段祥[1]2007年在《骨髓间充质干细胞向神经细胞、成骨细胞诱导分化的研究》文中研究说明骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的非造血干细胞，具有自我复制能力和多向分化潜能。在不同的条件下可以诱导分化为多个细胞系，包括成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞及神经细胞等。骨髓间充质干细胞还具有取材方便，对机体损伤小，体外培养增殖能力强等优点，选用自体骨髓间充质干细胞进行组织再生或移植，不仅没有移植排异反应，还避免了伦理纷争。因此，对骨髓间充质干细胞的研究成为当今生物医学的热点，骨髓间充质干细胞也被认为是最有前途的组织工程的种子细胞。1 BMSCs的分离培养和生物学特性为了建立一个有效的分离培养，体外扩增的方法，本实验比较了叁种常用的分离培养方法，结果显示用Percoll淋巴细胞分离液进行不连续密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞能够在较短的时间内实现BMSCs的体外扩增和纯化。将得到的BMSCs在倒置相差显微镜下观察其形态，发现90％以上的细胞表现为BMSCs典型形态。用MTT法描绘细胞生长曲线证实细胞生长状况良好，且增殖状况与接种密度有关。用流式细胞仪鉴定第5和20代细胞表型，CD29、CD90、CD44、CD106、CD71表现为阳性，CD34、CD45为阴性，证明BMSCs稳定传至20代，表型没有变化。2 BMSCs向神经样细胞的诱导分化常用的诱导BMSCs向神经细胞分化的诱导方案是将成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、丁羟基茴香醚(butyl hydroxy anisol，BHA)联用。本实验BMSCs分别用(1)bFGF+DMSO+BHA；(2)bFGF+DMSO；(3)DMSO+BHA；(4)DMSO四种不同的诱导方案诱导，发现用(1)诱导的BMSCs在29小时内有80％左右变成神经样细胞，而其他叁组则需更长的时间。同时使用方案(1)时，细胞形态变化较其他叁组变化更快，更明显。这四组诱导得到神经样细胞均可以表达神经特异性标志neuron-specific enolase(NSE)。用方案(1)29h可以得到80％细胞阳性，而此时其他各组基本为阴性表达。使用方案(2)(3)(4)需要32h左右可以观察到BMSCs形态变化成神经元样，免疫荧光染色约80％阳性。将各组诱导后的细胞继续用无血清L-DMEM培养24 h，发现用(3)(4)两种方案诱导得到的细胞出现老化死亡现象。为了检测这些神经特异标志在BMSCs向神经样细胞分化过程中的表达，将BMSCs用含血清和bFGF的L-DMEM预诱导24 h，然后用含有DMSO和BHA的无血清L-DMEM继续诱导。在这个过程中发现nestin的表达要早于NSE和β-tubulin的表达，因为nestin是神经干细胞的标志，而后两者是神经元的标志。最后，将BMSCs和用其诱导分化成的神经样细胞预先用BrdU标记，然后局部移植入脊髓横断的动物模型体内，用BBB评分来评价术后1-12 w动物的行为表现及功能恢复情况。结果显示移植细胞的动物整体功能恢复情况要好于对照组。用免疫组化法对横断部位脊髓切片染色也发现许多BrdU阳性的细胞。3 BMSCs向成骨细胞的诱导分化为了检测不同诱导起始时间对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响，开展了如下工作。分别在(1)BMSCs接种当时，(2)50-60％融合时，(3)85-95％融合时加入成骨诱导剂开始诱导。倒置相差显微镜下观察增殖分化情况，分别进行碱性磷酸酶染色(钙钴染色)和钙结节染色(von kossa染色)。诱导过程中可以观察到BMSCs逐渐向成骨细胞形态转变，碱性磷酸酶染色和钙结节染色呈现阳性。结果显示在BMSCs 85-95％融合时开始诱导的细胞碱性磷酸酶和钙结节染色阳性率更高而碱性磷酸酶活性增强更明显。为了评估不同传代倍数的BMSCs成骨诱导分化能力的高低，将5、10、15、20四代细胞同时开始向成骨细胞诱导，发现这四代细胞分化成成骨细胞的能力没有明显不同。本实验为进一步研究BMSCs向神经、成骨细胞分化的机制提供实验依据。
