCV 1a型8例，占5.76%；HCV lb型67例，占48.20%；HCV 2a型42例，占30.22%；HCV 3a型11例，占7.91%；HCV 3b型5例，占3.60%；HCV 6a型6例，占4.32%。
3 讨论
丙肝是一种传染性疾病，主要由血液途径传播，HCV慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌。HCV基因具有高度变异性，当前HCV基因型主要分为6个基因型及80多个基因亚型。HCV基因型具有显著地域差异性，国家及地区不同，HCV基因型分布也不一致[2]。据我国的流行病学调查结果显示，我国大多地区HCV基因型主要为1b基因型，2a基因型次之，在南方城市1b基因型的感染率约为90％，由南向北，2a基因型的感染率逐渐升高[3]。本组研究结果显示，本组158例丙肝患者血清标本中，成功扩增core片段139例，扩增成功率为87.97%。在139例片段中，HCV 1a型8例，占5.76%；HCV lb型67例，占48.20%；HCV 2a型42例，占30.22%；HCV 3a型11例，占7.91%；HCV 3b型5例，占3.60%；HCV 6a型6例，占4.32%。综上所述，哈尔滨市HCV基因型主要以1b型为主，其次为2a型，与中国其他地区HCV基因型的分布比较一致，为该地区HCV患者的治疗和疾病控制提供了指导依据。
参考文献
[1]陈奕磊，孙翠莲，王淑一.浙江地区丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒基因分型研究[J].检验医学与临床,2015,12(26):43-45.
[2]谢知兵，周建亮，李勇忠，等.怀化地区丙肝基因分型分布及临床意义[J].中国现代医学杂志,2013,23(31):43-46.
[3]尚明全，李连友，李连兴.赤峰地区丙肝基因分型及其临床意义分析[J].中国卫生标准管理,2017,8(5):2-4.
论文作者:闫桂敏
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第07期
论文发表时间:2018/10/1
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