徐路尧[2]2008年在《Rac1与骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程关系的研究》文中认为目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓中除造血干细胞外另一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。在不同的条件下可以诱导分化为成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞及神经细胞等。另外,骨髓间充质干细胞具有取材方便,对机体损伤小,体外培养增殖能力强等优点,选用自体骨髓间充质干细胞进行组织再生或移植,不仅没有移植排异反应,还避免了伦理纷争。因此骨髓间充质干细胞被认为是最有前途的组织工程种子细胞。诱导骨髓间充质干细胞向神经系统组成细胞分化是目前研究的热点,而BMSCs的准确诱导定向分化是其用于临床治疗的基础,这就需要对BMSCs有关的信号调节、微环境作用进行深入研究。目前研究发现BMSCs向神经样细胞诱导分化大致上可分为四种途径:细胞生长因子为基础的诱导、提高胞内cAMP为基础的方式诱导、抗氧化剂为基础的诱导、神经细胞培养上清液为基础的诱导。Rac1是小G蛋白Rho家族的成员之一,在细胞中以有活性的GTP形式与无活性的GDP形式存在,参与细胞骨架重组、基因转录调控和细胞信号转导等生理过程,影响细胞的极性与形态、粘附与迁移、增殖与分化等细胞事件。研究证实,在神经细胞发育过程中Rac1、Cdc42、RhoA参与了轴突与树突的形成。本实验以BMSCs向神经样细胞分化过程中Rac1蛋白及其活性形式表达变化为研究内容,旨在探讨Rac1与BMSCs向神经样细胞分化过程的关系。方法采用Percoll法分离大鼠骨髓间充质干细胞、通过传代得到纯化的BMSCs,并对细胞进行表型检测及成骨、成脂肪分化能力鉴定。取第5代的骨髓间充质干细胞,分别应用丁羟基茴香醚(BHA)、碱性成纤维生长因子(bFGF)联合诱导剂和全反式维甲酸(RA)、β-巯基乙醇(β-ME)联合诱导剂诱导细胞。对诱导细胞进行形态观察和免疫荧光染色检测神经细胞标志物。综合比较两种诱导方法的效果,从中选择最适合的一种作为研究Rac1与BMSCs向神经样细胞过程关系的实验方法。根据BMSCs向神经样细胞分化过程的特点,设立A-J十个实验检测点:细胞接种后24 h达到50%汇合为A点,接种后换成含bFGF的预诱导液培养24 h为B点,预诱导后换成含BHA的诱导剂诱导5 h为C点,诱导后用含N2的神经细胞维持培养基培养18 h为D点、维持培养长达48 h为E点,预诱导24 h后换回BMSCs常规培养基返回培养24 h为F点,诱导5 h后换回BMSCs常规培养基返回培养18 h为G点、返回培养后再次预诱导24 h为H点、再次诱导5 h为I点,用神经细胞维持培养基维持培养18 h后换回BMSCs常规培养基培养24 h为J点。采用免疫荧光染色检测相关细胞表型在实验过程中的表达情况,免疫印迹(Western blot)结合免疫沉降(Pull-down)的方法测定各实验检测点Rac1、Cdc42、RhoA蛋白及其活性形式的表达变化情况。结果免疫荧光染色检测显示体外培养的细胞表达间质细胞表面抗原CD29、CD90、CD106、CD71,而不表达造血细胞特异性抗原CD34、CD45,证明了所培养的细胞是BMSCs。组织化学染色显示BMSCs成骨、成脂肪诱导分化的细胞分别呈现碱性磷酸酶染色阳性和油红O染色阳性,进一步鉴定了用于实验的细胞是具有多向分化潜能的BMSCs。对BMSCs向神经样细胞分化过程中神经细胞标志物的免疫荧光染色检测结果显示,BHA、bFGF联合诱导剂和RA、β-ME联合诱导剂均能诱导BMSCs分化为表达神经细胞标志物nestin、β-tubulin和成熟神经元标志物NSE的神经样细胞,而两种方法分化的细胞均不表达星形胶质细胞标志物GFAP,BHA、bFGF联合诱导组和RA、β-ME联合诱导组诱导的细胞表达成熟神经元NSE的阳性率分别为80.05%和71.61%,两者相比无统计学差异。采用BHA、bFGF联合诱导剂诱导BMSCs向神经样细胞分化过程中,诱导5 h后细胞的Rac1蛋白表达水平与诱导前相比显着降低,诱导后用神经细胞维持培养基培养18 h、维持培养48 h与诱导前相比也显着下降。诱导5 h的细胞用BMSCs常规培养基培养后,细胞返回BMSCs的形态,且Rac1蛋白表达水平比诱导后的细胞显着上升,对该返回BMSCs形态的细胞再次诱导,Rac1蛋白表达水平仍然表现出诱导后比诱导前显着下降的情况。然而,我们对诱导后的细胞用神经细胞维持培养基培养18 h后再换回BMSCs常规培养基培养,细胞不能返回BMSCs的形态,且Rac1蛋白表达仍然维持在一个较低的水平。BMSCs向神经样细胞分化过程中,Cdc42、RhoA的蛋白表达变化趋势与Rac1一致。蛋白活性检测显示Rac1-GTP活性蛋白表达在BMSCs向神经样细胞分化过程中上升,Cdc42-GTP活性蛋白与Rac1-GTP变化一致,而RhoA-GTP则下降。免疫印迹实验结果显示,Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表达水平在BMSCs向神经样细胞分化过程中显着降低;Rac1、Cdc42活性蛋白含量上升,而RhoA活性蛋白含量下降。结论骨髓间充质干细胞可在体外分离培养并稳定扩增传代至30代而未发生老化。BMSCs能够定向分化成骨、脂肪细胞及具有神经细胞表型的神经样细胞。Rac1及其相关蛋白Cdc42、RhoA的蛋白表达及活性与BMSCs向神经样细胞分化过程相关,为调控BMSCs定向分化为神经系统组成细胞提供了一定的实验依据。
李宁, 李应福, 谢兴文, 宋敏, 徐世红[3]2016年在《中药诱导骨髓间充质干细胞的定向分化:研究与进展》文中提出背景:近年来,对传统单味中药或提取物、复方中药及含药血清调控骨髓间充质干细胞定向分化为肌成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、神经细胞等研究的不断深入,使中药或其提取物对骨髓间充质干细胞增殖、调控定向分化和移植等方面成为组织工程研究领域的一大亮点。目的:综述中药或其提取物诱导骨髓间充质干细胞定向分化的最新研究进展。方法:分别以"中药,定向分化,骨髓间充质干细胞","Chinese herb,directional differentiation,mesenchymal stem cells"为检索词,由第一作者检索2010年1月至2016年1月中国期刊全文数据库、Pub Med数据库及万方数据库相关文章。排除缺乏原创性及重复性研究的文献,计算机初检到99篇文献,最终保留43篇进行归纳总结。结果与结论:骨髓间充质干细胞作为骨分化系统中最强的种子细胞,具有广泛的定向分化潜能,与传统中草药结合在临床治疗众多难治性疾病中凸显重要价值,尤其对于治疗骨代谢疾病、骨缺损、骨折不愈合及迟缓愈合等疾病更加充分发挥其临床应用价值,这既有利于进一步深层次,多角度研究中药的作用及发生机制,也使骨髓间充质干细胞向更宽、更广领域参与临床各类难治性疾病的治疗。
黄鑫[4]2017年在《化学方法体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞成神经样细胞分化》文中指出骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)来源于骨髓,是一类具有自我复制、多向分化潜能的干细胞,可在体内外经诱导分化成包括肌细胞、脂肪细胞、骨细胞以及神经元样细胞等在内的多种组织细胞。其来源广泛、可操作性强,又不像胚胎干细胞面临伦理学方面的争议,成为组织工程和细胞治疗学方面的理想种子细胞。本研究分别从大鼠骨髓间充质干细胞的复苏、培养和鉴定,向神经样细胞化学诱导分化,以及分化后持续培养过程神经特异标志分子表达等叁个方面进行了研究;同时将密度梯度离心法与流式细胞分选技术相结合,建立了快速分离培养获得高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法。这些工作为骨髓间充质干细胞的进一步研究应用奠定了一定基础。在本研究中,我们首次比较了?-巯基乙醇(?-mercaptoethanol,BME)和丁羟基茴醚(butylated hydroxyanisole,BHA)两种方法化学分别诱导大鼠骨髓间充质干细胞成神经样细胞分化过程中相关标志分子表达差异。将大鼠骨髓间充质干细胞培养至第4、5代,用流式细胞术鉴定MSCs相关标志分子(CD44和CD90)和造血细胞系表面标志分子(CD45和CD11b)表达情况。骨髓间充质干细胞经两种化学方法诱导后,细胞开始出现形态变化:细胞收缩,由梭形变成圆形或椭圆形,并伸出轴突样突起,呈现出以双极为主(含多极)的神经样细胞形态,且表达了神经细胞相关标志分子巢蛋白(Nestin)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE),但表达水平有差异。BHA诱导组相对BME诱导组高表达GFAP和NSE蛋白,而低表达Nestin蛋白,表明BME可能更倾向于诱导BMSCs向神经元前体干细胞分化。骨髓间充质干细胞在诱导分化后,更换成完全培养基继续培养过程中,丁羟茴醚诱导组细胞GFAP基因和?-巯基乙醇诱导组Nestin基因表达量随着培养时间的推移均逐渐下降,细胞也失去神经样细胞形态。这说明化学方法诱导分化的效果可能是可逆、非持续性的。此外,我们在密度梯度离心的方法上,结合流式细胞分选技术,建立了快速分离培养获得高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法。先通过密度梯度离心(Ficoll分离液)从大鼠骨髓中初步分离获得原代骨髓间充质干细胞,接种到细胞培养瓶贴壁培养,至第5天可见明显骨髓间充质干细胞生长群落。第7天传第一代,到细胞长满80-90%,胰酶消化,用荧光标记抗CD271抗体孵育后通过贝克曼公司MoFlo XDP超高速流式细胞分选仪圈门分选出CD271阳性细胞。分选出的阳性细胞继续培养,此时细胞形态、性质均一,纯度较高。综上所述,在本研究中,我们比较了丁羟茴醚和?-巯基乙醇两种经典化学方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的差异,检测了相关神经标志分子的在基因水平和蛋白水平的表达差异;同时探索了将密度梯度离心与流式分选相结合,快速分离培养获得高纯度骨髓间充质干细胞的方法,为间充质干细胞的进一步研究应用打下了基础。
李乔乔, 吴振强, 张丽君[5]2017年在《骨髓间充质干细胞的定向分化潜能》文中研究说明背景:骨髓间充质干细胞因其具有增殖传代能力强、多向分化潜能、不存在伦理问题和排斥反应等特点,是最有前途的组织工程种子细胞。目的:综述各种条件诱导骨髓间充质干细胞定向分化的最新研究进展。方法:由第一作者检索2001年1月至2016年9月中国期刊全文数据库(CNKI)、PubMed数据库及万方数据库相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞、定向分化","BMSCs、Directional differentiation"。检索文献类型为实验研究、综述。检索文献量总计48篇。结果与结论:骨髓间充质干细胞具有多种分化潜能,在体外能被细胞因子、化学药物、中药及其提取物、物理刺激等诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等。在体外建立切实可行的诱导分化处理条件,提高骨髓间充质干细胞定向诱导的效率,是骨髓间充质干细胞最终应用于临床治疗的基础工作。
王杠杠, 宋崴[6]2018年在《SIRT1对间充质干细胞分化的影响》文中提出背景:间充质干细胞可以在体外向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞等多方向分化,且易于分离培养,被广泛应用于干细胞治疗和组织工程研究。SIRT1是一种在哺乳动物体内广泛存在的去乙酰化酶,近年已有研究证实其可以通过调节相关基因来调控间充质干细胞的增殖和分化。目的:从间充质干细胞分化过程中信号通路及其他相关因子作用的角度综述分析SIRT1对间充质干细胞分化的影响。方法:以"SIRT1,mesenchymal stem cells,differentiation"等为关键词在Pub Med、Elsevier数据库中进行检索,排除偏离研究目的和陈旧、重复的文献,对保留的49篇文献进行分析、归纳和总结。结果与结论:间充质干细胞的自我更新和多向分化潜能受Wnt通路、转化生长因子β通路等信号通路的调节;SIRT1可通过调节信号通路中间蛋白及分化相关转录因子的表达、活性和细胞内定位,影响间充质干细胞的自我更新和分化,上调成骨分化、成软骨分化、成肌分化,下调成脂分化。
张飞旭[7]2016年在《TSA和SAHA对阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞向脂肪细胞和神经细胞分化的影响》文中进行了进一步梳理目前,体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer, SCNT)在转基因动物制备、濒危珍稀动物保护等方面发挥着重要作用。然而,该技术中,作为核供体的体细胞具有较高分化程度,使得其不能完全被卵母细胞重编程,进而导致克隆胚胎存在死亡率高、发育率低等问题。研究表明,克隆胚胎表观遗传重编程的异常,是导致核移植技术生产效率低的重要原因。因此,研究人员逐渐倾向于利用分化程度更低的多能性干细胞作为克隆技术的供体细胞。然而,目前家畜胚胎干细胞的体外培养还没有获得成功,因此还无法应用于转基因家畜的制备。因此,问充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为一类成体干细胞,具有较低的分化程度和多向分化的潜能,且易于体外培养,在家畜转基因研究领域越来越受到关注。脂肪组织来源的问充质干细胞以其来源丰富、易于培养以及具有多向分化潜能等优点,在转基因动物生产、细胞治疗及组织工程中具有广泛的应用前景。已有报道显示,脂肪间充质干细胞(Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs)作为供体细胞进行核移植,可以有效提高克隆胚胎的发育率。本研究以阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞(goat Adipose-Derived Stem Cells, gADSCs)为研究对象,探讨曲古菌素A(Trichostatin A, TSA)和伏立诺他(Vorinostat, SAHA)两种组蛋白去乙酰化酶抑制齐(Histone deacetylase inhibitor, HDACi)对其组蛋白乙酰化修饰、多能性及分化的调控机制,为进一步将该细胞应用于高效生产克隆和转基因绒山羊等相关研究提供理论基础。一、TSA和SAHA处理对gADSCs组蛋白H3K9乙酰化作用1、gADSCs生长曲线的绘制根据连续7天细胞计数,绘制生长曲线发现gADSCs的生长符合细胞生长的“S”规律,生长速度较快,生长状态良好。2、TSA和SAHA处理对gADSCs增殖活性的影响分别用500nM TSA和16μM SAHA处理gADSCs 24h、48h和72h,利用MTT法分析对照组、TSA与SAHA处理组的细胞活性,结果发现TSA与SAHA处理24h细胞增殖活性最高,随处理时间延长细胞增殖活性逐渐下降。3、免疫荧光和Western blot检测gADSCs组蛋白H3K9乙酰化水平变化500nM TSA和16μM SAHA分别处理gADSCs 24h。免疫荧光结果显示,细胞中组蛋白H3K9乙酰化荧光信号强度显着高于未处理的对照组。Western blot检测结果显示,组蛋白H3K9乙酰化水平显着升高,且TSA比SAHA的作用效果更加明显(P<0.01)。结果表明,TSA和SAHA处理,能使组蛋白H3K9高度乙酰化。4、Q-PCR和Western blot检测gADSCs中HDACs表达情况Q-PCR检测HDACs转录水平显示,与未处理的对照组细胞相比,500nMTSA和16μM SAHA分别处理gADSCs 24h, HDAC1和HDAC6的转录水平升高；TSA使gADSCs中SIRT1的转录升高,而SAHA却使其转录下降。Western blot检测gADSCs中HDACs表达情况,TSA和SAHA使HDAC1和HDAC6的表达显着提高,SIRT1的表达水平显着下降(P<0.01)。二、TSA和SAHA上调组蛋白H3K9乙酰化水平对gADSCs增殖、凋亡和多能性相关基因表达的影响1、TSA和SAHA处理引起gADSCs细胞周期停滞和凋亡流式细胞仪检测500nM TSA和16μM SAHA分别处理gADSCs 24h的细胞周期分布与凋亡情况,发现TSA和SAHA处理阻断gADSCs细胞周期,使细胞停滞在G0/G1期,并且显着发生早期凋亡。2、Q-PCR检测TSA和SAHA处理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相关基因的转录水平变化Q-PCR检测发现,处理后的细胞中NANOG、OCT4、SOX2多能性基因转录水平显着升高。增殖相关基因TERT转录水平升高,PCNA转录水平降低。而凋亡相关基因P53和BAX的转录均显着降低。3、Western blot检测TSA和SAHA处理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相关基因的蛋白水平变化Western blot检测结果显示,处理后的细胞中NANOG、OCT4多能性基因在蛋白质水平表达量升高,SOX2表达降低。而增殖相关基因TERT和PCNA,凋亡相关基因P53均显着降低,BAX显着升高。叁、TSA和SAHA上调组蛋白H3K9乙酰化水平对gADSCs向脂肪细胞和神经细胞分化的影响1、TSA和SAHA处理对于gADSCs向脂肪细胞诱导分化的影响通过体外脂肪细胞诱导发现,对照组细胞正常分化为脂肪细胞,表明分化体系健全。在脂肪细胞分化过程中,TSA和SAHA处理可以提高脂肪细胞分化相关基因的表达,其中脂肪细胞分化关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体y2(PPARG2)显着升高。通过油红O染色与脂滴定量显示,TSA和SAHA促进脂肪细胞分化。2、TSA和SAHA处理对于gADSCs向神经分化的影响免疫荧光法检测对照组细胞正常分化为神经细胞,表明神经分化体系可靠。在体外神经细胞诱导研究过程中,TSA和SAHA促进神经分化关键基因EN02和NeuN的转录。综上所述,本研究使用TSA和SAHA处理阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞降低了组蛋白去乙酰化酶的活性,促使组蛋白H3K9乙酰化水平显着提高,激活基因的表达并提高细胞的分化潜能。TSA和SAHA处理后的阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞分化能力的提高,为其作为高效的供体细胞制备转基因克隆动物胚胎奠定了基础。
林鹏[8]2007年在《骨髓间充质干细胞的定向与共培养体系诱导》文中认为目的通过骨髓间充质干细胞的定向诱导，探讨其成脂、成神经等多分化潜能。利用共培养体系诱导骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的初步转化，探讨骨髓间充质干细胞在糖尿病治疗领域的价值。方法骨髓间充质干细胞来源于5～10岁儿童胸骨骨髓血(排除造血系统疾病，经得家属同意)。Percoll淋巴细胞分层液分离骨髓间充质干细胞；第3代细胞经CD44抗体、CD45抗体、CD34抗体鉴定；第4代细胞采用含10~(-8)mmol／L地塞米松、10μg／L胰岛素的高糖DMEM(H-DMEM)诱导其向脂肪细胞分化，油红O染色鉴定脂肪细胞。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导其向神经祖细胞分化，经巢蛋白鉴定，继以1％二甲基亚矾(DMSO)的无血清H-DMEM诱导其形成神经网格样结构。胶原酶消化法获取流产胎儿胰腺间充质细胞，用添加bFGF的无血清低糖DMEM(L-DMEM)使其增殖，然后将胰腺间充质细胞接种于底层已接种骨髓间充质干细胞的Transwell内板(insert)，共培养法诱导骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的初步转化。建立骨髓间充质干细胞和神经干细胞共培养体系诱导神经干细胞分化为神经元。结果骨髓间充质干细胞体外经诱导可分化为脂肪细胞及神经细胞。胎儿胰腺间充质细胞中具有巢蛋白、CK-19阳性的胰腺干细胞，体外可分化形成胰岛样细胞团。共培养法可诱导骨髓间充质干细胞分化为PDX-1免疫反应阳性细胞。共培养体系能促进神经干细胞的分化。结论Percoll淋巴细胞分离液分离可获取骨髓间充质干细胞，体外诱导可分化为脂肪细胞、神经细胞。胎儿胰腺微环境能诱导骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的转化。骨髓间充质干细胞分泌的一些物质对神经干细胞的分化具有促进作用。
杨晨[9]2013年在《脐带间充质干细胞的分离鉴定》文中进行了进一步梳理近年来，由于细胞替代治疗为很多疑难疾病带来了希望，相关研究已经成为整个生命科学和医疗领域的研究热点。目前为止，脐带间充质干细胞已经在多方面被证明是自体和异体细胞移植、治疗的理想细胞。和骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞在生物学特征和免疫学特性上与其相似，但在增殖能力，诱导分化能力上，比骨髓间充质干细胞更有潜能。更为重要的是，骨髓间充质干细胞在取材上有极大的限制，年龄、疾病、对供体的伤害都影响了其进一步的应用。而脐带间充质干细胞来源广泛，取材方便，对供体无不利影响，同时，无伦理道德限制的问题。因此，两种细胞相较而言，脐带间充质干细胞具有更为广阔的应用前景。本次实验是通过组织块培养法和酶消化法从胎儿的废弃物脐带中分离得到脐带间充质干细胞，在酶消化法处理脐带华通氏胶过程中，采用了叁种不同的消化方式，分别是单加入Ⅱ型胶原酶、单加入胰酶以及Ⅱ型胶原酶混合胰酶进行消化。通过观察发现，第叁种方式对华通氏胶进行消化的效果最佳，可以在最短的时间内得到最多的细胞。同时在实验中测试最适血清浓度。经实验发现，在原代培养过程中，15%血清浓度最适宜细胞生长。得到细胞后应用流式细胞仪检测来鉴定所获取的细胞，经鉴定细胞表达CD29、CD44、CD73以及CD166，属于典型的脐带间充质干细胞，再通过传代等手段建立起细胞系。在传代过程中随机检测不同代的细胞生长情况，以此来检验实验获取的脐带间充质干细胞能否稳定传代。在获得能稳定传代的脐带间充质干细胞后，取第叁代细胞对其进行诱导分化。由于间充质干细胞为多能性干细胞，可以向叁个胚层分化。故此，本实验对间充质干细胞分别向脂肪细胞、成骨细胞以及神经细胞叁个方向进行诱导分化。当第叁代脐带间充质干细胞生长至占培养皿60%左右时弃掉基础培养液，分别加入成脂诱导液、成骨诱导液和神经细胞诱导液。在成脂诱导过程中，第7天左右细胞有明显变化，出现脂滴，第14天经过油红O染色证实为脂性液体，诱导分化成功；成骨诱导过程中第7天左右细胞开始明显变化，细胞向多角形转变，14天左右出现钙结节，经茜素红染色证实间充质干细胞诱导分化为成骨细胞；向神经细胞诱导过程中，加入诱导液6小时后细胞开始变化，伸出多个突起，随着时间的延长，突起的长度不断增加，形成类似神经样细胞形态。3天后对其进行免疫细胞化学染色显示Nestin表达强阳性，证实向神经细胞方向诱导成功。通过实验证明，脐带间充质干细胞在脐带组织中分布广泛，含量丰富。通过实验建立了相对成熟、稳定的体外分离培养、扩增脐带间充质干细胞的方法，为其最终应用于临床治疗奠定了理论基础。
马琳琳[10]2010年在《视黄酸诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究》文中研究说明骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有取材方便、来源广泛、自体移植无免疫排斥性等优点而成为理想的移植细胞。成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,对临床上治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤修复具有重要意义。本研究探讨体外分离培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞的方法,对视黄酸(Retinoic Acid, RA)抑制骨髓间充质干细胞增殖,促进其向神经细胞分化及作用机制进行初步研究。通过密度梯度离心培养法和完全贴壁培养法,分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,证实通过离体培养,可使体内环境下低丰度的BMSCs实现数目扩增,发现密度梯度离心法有利于BMSCs的纯化。不同浓度RA诱导BMSCs,加入碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)优化诱导条件,对其进行形态学观察,MTT法测定细胞存活率,确定RA最佳诱导浓度。RT-PCR及免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定,证实视黄酸诱导BMSCs分化为神经细胞,细胞表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GAFP)和微管相关蛋白-2(MAP-2),同时发现bFGF可以明显提高BMSCs存活率和保护分化后的神经细胞,但是对于BMSCs的分化率无明显作用。RT-PCR检测RA诱导BMSCs过程中,RA受体RXRa的表达上调,证明RXRa参与RA诱导的BMSCs向神经细胞分化的过程。同时检测到在mRNA水平上转录因子Myocardin和MRTFA的表达升高,证明Myocardin和MRTFA也参与RA诱导的BMSCs向神经细胞分化的过程。利用Myocardin缺失转录激活域的真核表达质粒Myocardin△C,通过竞争性的抑制内源Myocardin的功能,研究Myocardin在RA诱导BMSCs分化为神经细胞中的作用。结果发现,Myocardin功能缺失时,RA诱导效率显着降低,证明RA诱导BMSCs向神经细胞分化过程部分依赖转录因子Myocardin.RT-PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin-El和P21的表达情况。结果显示,在mRNA水平上,细胞周期蛋白cyclin-El的表达下降,P21的表达升高。证明在一定浓度范围内,RA能通过下调细胞周期蛋白Cyclin-El的表达,上调细胞周期抑制蛋白P21的表达,抑制BMSCs的增殖,促进其分化。
参考文献：
[1]. 骨髓间充质干细胞向神经细胞、成骨细胞诱导分化的研究[D]. 段祥. 苏州大学. 2007
[2]. Rac1与骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程关系的研究[D]. 徐路尧. 苏州大学. 2008
[3]. 中药诱导骨髓间充质干细胞的定向分化:研究与进展[J]. 李宁, 李应福, 谢兴文, 宋敏, 徐世红. 中国组织工程研究. 2016
[4]. 化学方法体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞成神经样细胞分化[D]. 黄鑫. 郑州大学. 2017
[5]. 骨髓间充质干细胞的定向分化潜能[J]. 李乔乔, 吴振强, 张丽君. 中国组织工程研究. 2017
[6]. SIRT1对间充质干细胞分化的影响[J]. 王杠杠, 宋崴. 中国组织工程研究. 2018
[7]. TSA和SAHA对阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞向脂肪细胞和神经细胞分化的影响[D]. 张飞旭. 内蒙古大学. 2016
[8]. 骨髓间充质干细胞的定向与共培养体系诱导[D]. 林鹏. 青岛大学. 2007
[9]. 脐带间充质干细胞的分离鉴定[D]. 杨晨. 吉林大学. 2013
[10]. 视黄酸诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究[D]. 马琳琳. 天津科技大学. 2010